基于PCR和巢式PCR技術(shù)的玉米南方銹病早期檢測(cè)

馬紅霞，孫華，郭寧，劉樹(shù)森，張海劍，石潔

基于PCR和巢式PCR技術(shù)的玉米南方銹病早期檢測(cè)

河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000

【目的】建立巢式PCR方法，快速檢測(cè)處于病害潛育期的玉米葉片內(nèi)的多堆柄銹菌（），為玉米南方銹?。╯outhern corn rust）的預(yù)測(cè)和防治提供技術(shù)支持。【方法】根據(jù)多堆柄銹菌ITS區(qū)序列，在其變異區(qū)設(shè)計(jì)3條多堆柄銹菌特異性檢測(cè)引物NX471-F、NX255-F和NX255-R，建立以NX471-F與真菌ITS區(qū)通用引物ITS4為外側(cè)引物，NX255-F/NX255-R為內(nèi)側(cè)引物的巢式PCR。采用20 μL擴(kuò)增體系：Ex Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.15 μL、10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）1.6 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，DNA 1 μL，14.65 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：利用外側(cè)引物NX471-F/ITS4進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增，95℃預(yù)變性7 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物稀釋20倍，取1 μL用作第二步PCR的擴(kuò)增模板，然后以內(nèi)側(cè)引物NX255-F/NX255-R進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增，95℃預(yù)變性7 min；95℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸26 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。同時(shí)選用內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系同巢式PCR，擴(kuò)增程序除循環(huán)數(shù)為38，其余程序同巢式PCR的第二步PCR檢測(cè)。在此條件下對(duì)多堆柄銹菌、高粱柄銹菌（）、青楊葉銹病菌（）和7種玉米常見(jiàn)病原菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，對(duì)不同梯度多堆柄銹菌基因組DNA和3種人工接種病葉進(jìn)行靈敏度檢測(cè)?！窘Y(jié)果】巢式PCR檢測(cè)體系僅在檢測(cè)多堆柄銹菌時(shí)，產(chǎn)生了255 bp的目的條帶，其他菌株均未擴(kuò)增出目的條帶。巢式PCR檢測(cè)體系對(duì)多堆柄銹基因組DNA的最低檢測(cè)限為10 fg·μL-1，是常規(guī)PCR檢測(cè)體系靈敏度的500倍。當(dāng)1 g人工接種病葉含500—2.5×104個(gè)多堆柄銹菌夏孢子時(shí)，常規(guī)PCR和巢式PCR檢出陽(yáng)性率分別0和85.71%，巢式PCR可檢測(cè)出的夏孢子個(gè)數(shù)最少為1 000個(gè)；當(dāng)1 g人工接種病葉中含1—7個(gè)夏孢子堆時(shí)，常規(guī)PCR和巢式PCR檢出陽(yáng)性率分別76.19%和100%，常規(guī)PCR可檢測(cè)出的夏孢子堆個(gè)數(shù)最少為2個(gè)，巢式PCR可檢測(cè)出1個(gè)及以上夏孢子堆；當(dāng)1 g人工接種病葉中含1—7個(gè)侵染點(diǎn)時(shí)，常規(guī)PCR和巢式PCR檢出陽(yáng)性率分別14.29%和66.67%，檢測(cè)出的侵染點(diǎn)個(gè)數(shù)最少分別為6個(gè)和3個(gè)。【結(jié)論】成功建立了一種以NX471-F/ITS4為外側(cè)引物，NX255-F/NX255-R為內(nèi)側(cè)引物的巢式PCR檢測(cè)方法，可快速、高效、準(zhǔn)確檢測(cè)玉米葉片中潛伏期的多堆柄銹菌。

