梅花不同花色品種及開花階段類黃酮代謝物測定與分析

吳思惠，朱歡歡，張俊衛(wèi)，包滿珠，張杰

梅花不同花色品種及開花階段類黃酮代謝物測定與分析

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國重點實驗室，武漢 430070

【目的】花色是梅花（）極其重要的觀賞性狀，類黃酮是梅花花瓣中的主要色素，但目前關(guān)于梅花類黃酮化合物的組成及其與花色關(guān)系的研究較少。研究梅花類黃酮化合物可為梅花花色形成機理以及梅花類黃酮資源開發(fā)提供參考。【方法】本研究選取4個代表花色的梅花品種盛花期及兩個品種花色變化關(guān)鍵時期花瓣作為試驗材料，首先采用RHSCC比色卡比色法和色差儀測定不同品種各時期花瓣的花色表型，用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（highperformanceliquidchromatography-massspectrometry，HPLC-MS）對各品種不同開花時期的類黃酮組成進(jìn)行定性、定量研究，進(jìn)一步通過Duncan檢驗和正交偏最小二乘判別分析不同花色品種間差異代謝物以及開花過程中與花色變化相關(guān)的類黃酮代謝物。【結(jié)果】在梅花花瓣中共鑒定出25種黃酮類化合物。其中，紅色‘白須朱砂’和紫紅色‘虎丘晚粉’的主要成分為花青素類化合物，‘白須朱砂’和‘虎丘晚粉’間矢車菊素及其衍生物含量存在差異。從大蕾期到盛花期，‘白須朱砂’紅色逐漸變淺，矢車菊素-3--葡萄糖苷和芍藥花素-3--葡萄糖苷的含量也逐漸下降。黃綠色‘變綠萼’和純白色‘三輪玉蝶’所含主要類黃酮化合物為槲皮素及其衍生物，‘變綠萼’和‘三輪玉蝶’間槲皮素衍生物含量存在差異?！窘Y(jié)論】不同花色品種梅花的類黃酮化合物含量不同，有醫(yī)藥價值的類黃酮化合物在各品種中均有分布。其中，矢車菊苷和芍藥花苷含量差異可能與紅色梅花花色差異有關(guān)，而槲皮素衍生物可能影響黃綠色梅花花色形成。本研究首次對不同花色梅花品種類黃酮代謝物進(jìn)行了鑒定及差異分析，從代謝層面初步認(rèn)識了不同花色梅花品種以及梅花開花過程中的差異及變化，研究結(jié)果對進(jìn)一步理解梅花花色差異原因及梅花類黃酮資源開發(fā)提供了參考。

梅花；花色；類黃酮化合物；高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

0 引言

【研究意義】梅花（Sieb. et Zucc.）是薔薇科（Rosaceae）李屬（）的觀賞性植物，原產(chǎn)我國南方，距今已有3000多年的栽培歷史[1]?；ㄉ鳛槊坊ǖ闹匾^賞性狀，具有十分重要的觀賞價值和商業(yè)價值[2]。梅花花色主要有白、黃、綠、粉紅、深紅等顏色，且伴隨著梅花品種進(jìn)化而逐漸豐富[3]。類黃酮是梅花花瓣中的主要色素，研究梅花類黃酮化合物可為梅花花色形成機理研究以及梅花類黃酮資源開發(fā)提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在2004年以前，梅花研究多集中于梅花耐寒性引種馴化，而梅花花色相關(guān)研究幾乎空白[4]。之后，趙昶靈等[4]首次報道了典型花色梅花花瓣中的色素種類及含量，其中紅色梅花的紅色色素為矢車菊素、芍藥色素類，而白色梅花的色素則為黃色或者無色的黃酮類及其苷。梅花花色根據(jù)花青素有無分為紅、白兩大類。另外，梅花‘粉皮宮粉’的粉紅色花色色素為花青素-3-糖苷（3-glycoside），梅花‘南京紅’花瓣中的3種主要花色苷為cyanidin 3--(6″--α- rhamnopyranosyl--glucopyranoside)、cyanidin 3-- (6″--galloyl--glucopyranoside)和cyanidin 3--(6″---feruloyl--glucopyranoside）[5]。張芹[6]對41個梅花品種花瓣中的花青素苷進(jìn)行了定性定量分析，但并沒有對其他的類黃酮化合物進(jìn)行研究。鄭毓珍等[7]為探究梅花的抗氧化活性用HPLC法同時測定了白梅花（綠萼梅）中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等成分。但在其他梅花品種中，這些類黃酮化合物目前還沒有深入研究。類黃酮是苯丙素類中的一類次級代謝物，涉及顏色范圍最廣，從淡黃色到藍(lán)色[8]。類黃酮代謝物包括查爾酮、二氫黃酮、黃酮、類黃酮和花青素等[9]。其中，花青素苷是使花朵呈色的重要色素之一，通過誘導(dǎo)植物組織中的紅色到藍(lán)色色素沉淀，幫助植物吸引傳粉者和種子傳播者，同時在提高植物抗逆性方面發(fā)揮著重要作用[10]。黃酮醇是一種淡黃色或無色的化合物，它不僅是花青素的共色素，還能吸收紫外線保護花瓣和吸引授粉昆蟲[8]。此外，類黃酮化合物還有潛在的藥用價值，調(diào)查表明，攝入類黃酮可以降低各種非傳染性疾病的發(fā)病率，部分類黃酮在體內(nèi)外也表現(xiàn)出較強的抗氧化特性，以及抗糖尿病、抗肥胖、抗炎性、抗癌和抗菌活性[11-12]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究揭示了梅的多種生物活性和生物活性機制，包括抗糖尿病[13-14]、抗腫瘤[15]、抗炎[16]和抗生素[17]活性。有研究表明，綠萼梅類黃酮成分具有清除自由基、抑制醛糖還原酶和抗血小板凝集的作用[18]，并且總黃酮能改善大鼠抑郁行為[19-20]。梅花提取物的藥用價值是近年來的研究熱門，但其有效成分及作用機制有待進(jìn)一步研究證實[21-23]。【本研究切入點】目前，梅花花色的研究主要集中在花青素，而作為重要的輔助呈色色素，黃酮和黃酮醇化合物在梅花中還沒有被系統(tǒng)鑒定，梅花類黃酮化合物資源還有待開發(fā)。另外，花青素與黃酮/黃酮醇化合物在梅花呈色過程中如何相互作用也尚未見研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選擇花色不同的4個梅花品種，包括‘白須朱砂’‘虎丘晚粉’‘變綠萼’‘三輪玉蝶’。利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對梅花花瓣中類黃酮化合物的成分及含量進(jìn)行檢測，對梅花花瓣類黃酮化合物資源進(jìn)行探索；另外，以純白色的‘三輪玉蝶’為對照，討論類黃酮成分與不同花色表型的關(guān)系。通過表型觀測確定‘白須朱砂’和‘變綠萼’開花過程中花色變化的主要階段，比較不同開花階段的花色表型差異以及類黃酮物質(zhì)組成差異，并進(jìn)一步分析主要影響梅花花色變化的類黃酮成分。

1 材料與方法

試驗于2020年在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院進(jìn)行。

1.1 植物材料

試驗所用梅花品種（圖1）來自中國梅花研究中心（武漢），包括宮粉品種群的‘虎丘晚粉’（粉紅色，HQWF），綠萼品種群的‘變綠萼’（黃綠色，BLE），朱砂品種群的‘白須朱砂’（深紅色，BXZS），玉蝶品種群‘三輪玉蝶’（白色，SLYD）。

于梅花花期的晴天早晨、露水剛干之際（上午約10：00開始），從花發(fā)育良好的中段枝條上采集‘白須朱砂’和‘變綠萼’3個花色發(fā)育階段的梅花花瓣，立刻置液氮迅速冷凍并于-80℃保存。其中，大蕾期（S1）特征為花蕾松動但花瓣未展開；初花期（S2）特征為部分花瓣稍微展開；盛花期（S3）特征為花瓣完全展開且充盈豐滿[6]?！⑶鹜矸邸汀営竦瘍H采集S3梅花花瓣。同時采集各品種對應(yīng)時期鮮花用于花色表型分析，且各品種每個階段設(shè)置3個重復(fù)。