玉米南方銹??；多堆柄銹菌；常規(guī)PCR；巢式PCR

0 引言

【研究意義】玉米南方銹?。╯outhern corn rust）是由多堆柄銹菌（）引起的世界性病害。該病害主要危害葉片，也侵染莖稈、苞葉和雄穗。當(dāng)多堆柄銹菌侵染葉片后，破壞其綠色組織，導(dǎo)致葉片干枯，植株早衰，籽粒灌漿不足，產(chǎn)量下降[1]。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，該病害在我國(guó)東部沿海和黃淮海玉米種植區(qū)時(shí)常暴發(fā)，對(duì)玉米生產(chǎn)的威脅明顯增大，已上升為主要病害[2-3]。2015年玉米南方銹病全國(guó)發(fā)生面積為523.9萬(wàn)公頃，玉米產(chǎn)量損失75.6萬(wàn)噸，分別是2008—2014年平均值的4.1—8.8倍[4]。2021年受臺(tái)風(fēng)“煙花”影響，黃淮海夏玉米區(qū)暴發(fā)南方銹病，是近5年最重的一年，如山東玉米南方銹病發(fā)生面積為168萬(wàn)公頃，其發(fā)生面積高于2015年[5]。多堆柄銹菌侵染植株后，在植物組織內(nèi)擴(kuò)展，當(dāng)條件適宜時(shí)才產(chǎn)生夏孢子并突破表皮顯出癥狀，病害潛育過(guò)程一般在8—13 d[6]，甚至長(zhǎng)達(dá)30 d以上。若顯癥后采取防治措施，不能很好地控制病情發(fā)展，因此建立快速、準(zhǔn)確檢測(cè)潛伏期多堆柄銹菌的方法，有助于該病害的預(yù)測(cè)與防治?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)外對(duì)玉米南方銹病的研究主要集中在抗性遺傳分析[7-12]、發(fā)生規(guī)律[6]、初侵染來(lái)源[13-14]和防治，對(duì)玉米南方銹病病菌檢測(cè)報(bào)道較少。對(duì)該病菌的檢測(cè)方法傳統(tǒng)上依靠顯微觀察夏孢子的形態(tài)和大小判斷，但有時(shí)多堆柄銹菌夏孢子和高粱柄銹菌（）夏孢子形狀、顏色相近，容易誤判；另外，普通顯微觀察在病原菌侵入早期很難觀測(cè)到組織內(nèi)的多堆柄銹菌。因此，分子檢測(cè)方法陸續(xù)研發(fā)報(bào)道。目前常用方法以常規(guī)PCR[15-16]和熒光定量PCR[17-18]為主。如邢國(guó)珍等[15]以多堆柄銹菌ITS-rDNA為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)特異性引物，利用常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，可與高粱柄銹菌或其他玉米常見(jiàn)真菌病原區(qū)分開(kāi)，其最低檢測(cè)濃度為100 pg·μL-1；于凱[16]利用常規(guī)PCR技術(shù)，采用設(shè)計(jì)的多堆柄銹菌特異性引物可以檢測(cè)到10 pg·μL-1的多堆柄銹菌基因組DNA；Crouch等[17]建立的TanMan探針?lè)z測(cè)多堆柄銹菌，靈敏度最低為50 pg·μL-1；張克瑜等[18]利用多堆柄銹菌特異性引物和TaqMan探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，其靈敏度達(dá)到1 pg·μL-1，較常規(guī)PCR提高了10倍。巢式PCR法利用兩對(duì)PCR引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物再用內(nèi)引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，具有更高的靈敏度和特異性[19-22]，如湯春蕾[19]利用巢式PCR檢測(cè)小麥條銹菌（），其靈敏度達(dá)1 fg·μL-1，較常規(guī)PCR提高了1 000倍?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在多堆柄銹菌侵染田間玉米早期，越早檢測(cè)出結(jié)果，留給預(yù)測(cè)和防治的空間越大，但越早葉片中的病菌所占比例也越低，要求的檢測(cè)靈敏度越高。常規(guī)PCR靈敏度低，TaqMan探針?lè)╭PCR成本高，對(duì)設(shè)備技術(shù)要求較高，需要專業(yè)人士進(jìn)行，而巢式PCR靈敏度高，方法簡(jiǎn)單，成本低，在低模板量樣本檢測(cè)中更具有應(yīng)用價(jià)值。但該技術(shù)在南方銹病上的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以不同濃度的多堆柄銹菌基因組DNA，攜帶不同個(gè)數(shù)的夏孢子、夏孢子堆和侵染點(diǎn)的人工接種病葉為研究對(duì)象，根據(jù)多堆柄銹菌ITS區(qū)序列的變異區(qū)，設(shè)計(jì)多堆柄銹菌特異性檢測(cè)引物，建立一種高效、靈敏、準(zhǔn)確的巢式PCR檢測(cè)方法，以期為我國(guó)玉米南方銹病的預(yù)測(cè)與防治工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2022年6—11月在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 材料

健康玉米葉片：溫室培養(yǎng)的未接菌的鄭單958 4—5葉期的葉片；發(fā)病玉米葉片：人工接種發(fā)病的攜帶多堆柄銹菌夏孢子堆的鄭單958葉片。

人工接種病葉制備：（1）采集新鮮的多堆柄銹菌夏孢子，加入一定量的無(wú)菌水，孢子濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL，取不同量的孢子懸浮液分別加入到1 g健康葉片中，使1 g健康葉片中夏孢子個(gè)數(shù)分別為a1：500、a2：1×103、a3：1.5×103、a4：2×103、a5：5×103、a6：1×104、a7：2.5×104；（2）取人工接種葉片，用消毒后的剪刀沿褪綠圈將葉片上即將裂開(kāi)的多堆柄銹菌夏孢子堆剪下，取不同個(gè)數(shù)的夏孢子堆分別與1 g健康葉片混合，使1 g健康葉片中夏孢子堆個(gè)數(shù)分別為b1：1、b2：2、b3：3、b4：4、b5：5、b6：6、b7：7；（3）取人工接種葉片，用消毒后的剪刀沿褪綠圈將葉片上夏孢子侵染點(diǎn)剪下，取不同個(gè)數(shù)的侵染點(diǎn)分別與1 g健康葉片混合，使1 g健康葉片中夏孢子侵染點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為c1：1、c2：2、c3：3、c4：4、c5：5、c6：6、c7：7。

供試真菌：多堆柄銹菌、高粱柄銹菌、青楊葉銹病菌（）、禾谷鐮孢（）、厚垣鐮孢（）、擬輪枝鐮孢（）、變紅鐮孢（）、玉米生平臍蠕孢菌（）、嘴突臍孢（）、細(xì)極鏈格孢（），均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

引物：在NCBI下載多堆柄銹菌ITS區(qū)序列，根據(jù)其變異區(qū)在Primer-BLAST上設(shè)計(jì)3條多堆柄銹菌特異性檢測(cè)引物NX471-F、NX255-F和NX255-R，其中NX471-F：5′-ATCTCTTGGCTCTCACATC-3′與真菌ITS區(qū)通用引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′組成外側(cè)引物；NX255-F：5′-GAACGCACCTTGC ACCTTT-3′和NX255-R：5′-AAGCTCCAAGAACTTCC TCCTC-3′組成內(nèi)側(cè)引物，預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小為255 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 供試真菌的基因組DNA提取方法采用艾德萊真菌基因組提取試劑盒；健康葉片、發(fā)病葉片和人工接種病葉的基因組DNA提取方法采用艾德萊改良CTAB法植物基因組DNA提取試劑盒，提取的DNA于-20℃保存待用。

1.2.2 常規(guī)PCR和巢式PCR方法的建立 常規(guī)PCR檢測(cè)體系：以特異性內(nèi)側(cè)引物NX255-F/NX255-R進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)。20 μL PCR擴(kuò)增體系：Ex Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.15 μL、10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）1.6 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，DNA 1 μL，14.65 μL ddH2O；PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性7 min；95℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸26 s，38個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。

巢式PCR檢測(cè)體系：以外側(cè)引物NX471-F/ITS4進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系同常規(guī)PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性7 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸7 min。第一步PCR擴(kuò)增完成后將PCR產(chǎn)物稀釋20倍，取1 μL用作第二步PCR的擴(kuò)增模板，然后以內(nèi)側(cè)引物NX255-F/NX255-R進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系同常規(guī)PCR檢測(cè)體系，擴(kuò)增程序除了循環(huán)數(shù)改為30個(gè)外，其余程序同常規(guī)檢測(cè)。

取上述兩種PCR產(chǎn)物各5 μL分別于2%瓊脂糖凝膠中電泳1 h（5 V·cm-1），隨后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.2.3 序列測(cè)定與分析 將常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和巢式PCR的第一步及第二步擴(kuò)增產(chǎn)物各選取3個(gè)送交生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用DNAStar軟件結(jié)合測(cè)序峰值圖對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工校正，將校正結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTn比對(duì)。

1.2.4 引物特異性檢測(cè) 利用外/內(nèi)側(cè)引物對(duì)10種真菌（多堆柄銹菌、高粱柄銹菌、青楊葉銹病、禾谷鐮孢、厚垣鐮胞、擬輪枝鐮孢、變紅鐮孢、玉米生平臍蠕孢菌、嘴突臍孢、細(xì)極鏈格孢）基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以ddH2O為陰性對(duì)照。PCR體系和程序同巢式PCR檢測(cè)體系。

1.2.5 引物靈敏度檢測(cè) 將多堆柄銹菌基因組DNA濃度調(diào)整為10 ng·μL-1，按梯度稀釋成不同濃度，a：1×106、5×105、1×105、5×104、1×104、5×103、1×103、500、100、50、10、5 fg·μL-1；b：107、106、105、104、103、100、10、1、10-1、10-2fg·μL-1，備用。取1 μL多堆柄銹菌基因組DNA（a）為模板，以NX255-F/NX255-R為引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，PCR體系和程序同常規(guī)PCR檢測(cè)體系；同樣取1 μL不同濃度的多堆柄銹菌基因組DNA（b）為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系和程序同巢式PCR檢測(cè)體系；兩種PCR檢測(cè)體系均以ddH2O為空白對(duì)照。

1.2.6 人工接種病葉的檢測(cè) 提取人工接種病葉（1）：a1—a7的基因組DNA，2次重復(fù)，各取1 μL為模板分別進(jìn)行常規(guī)PCR和巢式PCR擴(kuò)增，以多堆柄銹菌基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，健康葉片基因組DNA為陰性對(duì)照，以ddH2O為空白對(duì)照。提取人工接種病葉（2）：b1—b7和（3）：c1—c7的基因組DNA，3次重復(fù)，各取1 μL為模板分別進(jìn)行常規(guī)PCR和巢式PCR擴(kuò)增，以多堆柄銹菌基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，健康葉片基因組DNA為陰性對(duì)照，以ddH2O為空白對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 ITS序列比對(duì)分析

經(jīng)DNAMAN8軟件分析比較，設(shè)計(jì)的3條引物序列均與其他菌株在部分位點(diǎn)上不同，表明這3條引物的特異性較高（圖1）。

“-”：與多堆柄銹菌堿基序列相同the same base sequences with P. polysora；小寫(xiě)字母lowercase：與多堆柄銹菌堿基序列不同the different base sequences with P. polysora；“.”：堿基缺失the missing base；紅色字體red font：設(shè)計(jì)的引物位置The position of the designed primers

2.2 序列測(cè)定

將人工校對(duì)后的常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及巢式PCR的第一步和第二步擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTn比對(duì)，結(jié)果顯示，第一步巢式PCR的測(cè)序結(jié)果與多堆柄銹菌菌株A7-2（HQ154022.1）和ZMD-1（HQ154037.1）相似度分別為99.55%和99.33%；常規(guī)PCR和第二步巢式PCR的測(cè)序結(jié)果一致，是第一步測(cè)序結(jié)果的一部分，與A7-2（HQ154022.1）和DAOM 181751（MT932576.1）相似度均為100%。

2.3 引物特異性檢測(cè)

利用外/內(nèi)側(cè)引物對(duì)10種真菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖2所示，只有以多堆柄銹菌基因組DNA為模板的真菌有目的條帶，約為255 bp，其他真菌均無(wú)目的條帶。說(shuō)明該對(duì)引物可以用于南方銹病病原菌的檢測(cè)。