1.2 試劑與儀器

色譜級甲醇、甲酸和乙腈等化學(xué)藥品購自Fisher Scientific（Fair Lawn，NJ）公司。內(nèi)標(biāo)利多卡因購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。試驗用超純水由Milli-Q AdvantageA10（美國Millipore公司）超純水系統(tǒng)制備，本試驗所用其他試劑均為色譜純。

A：梅花4個品種盛花期的花色表型。B、C：‘變綠萼’和‘白須朱砂’3個花色時期的花瓣顏色表型。S1：大蕾期；S2：初花期；S3：盛花期。BXZS：白須朱砂；HQWF：虎丘晚粉；SLYD：三輪玉蝶；BLE：變綠萼。下同

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），超純水系統(tǒng)Milli-Q AdvantageA10（美國Millipore公司），離心機HSC-2015L（寧波新芝生物科技股份有限公司），Q-TOF液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），Eclipse Plus C18色譜柱（Thermo Hypersil Gold C18，100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國ThermoFisher公司），冷凍干燥機（上海比朗儀器制造有限公司），SCIENTZ-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 花色表型測定

首先，在光線良好的室內(nèi)、避免陽光直射，分別取4個品種梅花各個時期具典型顏色特征的新鮮花朵2—3個，重瓣花按不同層拆分平置于白紙上，將梅花重瓣的中間層花瓣中上部分與英國皇家園藝學(xué)會比色卡（Royal Horticultural Society Color Chart，RHSCC）進(jìn)行對比。重復(fù)10次，以出現(xiàn)頻率最高的結(jié)果作為該品種的花色。

同時，采用CM-5分光測色計（KonicaMinolta，日本）對以上梅花花瓣材料測色，具體如下：取梅花重瓣的中間花瓣，并將花瓣的中間部分對準(zhǔn)色差儀的集光孔，在D65光源10°對所選花瓣進(jìn)行中點測量明度L*值、色相a*值與b*值。最后取平均值。L值衡量的是花色的明暗程度指標(biāo)，從100到0的變化過程體現(xiàn)了明度從白到黑的變化過程。紅度a值從a到a轉(zhuǎn)變中體現(xiàn)了綠色減退，紅色增強。黃度b值從b到b變化過程中代表了藍(lán)色減退，黃色增加。

1.4 樣品制備

配制含2%甲酸的甲醇浸提劑，向浸提劑加入內(nèi)標(biāo)利多卡因0.2 mg?L-1。電子天平稱0.015—0.025 g樣品后磨樣。加浸提劑（0.1 g樣加800 μL提取液），振蕩混勻。超聲清洗（KQ5200D型數(shù)控超聲波清洗器，功率100%，30 min，期間加入冰塊降溫，使溫度不超過25℃）。將樣品放至4℃環(huán)境，靜置24 h。離心（13 000 r/min，10 min）。上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，裝于2 mL安捷倫上樣小瓶中[24]。

1.5 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用條件

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀型號為快速高效色譜系統(tǒng)（1200 series Rapid Resolution HPLC system）連接QTOF 6520質(zhì)譜儀（Agilent Technologies）。采用Eclipse Plus C18色譜柱（Thermo Hypersil Gold C18色譜柱，100 mm×2.1 mm，1.9 μm）分離樣品中的代謝物。流動相A為含0.1%（v/v）甲酸的超純水，流動相B為含0.1%甲酸的純乙腈（色譜級，Thermofisher）。梯度洗脫程序如下：0 min，5% B；20 min，95% B；22.1 min，5% B；28 min，5% B。柱溫為35℃，保持恒定。流速0.3 mL?min-1。質(zhì)譜分析條件如下：離子模式為全掃描電噴霧電離（either an electrospray ionization，ESI），采用正離子模式（ESI+）進(jìn)行；干燥氣體（drying gas nitrogen）為10 L?min-1；氣體溫度（gas temperature）為350℃；霧化氣壓力（nebulizer pressure）為40 psi；毛細(xì)管電壓（capillary voltage）為3.5 kV。破裂電壓（fragmentor）為135 V；撇渣器（skimmer）為65 V；紫外DVD選用520、350和320 nm。采用MS/MS模式分析代謝物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，碰撞能量（the collision energy）為10、20和30 ev[24]。

1.6 代謝物定性和定量分析

根據(jù)高效液相色譜質(zhì)譜得到代謝物的m/z值和離子碎片模式與常用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫或已發(fā)表文獻(xiàn)中的代謝物進(jìn)行比對鑒定代謝物。質(zhì)譜庫有Mass Bank（http://www.massbank.jp/）和HMDB（https://hmdb.ca/ metabolites/）[25]。以化合物矢車菊素3--葡萄糖苷（Cyanidin 3--glucoside）為例，具體說明通過質(zhì)譜信息與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對比鑒定代謝物過程。在‘白須朱砂’樣品正離子模式掃描下的QTOF-MS/MS數(shù)據(jù)中提取一級碎片質(zhì)譜圖如圖2-B顯示，主要碎片離子質(zhì)荷比（m/z）為163.0392與287.0554。該物質(zhì)可能是具有一個糖基（163.0392）修飾、母核為矢車菊素（287.0554）的類黃酮，因此推斷該物質(zhì)為矢車菊素--葡萄糖苷。另外由前人研究證明[26]，梅花花瓣中含大量的矢車菊素3-葡萄糖苷。同時，對比在HMDB數(shù)據(jù)庫中矢車菊素3-葡萄糖苷在Positive下的二級碎片質(zhì)譜圖（圖2-C），發(fā)現(xiàn)本試驗所得物質(zhì)結(jié)構(gòu)及碎片荷質(zhì)比與網(wǎng)站的二級碎片荷質(zhì)比高度吻合，因此鑒別該物質(zhì)為矢車菊素3--葡萄糖苷。

利用內(nèi)標(biāo)法計算代謝物的相對含量。浸提劑中加入0.2 mg?L-1的利多卡因作為內(nèi)標(biāo)物混入樣品中，然后對含有內(nèi)標(biāo)物的樣品進(jìn)行色譜分析，提取并測定利多卡因的峰面積和各個代謝物的峰面積，利用利多卡因和各個代謝物的峰面積比計算各代謝物的相對含量。

1.7 多元統(tǒng)計分析

使用IBM SPSS統(tǒng)計軟件（版本22.0，芝加哥，IL，美國）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有試驗均為3個重復(fù)。采用方差分析（One-Way ANOVA）結(jié)合Duncan多元方差分析（＜0.05）進(jìn)行差異顯著性分析，對4個梅花品種同一時期，以及‘白須朱砂’和‘變綠萼’3個開花時期顏色參數(shù)和花瓣色素含量進(jìn)行比較。在R 4.0.4中采用皮爾遜相關(guān)性分析方法分析顏色參數(shù)與色素含量的關(guān)系。

A：梅花花瓣中矢車菊素3-O-葡萄糖苷總離子流色譜圖。B：梅花花瓣中矢車菊素3-O-葡萄糖苷一級質(zhì)譜圖。C—E：梅花花瓣中矢車菊素3-O-葡萄糖苷在碰撞能量分別為10、20和30 ev時的二級質(zhì)譜圖

代謝物數(shù)據(jù)采用log10變換進(jìn)行統(tǒng)計分析，改善正態(tài)性，并進(jìn)行歸一化處理。利用Simca 14.1軟件對樣品的代謝物進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS- DA），研究代謝物的積累特點。值設(shè)為0.05并結(jié)合VIP≥1篩選差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 梅花花色表型觀測

根據(jù)與英國皇家園藝學(xué)會比色卡比對結(jié)果，4個梅花品種S3時期花色可分為4個色系，‘白須朱砂’為紅色系，‘虎丘晚粉’為紫紅色系，‘三輪玉蝶’為白色系，‘變綠萼’為黃色系（表1、圖1-A）。為了更加準(zhǔn)確地評價梅花顏色，本研究利用色差儀測定了4個梅花品種S3時期花瓣的顏色參數(shù)L*、a*、b*值。如表1所示，‘白須朱砂’和‘虎丘晚粉’的a*值較高且均為正，b*值較低且基本為負(fù)?！兙G萼’和‘三輪玉蝶’的b*值較高且均為正，a*值較低且均為負(fù)。