2.4 引物靈敏度檢測(cè)

以多堆柄銹菌基因組DNA為模板，常規(guī)PCR和巢式PCR的最低檢測(cè)限分別為5×103和10 fg·μL-1（圖3），巢式PCR是常規(guī)PCR檢測(cè)體系靈敏度的500倍。

2.5 人工接種病葉的檢測(cè)

以人工接種病葉（1）基因組DNA為模板，常規(guī)PCR和巢式PCR檢出陽(yáng)性率分別0和85.71%，巢式PCR可檢測(cè)出1 g玉米葉片中的多堆柄銹菌夏孢子個(gè)數(shù)最少為103個(gè)（圖4-A、4-B）。以人工接種病葉（2）基因組DNA為模板，常規(guī)PCR和巢式PCR檢出陽(yáng)性率分別76.19%和100%，常規(guī)PCR可檢測(cè)出1 g玉米葉片中的夏孢子堆個(gè)數(shù)最少為2個(gè)，巢式PCR可檢測(cè)出1個(gè)及以上夏孢子堆（圖4-C、4-D）。以人工接種病葉（3）基因組DNA為模板，常規(guī)PCR和巢式PCR檢出陽(yáng)性率分別14.29%和66.67%，常規(guī)PCR和巢式PCR可檢測(cè)出1 g玉米葉片中的侵染點(diǎn)個(gè)數(shù)最少分別為6個(gè)和3個(gè)（圖4-E、4-F）。陰性對(duì)照健康玉米葉片（J）和空白對(duì)照（ddH2O）均未擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明擴(kuò)增體系未污染。

M：100 bp Ladder DNA Marker；1：多堆柄銹菌P. polysora；2：高粱柄銹菌P. sorghi；3：青楊葉銹病菌M. laricipopulina；4：禾谷鐮孢F. graminearum；5：厚垣鐮孢F. chlamydosporum；6：擬輪枝鐮孢F. verticillioides；7：變紅鐮孢F. incarnatum；8：玉米生平臍蠕孢菌B. zeicola；9：嘴突臍孢E. rostratum；10：細(xì)極鏈格孢A. tenuissima；CK：ddH2O

A：常規(guī)PCR Conventional PCR；B：巢式PCR Nested PCR；M1：DL2000 marker；M：100 bp Ladder DNA Marker。A中1—12：1×106、5×105、1×105、5×104、1×104、5×103、1×103、500、100、50、10、5 fg·μL-1多堆柄銹菌基因組DNA 1×106, 5×105, 1×105, 5×104, 1×104, 5×103, 1×103, 500, 100, 50, 10, 5 fg·μL-1P. polysora genome DNA；B中1—10：107、106、105、104、103、102、10、1、10-1、10-2 fg·μL-1多堆柄銹菌基因組DNA 107, 106, 105, 104, 103, 102, 10, 1, 10-1, 10-2 fg·μL-1P. polysora genome DNA

3 討論

3.1 特異性引物的選擇

基于PCR原理的分子生物學(xué)技術(shù)是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的快速檢測(cè)技術(shù)，而PCP檢測(cè)技術(shù)成功的首要條件在于特異性引物的篩選。目前開(kāi)發(fā)特異性檢測(cè)病菌的引物序列主要有3種途徑：一是核糖體DNA，常用16S、ITS區(qū)[23]、28S[24]；二是物種特異的持家基因，如RNA聚合酶（[25]、[26]）、延伸因子[27]、肌動(dòng)蛋白、-微管蛋白[28]、鈣調(diào)蛋白等；三是未知基因的特異DNA片段，如基因組特異性片段[29]、各種類型的分子標(biāo)記如SCAR[30]、EST[31]等。rDNA-ITS序列含有可變異區(qū)，受外界環(huán)境影響較小，是植物病菌特異性檢測(cè)的理想標(biāo)記。多堆柄銹菌的ITS序列與同屬菌株的相似性為79.48%—95.58%，表明種間差異明顯，是特異性檢測(cè)引物首選。目前檢測(cè)多堆柄銹菌的特異性引物多集中在該序列[15-18]。特異性引物在Primer-BLAST時(shí)，還需要與病菌寄主的基因組DNA進(jìn)行比較，排除寄主的干擾。將前人篩選的特異性引物與玉米基因組DNA比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有大小不等的目標(biāo)模板，而本研究篩選的內(nèi)側(cè)引物NX255-F/NX255-R在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)目標(biāo)模板，且特異性檢測(cè)顯示可專一性擴(kuò)增多堆柄銹菌基因組DNA，表明引物特異性強(qiáng)，可用于南方銹病病原菌的檢測(cè)。

A、C、E：常規(guī)PCR Conventional PCR；B、D、F：巢式PCR Nested PCR；M1：DL2000 marker；M：100 bp Ladder DNA Marker；CK：ddH2O；NX：多堆柄銹菌基因組DNA P. polysora genome DNA；J：健康玉米葉片基因組DNA Health maize leaf genome DNA。A、B中a1—a7：1 g健康玉米葉片中夏孢子個(gè)數(shù)分別為500、1×103、1.5×103、2×103、5×103、1×104、2.5×104，兩次重復(fù)500, 1×103, 1.5×103, 2×103, 5×103, 1×104, 2.5×104 of P. polysora urediniospores in 1 g of maize leaves, two repeats；C、D中b1—b7：1 g健康玉米葉片中夏孢子堆個(gè)數(shù)分別為1、2、3、4、5、6、7，3次重復(fù)1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 of P. polysora uredia in 1 g of maize leaves, three repeats；E、F中c1—c7：1 g健康玉米葉片中夏孢子侵染點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為1、2、3、4、5、6、7，3次重復(fù)1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 of P. polysora infection sites in 1 g of maize leaves, three repeats