通過長期觀察，本研究發(fā)現(xiàn)開花過程中梅花花色逐漸變淺且在大蕾期、初花期、盛花期花色變化較為明顯，同時考慮梅花紅色花色育種與黃綠色育種目標(biāo)，因此選擇深紅色‘白須朱砂’與淺黃綠色的‘變綠萼’進(jìn)行開花時期花色變化的研究。同樣地，根據(jù)與英國皇家園藝學(xué)會比色卡比對結(jié)果，S1—S3時期，‘白須朱砂’花色分別為紅色系的53A、53C和54A（表1）?！兙G萼’開花過程中，S1到S2時期花色從黃色系的4B變淺4D，S2到S3時期均為黃色系4D（表1）。利用色差儀對‘白須朱砂’和‘變綠萼’S1—S3時期花瓣的顏色參數(shù)進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn)，S1—S3時期，‘白須朱砂’a*值均為正且逐漸變小，‘變綠萼’b*值均為正且逐漸變?。ū?）。

表1 4個梅花品種的花色數(shù)據(jù)

不同小寫字母表示多重比較Duncan檢驗在=0.05顯著性水平下的差異顯著。S1：大蕾期；S2：初花期；S3：盛花期。下同

Different lowercase letters represent the different significant differences at=0.05 level in Duncan’s test. S1: Flower budding stage; S2: Early flowering stage; S3: Blooming stage. The same as below

2.2 梅花花瓣中類黃酮代謝物定性定量分析

色素分子的種類和含量是決定植物顏色的主要因素。黃酮類化合物屬于酚類化合物，是在梅花中發(fā)現(xiàn)的主要色素分子。本研究基于LC-MS/MS對梅花花瓣中的黃酮類化合物進(jìn)行了廣泛的非靶向代謝物分析，利用離子峰精確的分子質(zhì)量和碎片離子信息與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對，在梅花花瓣中共鑒定出25種黃酮類化合物（表2），其中花青素類包括矢車菊素及其衍生物3種，芍藥花素及其衍生物1種，黃酮醇類有槲皮素及其衍生物10種，山奈酚及其衍生物5種，此外還有芹菜苷、查爾酮、黃烷酮、苯丙素和反式肉桂酸（表2）。

為探究不同花色梅花中色素含量分布特點，本研究采用內(nèi)標(biāo)法計算梅花花瓣中黃酮類物質(zhì)的含量。由表3可以發(fā)現(xiàn)，‘白須朱砂’和‘虎丘晚粉’花瓣中主要的類黃酮成分是矢車菊素及其衍生物，‘變綠萼’和‘三輪玉蝶’花瓣中主要的類黃酮成分是槲皮素及其衍生物。另外，矢車菊素及其衍生物總量在‘白須朱砂’中所占比例顯著高于‘虎丘晚粉’，而芍藥花素及其衍生物總量在‘白須朱砂’中所占比例低于‘虎丘晚粉’（表3）。S3時期，‘變綠萼’中槲皮素及其衍生物所占比例高于‘三輪玉蝶’（表3）。

S1—S3時期，‘白須朱砂’花瓣中類黃酮化合物含量整體下降（表3）?！醉氈焐啊ò曛惺杠嚲账丶捌溲苌锟偭?、芍藥花素及其衍生物總量、飛燕草素及其衍生物總量在S1—S3時期逐漸降低，但S2—S3時期降低不顯著。在‘變綠萼’的S1—S3時期，花瓣中類黃酮化合物含量整體從S1—S2時期增加，S2—S3時期略有下降，但3個時期含量變化差異不顯著。同樣地，‘變綠萼’花瓣中槲皮素及其衍生物總量從S1—S2時期增加，S2—S3時期略有下降，但3個時期含量變化差異不顯著（表3）。