3.2 巢式PCR在病害潛育期檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

常規(guī)PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，靈敏度低；而qPCR靈敏度高，但成本高，這些缺點(diǎn)給實(shí)際檢測(cè)多堆柄銹菌帶來(lái)很大障礙。巢式PCR是基于第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上的二次擴(kuò)增結(jié)果，具有很好的靈敏度，在低模板量樣本檢測(cè)中應(yīng)用非常廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，巢式PCR的檢測(cè)靈敏度一般為10 pg·μL-1—1 fg·μL-1[32-34]，如檢測(cè)大豆疫霉為50 fg·μL-1[32]，黑胡椒根腐病菌腐皮鐮孢為1 fg·μL-1[34]，是常規(guī)PCR的100—1 000倍，是qPCR的10倍[32]。本研究發(fā)現(xiàn)巢式PCR的檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR的500倍，是目前TaqMan探針?lè)ǎ`敏度最低限1 pg·μL-1）的100倍[18]。人工接種病葉的檢測(cè)結(jié)果再次表明巢式PCR的檢測(cè)靈敏度較常規(guī)PCR高。

3.3 同類檢測(cè)方法對(duì)樣本中病原檢出率的比較分析

不同的PCR法對(duì)植物病原菌的檢出陽(yáng)性率不同。如夏菲等[35]檢測(cè)黃櫨枯萎病菌（）時(shí)，常規(guī)PCR檢出陽(yáng)性率為33.33%，巢式PCR檢出陽(yáng)性率為100%。本研究中常規(guī)PCR檢測(cè)1 g玉米葉片中含的多堆柄銹菌夏孢子、夏孢子堆和侵染點(diǎn)檢出陽(yáng)性率分別為0、76.19%和14.29%；巢式PCR檢出陽(yáng)性率分別為85.71%、100%和66.67%。當(dāng)植物體內(nèi)病原菌含量低或分布不均勻時(shí)，巢式PCR也可能漏檢[32]。本研究對(duì)人工接種病葉檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)1 g葉片中多堆柄銹菌含量低于1×104個(gè)時(shí)，不是所有的重復(fù)都能檢出病菌。因此，應(yīng)用PCR法檢測(cè)植物潛育期的病菌時(shí)，每個(gè)樣品需設(shè)立多個(gè)重復(fù)，提高檢出率。

4 結(jié)論

基于rDNA-ITS區(qū)開(kāi)發(fā)了玉米南方銹病病原菌特異的常規(guī)PCR和巢式PCR檢測(cè)技術(shù)。經(jīng)驗(yàn)證，常規(guī)PCR和巢式PCR的最低檢測(cè)限分別為5×103和10 fg·μL-1，可分別用于顯癥玉米葉片的檢測(cè)和潛育期多堆柄銹菌的檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高。

[1] 王曉鳴, 石潔, 晉齊鳴, 李曉, 孫世賢. 玉米病蟲(chóng)害田間手冊(cè)——病蟲(chóng)害鑒別與抗性鑒定. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2010: 27.

WANG X M, SHI J, JIN Q M, LI X, SUN S X. Field manual of maize pests and diseases—identification and evaluation on the resistance to insect pest and disease. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 2010: 27. (in Chinese)

[2] 隋鵬飛, 王琰, 張茹琴, 夏淑春, 王志奎, 鄢洪海.山東省玉米南方銹病菌遺傳多樣性及初侵染來(lái)源分析//彭友良, 李向東.中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2017年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2017.

SUI P F, WANG Y, ZHANG R Q, XIA S C, WANG Z K, YAN H H. Genetic diversity and analysis of initial infection sources ofcausing southern rust of maize in Shandong Province//PENG Y L, LI X D. Proceedings of the 2017 annual meeting of Chinese society for plant pathology. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 2017. (in Chinese)

[3] 郭云燕, 陳茂功, 孫素麗, 武小菲, 江凱, 朱振東, 李洪杰, 何月秋, 王曉鳴. 中國(guó)玉米南方銹病病原菌遺傳多樣性. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(21): 4523-4533. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752. 2013.21.015.

Guo Y Y, Chen M G, Sun S L, WU X F, JIANG K, ZHU Z D, LI H J, HE Y Q, WANG X M. Genetic diversity ofUnderw. in China. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(21): 4523-4533. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.21.015. (in Chinese)

[4] 劉杰, 姜玉英, 曾娟, 紀(jì)國(guó)強(qiáng), 劉莉, 邱坤, 徐永偉. 2015年我國(guó)玉米南方銹病重發(fā)特點(diǎn)和原因分析. 中國(guó)植保導(dǎo)刊, 2016, 36(5): 44-47.

Liu J, Jiang Y Y, Zeng J, JI G Q, LIU L, QIU K, XU Y W. Analysis of characters and factors on outbreak of southern corn rust in China in 2015. China Plant Protection, 2016, 36(5): 44-47. (in Chinese)

[5] 楊久濤, 張輝, 張繼波, 邢曉飛, 韓偉, 國(guó)棟. 2021年山東省玉米南方銹病暴發(fā)流行原因分析與防控對(duì)策. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究, 2022, 12(6): 5-6, 9.

YANG J T, ZHANG H, ZHANG J B, XING X F, HAN W, GUO D. Outbreak of southern maize rust in Shandong Province in 2021 cause analysis and prevention and control countermeasures. Journal of Agricultural Catastrophology, 2022, 12(6): 5-6, 9. (in Chinese)

[6] 胡務(wù)義, 鄭明祥, 阮義理, 潘飛云, 余北疆, 余英鳳, 何萬(wàn)娥. 玉米南方型銹病發(fā)生規(guī)律與防治技術(shù)初步研究. 中國(guó)植保導(dǎo)刊, 2003, 23(12): 9-12.

HU W Y, ZHENG M X, RUAN Y L, PAN F Y, YU B J, YU Y F, HE W E. Preliminary studies on the incidences rules ofand its control technique. China Plant Protection, 2003, 23(12): 9-12. (in Chinese)

[7] 譚華, 鄒成林, 鄭德波, 韋新興, 黃愛(ài)花, 蔣維萍, 韋慧, 黃開(kāi)健. 分子標(biāo)記輔助選擇抗南方玉米銹病材料. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 43(7): 6-10.

TAN H, ZOU C L, ZHENG D B, WEI X X, HUANG A H, JIANG W P, WEI H, HUANG K J. Selection of materials with resistance to southern corn rust (SCR) by marker-assistant selection (MAS) in maize (L.). Guangdong Agricultural Sciences, 2016, 43(7): 6-10. (in Chinese)

[8] ZHANG Y, XU L, ZHANG D F, DAI J R, WANG S C. Mapping of southern corn rust-resistant genes in the W2D inbred line of maize (L.). Molecular Breeding, 2010, 25(3): 433-439.

[9] 蔣雅娟, 賀巖, 張登峰, 徐麗, 蘇勝寶, 戴景瑞, 王守才. 玉米抗南方型銹病基因共分離分子標(biāo)記的研究. 作物學(xué)報(bào), 2007, 33(5): 849-852.

JIANG Y J, HE Y, ZHANG D F, XU L, SU S B, DAI J R, WANG S C. Co-segregation molecular marker for southern corn rust resistance trait. Acta Agronomica Sinica, 2007, 33(5): 849-852. (in Chinese)

[10] ZHOU C J, CHEN C X, CAO P X, WU S W, SUN J W, JIN D M, WANG B. Characterization and fine mapping of, a resistance gene to southern corn rust in maize. Molecular Genetics and Genomics, 2007, 278(6): 723-728.

[11] 陳翠霞, 邢全華, 梁春陽(yáng), 于元杰, 梁鳳山, 王洪剛, 王振林, 王斌. 南方玉米銹病抗病基因的定位及不同遺傳背景對(duì)基因標(biāo)記的比較分析. 遺傳學(xué)報(bào), 2003, 30(4): 341-344.

CHEN C X, XING Q H, LIANG C Y, YU Y J, LIANG F S, WANG H G, WANG Z L, WANG B. Genetic mapping of resistant gene to southern corn rust and the tagging analysis on different genetic background. Acta Genetica Sinica, 2003, 30(4): 341-344. (in Chinese)

[12] ZHAO P F, ZHANG G B, WU X J, LI N, SHI D Y, ZHANG D F, JI C F, XU M L, WANG S C. Fine mapping of, a southern rust resistance gene in maize. Journal of Integrative Plant Biology, 2013, 55(5): 462-472.

[13] 鄢洪海, 王琰, 張茹琴, 夏淑春, 王志奎, 宋希云. 基于ISSR-PCR對(duì)山東玉米多堆柄銹菌遺傳多樣性的研究及其初侵染菌源的推測(cè). 菌物學(xué)報(bào), 2018, 37(2): 157-165.

YAN H H, WANG Y, ZHANG R Q, XIA S C, WANG Z K, SONG X Y. Genetic diversity and deduction of primary infection source ofin Shandong Province based on ISSR-PCR. Mycosystema, 2018, 37(2): 157-165. (in Chinese)

[14] 王曉鳴, 劉駿, 郭云燕, 段燦星, 朱振東, 孫素麗, 楊知還. 中國(guó)玉米南方銹病初侵染源的多源性. 玉米科學(xué), 2020, 28(3): 1-14, 30.

WANG X M, LIU J, GUO Y Y, DUAN C X, ZHU Z D, SUN S L, YANG Z H. Multiorigins of initial infection sources ofcausing southern rust of maize in China. Journal of Maize Sciences, 2020, 28(3): 1-14, 30. (in Chinese)

[15] 邢國(guó)珍, 魏馨, 李晶晶, 李闖, 劉娜, 蔣士君, 李春奇, 鄭文明. 玉米南方銹病和普通銹病分子檢測(cè)技術(shù)研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 22(3): 6-11.

XING G Z, WEI X, LI J J, LI C, LIU N, JIANG S J, LI C Q, ZHENG W M. Molecular detection ofUnderw. andSchw. Journal of China Agricultural University, 2017, 22(3): 6-11. (in Chinese)

[16] 于凱. 玉米南方銹病的分子檢測(cè)與玉米抗病性機(jī)制的研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2010.

YU K. Molecule detection ofand resistance mechanism to southern corn rust in maize[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2010. (in Chinese)

[17] CROUCH J A, SZABO L J. Real-time PCR detection and discrimination of the southern and common corn rust pathogensand. Plant Disease, 2011, 95(6): 624-632.