2.3 梅花4個花色代表品種及花色發(fā)育過程中差異代謝物分析

為進(jìn)一步分析梅花花色差異與類黃酮代謝物的關(guān)系，本研究首先通過Duncan檢驗（＜0.05）和預(yù)測差異代謝物中重要的變量VIP值（VIP值≥1）對25種類黃酮進(jìn)行差異代謝物篩選；然后對代謝物與花色參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析（圖3）。在S3時期，‘白須朱砂’和‘變綠萼’間有3個差異代謝物，為矢車菊素-3--葡萄糖苷（Cyanidin 3--glucoside）、矢車菊素-3-蕓香糖苷（Cyanidin-3-rutinoside）、芍藥花素-3--葡萄糖苷（Peonidin-3--glucoside）。3個差異代謝物在‘白須朱砂’與‘變綠萼’間的含量差異同S3時期‘白須朱砂’與‘變綠萼’間a值差異情況一致，且與a值呈正相關(guān)關(guān)系（表1、圖3）。在‘白須朱砂’開花過程中，S1和S2時期篩選到2個差異代謝物（矢車菊素-3--葡萄糖苷和芍藥花素-3--葡萄糖苷）；S1和S3時期篩選到3個差異代謝物（矢車菊素-3--葡萄糖苷、芍藥花素-3--葡萄糖苷、槲皮素）。結(jié)合表1和圖3發(fā)現(xiàn)，S1—S3時期，這些差異代謝物含量與a*值呈正相關(guān)關(guān)系，含量變化與表1中a*值逐漸變小的趨勢一致（表1、圖3）。此外，在S3時期，‘白須朱砂’和‘虎丘晚粉’間篩選到2個差異代謝物，為槲皮素異構(gòu)體（Quercetin isomer）和槲皮素3--葡萄糖基-2′--鼠李糖苷（Quercetin 3--glucosyl-2′-- rhamnoside）。然而，由表3可以看出，2個差異代謝物在‘虎丘晚粉’與‘白須朱砂’間的含量差異，與表1中S3時期a*值的差異情況相反。同時，根據(jù)圖3的相關(guān)性分析結(jié)果，槲皮素異構(gòu)體與a*相關(guān)性不強，槲皮素 3--葡萄糖基-2′--鼠李糖苷與a*呈負(fù)相關(guān)。

表2 4個梅花品種花瓣中主要黃酮類化合物的HPLC-ESI-MS分析

續(xù)表2 Continued table 2

表3 4個梅花品種花瓣中主要黃酮類化合物含量

續(xù)表3 Continued table 3

每個正方形表示一對數(shù)據(jù)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)，熱圖中藍(lán)色和紅色的強度表示正和負(fù)的水平相關(guān)性。*表示顯著相關(guān)

‘變綠萼’和‘三輪玉蝶’的S3時期花瓣中篩選出5個差異代謝物，為異鼠李素（Quercetin 3'-methyl ether）、矢車菊素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷（Cyanidin 3-rutinoside 5-glucoside）、槲皮素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷（Quercetin-3-rutinoside 5-glucoside）、槲皮素3--葡萄糖苷-7--鼠李糖苷（Quercetin 3--glucoside- 7--rhamnoside）、柚皮素（Naringenin）。結(jié)合圖3和表3發(fā)現(xiàn)，除異鼠李素外，其他4個差異代謝物在‘三輪玉蝶’與‘變綠萼’間的含量差異同表1中S3時期的b*值差異情況一致，且與b*值呈正相關(guān)關(guān)系（表1、圖3）。在‘變綠萼’開花3個時期，根據(jù)VIP值≥1和＜0.05，25種代謝物中沒有篩選出在‘變綠萼’3個開花時期間存在顯著差異的代謝物。

3 討論

3.1 首次在不同花色梅花品種中鑒定類黃酮化合物

花色是梅花極其重要的觀賞性狀。類黃酮化合物是影響梅花呈色的主要色素，前人對梅花花瓣中花青素苷進(jìn)行了鑒定，初步探究了花青素苷對梅花紅色花色形成的影響。但梅花花色豐富，除了紅、白花色，還有黃綠色，且梅花花瓣中其他類黃酮化合物尚無系統(tǒng)鑒定。本研究首次用LCMS法對不同花色梅花花瓣中類黃酮代謝物進(jìn)行鑒定。共鑒定出花青素類包括矢車菊素及其衍生物3種，芍藥花素衍生物1種，包括了張芹[6]在紅色系梅花中鑒定出的花青素成分。另外，本研究首次鑒定出了槲皮素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素3--葡萄糖苷-7-鼠李糖苷、芹菜素7--葡萄糖苷。