[18] 張克瑜, 李磊福, 谷醫(yī)林, 孫秋玉, 馬占鴻. 多堆柄銹菌潛育期侵染量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2022, 49(3): 832-839.

ZHANG K Y, LI L F, GU Y L, SUN Q Y, MA Z H. Establishment of quantitative real-time PCR detection system for latent infection of southern corn rust pathogen. Journal of Plant Protection, 2022, 49(3): 832-839. (in Chinese)

[19] 湯春蕾. 小麥葉片上潛伏期條銹菌的巢式PCR檢測(cè)及小麥與條銹菌互作中相關(guān)激酶類基因的表達(dá)譜分析[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2008.

TANG C L. Detection ofin latent infected wheat leaves by nested PCR and expression profiles analysis of protein kinase during interaction between wheat and stripe rust[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2008. (in Chinese)

[20] 傅華英, 葛丹鳳, 李曉燕, 吳小斌, 陳如凱, 高三基. 甘蔗赤條病菌巢式PCR檢測(cè). 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2017, 44(2): 276-282.

FU H Y, GE D F, LI X Y, WU X B, CHEN R K, GAO S J. Nested-PCR detection ofsubsp., the pathogen of red stripe on sugarcane. Journal of Plant Protection, 2017, 44(2): 276-282. (in Chinese)

[21] 王楠, 李志勇, 董立, 白輝, 朱彥彬, 全建章, 董志平. 谷子銹菌巢式PCR檢測(cè)體系的建立. 植物病理學(xué)報(bào), 2015, 45(4): 438-442.

WANG N, LI Z Y, DONG L, BAI H, ZHU Y B, QUAN J Z, DONG Z P. Establishment of a nested PCR detection system of. Acta Phytopathologica Sinica, 2015, 45(4): 438-442. (in Chinese)

[22] 吳偉懷, 劉寶慧, 鹿鵬鵬, 梁艷瓊, 賀春萍, 李銳, 易克賢. 甘蔗褐銹病菌單管巢式PCR檢測(cè)體系的建立. 中國(guó)糖料, 2022, 44(3): 1-7.

WU W H, LIU B H, LU P P, LIANG Y Q, HE C P, LI R, YI K X. Establishment of single tube nested PCR detection system for. Sugar Crops of China, 2022, 44(3): 1-7. (in Chinese)

[23] WILSON A, SIMPSON D, CHANDLER E, JENNINGS P, NICHOLSON P. Development of PCR assays for the detection and differentiation ofand. FEMS Microbiology Letters, 2004, 233(1): 69-76.

[24] 徐鑫, 邊勇, 陳哲, 孫悅, 劉子璐, 胡渤洋, 武揚(yáng), 張國(guó)慶. 基于DNA條形碼的桑黃真菌分子鑒定. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2019, 34(1): 20-27.

XU X, BIAN Y, CHEN Z, SUN Y, LIU Z L, HU B Y, WU Y, ZHANG G Q. Molecular identification of ‘Sang Huang’ by DNA barcoding. Journal of Beijing University of Agriculture, 2019, 34(1): 20-27. (in Chinese)

[25] 田擎. 平頭炭疽菌、黑白輪枝菌、大麗輪枝菌及大豆根部病原菌的LAMP檢測(cè)[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

TIAN Q. Lamp detection of,and soybean root pathogens[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[26] 程云方. 基于真菌基因組同源性分析的曲霉屬特異性分子標(biāo)記篩選[D].荊州: 長(zhǎng)江大學(xué), 2012.

CHENG Y F. Screening ofspecific molecular markers based on homology analysis of fungal genomes[D]. Jingzhou: Yangtze University, 2012. (in Chinese)

[27] 劉國(guó)霞, 譚晴晴, 齊軍山, 王福玉, 陳雪燕, 范陽(yáng)陽(yáng), 胡悅, 步迅, 張全芳. 基于序列位點(diǎn)特異性PCR快速鑒定小麥莖基腐病優(yōu)勢(shì)病原菌假禾谷鐮孢菌. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2021, 29(5): 985-994.

LIU G X, TAN Q Q, QI J S, WANG F Y, CHEN X Y, FAN Y Y, HU Y, BU X, ZHANG Q F. Rapid identification of main pathogenof wheat crown rot using site-specific PCR based onsequence. Journal of Agricultural Biotechnology, 2021, 29(5): 985-994. (in Chinese)

[28] XU C N, ZHANG H J, CHI F M, JI Z R, DONG Q L, CAO K Q, ZHOU Z S. Species-specific PCR-based assays for identification and detection of Botryosphaeriaceae species causing stem blight on blueberry in China. Journal of Integrative Agriculture, 2016, 15(3): 573-579.

[29] KANG H X, PENG Y, HUA K Y, DENG Y F, BELLIZZI M, GUPTA D R, MAHMUD N U, URASHIMA A S, PAUL S K, PETERSON G, ZHOU Y L, ZHOU X P, ISLAM M T, WANG G L. Rapid detection of wheat blast pathogenpathotype using genome-specific primers and cas12a-mediated technology. Engineering, 2021, 7(9): 1326-1335.

[30] 周永進(jìn), 馬鴻翔, 余桂紅, 孫曉波, 張旭, 李楊瑞. 禾谷鐮刀菌與亞細(xì)亞鐮刀菌種型特異性的SCAR標(biāo)記. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 28(5): 979-985.