另外，前人研究表明，作為藥食同用藥材綠萼梅花瓣中含有多種化學(xué)成分，其中綠原酸類和黃酮類是其主要活性成分[18]。植物中黃酮類衍生物提取物有促進(jìn)動物淋巴血液循環(huán)的作用，具有鎮(zhèn)靜、安撫的效果，可舒緩、收斂、抗菌。其中，蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗抑郁、抗炎等作用[19-20]。本研究通過對來自不同梅花品種群不同花色的梅花類黃酮化合物進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)除了‘變綠萼’，在花色較深的‘白須朱砂’與‘虎丘晚粉’中上述功能化合物的含量也較高，為梅花資源開發(fā)提供了參考。

3.2 矢車菊苷和芍藥花苷影響梅花紅色花色的形成

矢車菊素與芍藥花素一般使植物呈現(xiàn)紅色，飛燕草素衍生物一般使植物呈現(xiàn)藍(lán)色到紫色[27]。本研究中紅色的‘白須朱砂’和紫紅色的‘虎丘晚粉’都以矢車菊素及其衍生物、芍藥花素及其衍生物為主要成分，矢車菊素及其衍生物、芍藥花素及其衍生物在純白的‘三輪玉蝶’和黃綠色的‘變綠萼’中含量極少。與前人研究報道梅花花色色素屬于黃酮類化合物，花青素苷是梅花花色形成的重要色素，梅花的紅色花色源于花色素和其苷，且紅色程度與其花色苷含量成正相關(guān)的結(jié)論一致[28]。通過兩兩對比差異代謝物，‘白須朱砂’和‘變綠萼’在S3時期的差異代謝物矢車菊素-3--葡萄糖苷、矢車菊素-3--蕓香糖苷、芍藥花素-3--葡萄糖苷在‘白須朱砂’中含量顯著高于‘變綠萼’與‘三輪玉蝶’（＜0.05），這也說明矢車菊素衍生物、芍藥花素衍生物是影響梅花紅、白花色差異的主要因素。同時，S3時期，‘白須朱砂’中花青素總含量、矢車菊素及其衍生物總含量、芍藥花素及其衍生物總含量顯著高于‘虎丘晚粉’（表3）。另外，S1—S3時期，‘白須朱砂’紅色變淺，矢車菊素及其衍生物和芍藥花素及其衍生物作為主要成分從S1—S3時期含量顯著下降（＜0.05，表3），但S2—S3時期差異變化不明顯。同時，差異代謝物矢車菊素-3--葡萄糖苷、芍藥花素-3--葡萄糖苷從S1—S3含量顯著下降，根據(jù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，矢車菊素-3--葡萄糖苷和芍藥花素-3--葡萄糖苷與a*值呈顯著正相關(guān)（圖3）。因此，芍藥花苷和矢車菊苷可能是影響‘白須朱砂’紅色變化的主要代謝物質(zhì)，且在‘白須朱砂’開花過程中，芍藥花苷和矢車菊苷含量的下降，使‘白須朱砂’花瓣中主要色素占比變化，從而導(dǎo)致紅色變淺。

3.3 槲皮素及其衍生物可能是形成梅花黃綠色花色的重要色素

花青素苷是主要的著色物質(zhì)，黃酮醇是不同顏色的輔助色素[29-30]。黃綠色‘變綠萼’和純白色‘三輪玉蝶’花瓣中主要類黃酮物質(zhì)為槲皮素，且‘變綠萼’花瓣中槲皮素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素-3--葡萄糖苷-7--鼠李糖苷的含量顯著高于‘三輪玉蝶’花瓣中的含量（表3）。前人在對金花茶花瓣的研究中發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素-3--葡萄糖苷-7--鼠李糖苷是花瓣黃色的主要成分，這兩種成分含量的積累導(dǎo)致花色變黃[31]。因此，槲皮素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素-3--葡萄糖苷-7--鼠李糖苷可能是黃綠色梅花育種值得關(guān)注的化合物。另外，花青素上游的類黃酮代謝物的組成和含量也與植物著色有關(guān)[32]，本研究中柚皮素、異鼠李素在‘三輪玉蝶’與‘變綠萼’S3時期花瓣中存在顯著差異（＜0.05；VIP≥1）。