ZHOU Y J, MA H X, YU G H, SUN X B, ZHANG X, LI Y R. Development of species-specific SCAR markers identifyingand. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2012, 28(5): 979-985. (in Chinese)

[31] 康健, 張林, 張夢(mèng)雅, 閆紅飛, 劉大群. 小麥葉銹菌特異分子標(biāo)記建立. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 39(4): 63-67.

KANG J, ZHANG L, ZHANG M Y, YAN H F, LIU D Q. Development of specific molecular markers in. Journal of Agricultural University of Hebei, 2016, 39(4): 63-67. (in Chinese)

[32] 徐靜靜, 藺宇, 董立明, 王曉鳴, 武小菲, 朱振東. 用SSR標(biāo)記和巢式PCR快速檢測(cè)大豆疫霉菌. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(5): 1624-1630. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.05.015.

XU J J, LIN Y, DONG L M, WANG X M, WU X F, ZHU Z D. Rapid detection ofusing SSR marker and nested PCR. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(5): 1624-1630. doi: 10.3864/j. issn.0578-1752.2009.05.015. (in Chinese)

[33] HONG Y, LUO Y, YI J, HE L, DAI L, YI T. Screening nested-PCR primer for ‘Liberibacterasiaticus’ associated with citrus Huanglongbing and application in Hunan, China. PLoS ONE, 2019, 14(2): e0212020.

[34] COSTA S S, MOREIRA G M, PFENNING L H. Development of a PCR protocol for the identification and detection off. sp.from soil and roots of black pepper (). Tropical Plant Pathology, 2017, 42(1): 55-59.

[35] 夏菲, 周江鴻, 車少臣, 仲麗, 趙正楠. 黃櫨枯萎病菌巢式PCR檢測(cè)方法的建立. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2021, 37(3): 47-51.

XIA F, ZHOU J H, CHE S C, ZHONG L, ZHAO Z N. Development of a nested PCR detection method forcausing verticillium wilt of. Acta Agriculturae Shanghai, 2021, 37(3): 47-51. (in Chinese)

Early Molecular Diagnosis of Southern Corn Rust Based on Conventional PCR and Nested PCR Assays

Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/IPM Centre of Hebei Province, Baoding 071000, Hebei

【Objective】The objective of this study is to establish a rapid detection method forduring the incubation period based on the nested PCR, and to provide support for prediction and control of southern corn rust.【Method】The nested PCR primers for the specific detection ofwere designed using the variant region of the ITS sequence, including outer primer NX471-F/ITS4 and inner primer NX255-F/NX255-R. For amplification, the 20 μL PCR reaction mixture contained: Ex Taq DNA polymerase (5 U·μL-1) 0.15 μL, 10×Ex Taq Buffer (Mg2+plus) 2 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1each) 1.6 μL, forward and reverse primers (10 μmol·L-1) 0.3 μL each, template DNA 1 μL, ddH2O 14.65 μL. The PCR program was performed as follows: the outer primer NX471-F/ITS4 was used for the first amplification and denaturation at 95℃ for 7 min, 30 cycles of denaturation at 95℃ for 30 s, annealing at 55℃ for 30 s, extension at 72℃ for 45 s, and a final extension at 72℃ for 7 min. The product was diluted 20 times and used as the template for the second run of the nested PCR, which was amplified with the inner primer NX255-F/NX255-R, and the PCR program was denaturation at 95℃ for 7 min; 30 cycles of 95℃ for 30 s, 66℃ for 30 s, and 72℃ for 26 s; 72℃ for 7 min. At the same time, the inner primer was selected for conventional PCR, in which the reaction mixture was the same as the nested PCR, and the amplification conditions were the same as the second run, except that the number of reaction cycles was 38. Under these conditions, the specificity was detected for,,and seven other common maize pathogens, and the sensitivity of nested PCR was tested using genomic DNA ofand DNA from artificially inoculated leaves.【Result】Nested PCR could specifically detectfrom all tested fungi, with a 255 bp target fragment. The lowest detection limit of the nested PCR was 10 fg·μL-1, and the sensitivity was 500 times that of the conventional PCR. For the samples containing 500-2.5×104urediniospores per gram of artificially inoculated leaves, the detection rates of conventional PCR and nested PCR were 0 and 85.71%, respectively. Nested PCR could detect at least 1 000 urediniospores. For the samples containing 1-7 uredia per gram of artificially inoculated leaves, the detection rates of conventional PCR and nested PCR were 76.19% and 100%, respectively. Conventional PCR and nested PCR could detect at least 2 and 1 uredia, respectively. For the samples containing 1-7 infection sites per gram of artificially inoculated leaves, the detection rates of conventional PCR and nested PCR were 14.29% and 66.67%, respectively. Conventional PCR and nested PCR could detect at least 6 and 3 infection sites, respectively.【Conclusion】With NX471-F/ITS4 as the outer primer and NX255-F/NX255-R as the inner primer, a detection method forwas established based on the nested PCR, which could quickly, efficiently and accurately detect theduring the incubation period in maize leaves.

southern corn rust;; conventional PCR; nested PCR

2022-12-25；

2023-03-03

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-02）、河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（20326501D）

馬紅霞，E-mail：mahongxia0792@163.com。通信作者石潔，E-mail：shij99@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.09.006

（責(zé)任編輯 岳梅）