此外，從S1—S3時期，‘變綠萼’黃綠色變淺，與黃色相關(guān)的顏色參數(shù)b值顯著下降，但沒有篩選出差異物質(zhì)，同時與‘變綠萼’花色相關(guān)的槲皮素衍生物在S1—S3時期含量無顯著變化。前人研究發(fā)現(xiàn)黃綠色的綠萼梅不含葉綠素，并推測綠白花色可能與人的視覺習(xí)慣有關(guān)，花色事實上為黃白甚至純白[33]。另外，本研究只對‘變綠萼’的類黃酮化合物進(jìn)行了定性分析，并沒有對與植物黃色相關(guān)的類胡蘿卜素進(jìn)行定性分析，因此，S1—S3時期觀察到‘變綠萼’黃綠色變淺也可能與類胡蘿卜素含量變化有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究選擇了4個梅花代表花色品種與3個不同開花階段，利用LCMS首次同時檢測了梅花花青素苷和類黃酮苷，共檢測到25種類黃酮化合物。通過與‘變綠萼’梅中類黃酮化合物種類與含量比對，發(fā)現(xiàn)花色較深的‘白須朱砂’梅與‘虎丘晚粉’梅也含具有抗氧化活性等價值的類黃酮化合物且含量較高。另外，通過探究類黃酮化合物種類及含量與梅花花色的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)矢車菊素及其衍生物和芍藥花素及其衍生物是影響梅花花色形成的主要色素；而槲皮素及其衍生物可能是影響黃綠色‘變綠萼’形成的主要色素。

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Determination and Analysis of Flavonoids Metabolites in Different Colors Cultivars and Blooming Stages of

College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/ National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Wuhan 430070

【Objective】Flower color is an extremely important ornamental trait of(), and flavonoids are the main pigments in the petals of.However, there are few systematic studies on the composition of flavonoids and the relationship between flower color and flavonoids in. The study on flavonoids can provide a reference for the mechanism of flower color formation and the development of flavonoids resources in.【Method】In this study, the petals of fourcultivars with representative flower color in the blooming stage and the key period of flower color change of two cultivars were selected as materials. The flower color phenotype of petals was measured with the Royal Horticultural Society Color Card (RHSCC) and colorimeter. Flavonoids in those petals of flowers were determined by high-performance liquid chromatography and mass spectrometric (HPLC-MS) detectors. Then, Duncan test and OPLS-DA were used to analyze the difference of metabolites among these four cultivars and the major blooming stages. 【Result】In total, 25 flavonoids were determined in. The main components of red Baixu Zhusha and purple-red Huqiu Wanfen were anthocyanins. But the contents of cyanidin and its derivatives between Baixu Zhusha and Huqiu Wanfen were different. In addition, from the big budding stage to the blooming stage, the red color of Baixu Zhusha gradually became lighter, and the contents of cyanidin-3--glucoside and peonidin-3--glucoside also gradually decreased. Yellow-green Bian Lv’e and pure white Sanlun Yudie were most enriched with quercetin and its derivatives. The contents of quercetin derivatives between Bian Lv’e and Sanlun Yudie were different. 【Conclusion】The flavonoid metabolic profiles differed among the different colored petal of, and flavonoids with medicinal value were distributed in all varieties. The difference in the contents of cyanidin and peonidin might be related to petal color differences of red. Quercetin derivatives might affect the color of yellow-green. In this study, the flavonoids metabolites of different colorwere identified and analyzed for the first time, and the differences in flower colorvarieties and the blooming process were preliminarily understood from the metabolic level. The results provided a reference for understanding the difference of flower color formation and development of flavonoid resources of

; flower color; flavonoids; HPLC-Q-TOF-MS

2022-06-20；

2022-08-29

國家重點研發(fā)計劃（2019YFD1001500）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項基金（2662020YLPY006）

吳思惠，E-mail：wsh_chin@webmail.hzau.edu.cn。通信作者張杰，E-mail：flybebrave@mail.hzau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.09.012

（責(zé)任編輯 趙伶俐）