復(fù)方氯化鈉滴眼液中羥苯乙酯含量測定及抑菌效力評價

傅 星，楊振春，孫 麗

（江蘇省宿遷市食品藥品檢驗所，江蘇 宿遷 223800）

復(fù)方氯化鈉滴眼液是一種以氯化鈉、氯化鉀等為主要成分的多劑量眼用制劑，適用于干眼癥，眼睛疲勞等。2020年版《中國藥典（四部）》通則0105 眼用制劑規(guī)定［1］，多劑量眼用制劑一般可加適當抑菌劑以抑制微生物的滋生［2-5］。羥苯乙酯為尼泊金類抑菌劑，抑菌效果良好，廣泛用于多種眼用制劑中［6-8］，但過量使用會導(dǎo)致過敏反應(yīng)及類激素作用［9］。2015年版《中國藥典（四部）》收載現(xiàn)行抑菌效力檢查法［10］，而市售復(fù)方氯化鈉滴眼液大部分首次獲批于此前，尚缺乏相關(guān)抑菌效力評價?，F(xiàn)行標準并未對復(fù)方氯化鈉滴眼液中抑菌劑的添加量有明確要求，且無相應(yīng)的檢驗方法，各生產(chǎn)企業(yè)的抑制劑添加量標準均不相同。從安全性考慮，有必要對該制劑進行定量檢測［11-12］及抑菌效力測定［13-15］，以評估抑菌劑的添加是否合理、有效。為此，本研究中建立了測定產(chǎn)品中羥苯乙酯含量的高效液相色譜法，并評價其抑菌效力。現(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥、培養(yǎng)基與菌株

1.1 儀器

安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；XS105DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KH5200 型超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；IPP260型低溫培養(yǎng)箱（德國Memmert公司）。

1.2 試藥

復(fù)方氯化鈉滴眼液（A 公司，批號分別為2008041，2008281，2102231，2104081，2106161，2103071；B 公司，批號分別為210909，210606；C 公司，批號為21091401；規(guī)格均為每瓶10 mL）；羥苯乙酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100847-202105，含量為100.0%）；羥丙甲纖維素（Ⅰ型，黏度為100 mPa·s）；乙腈、磷酸二氫銨、氯化鈉均為色譜純，氯化鉀為分析純，水為超純水。

1.3 培養(yǎng)基

pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨培養(yǎng)基，胰酪大豆胨瓊脂（TSA）培養(yǎng)基，胰酪大豆胨肉體（TSB）培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基，沙氏葡萄糖肉體（SDB）培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，均已進行培養(yǎng)基適用性檢查。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003，銅綠假單胞菌CMCC（B）10104，大腸埃希菌CMCC（B）44102，白色念珠菌CMCC（F）98001，黑曲霉CMCC（F）98003，均由中國醫(yī)學(xué)細菌保藏管理中心（CMCC）提供，用于菌液制備的工作菌株均為第3代。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.05 mol/ L 磷酸二氫銨溶液（氨水調(diào)pH 至5.0）-乙腈（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：256 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取羥苯乙酯對照品10.58 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加2 mL乙腈溶解，加流動相定容，搖勻，作為標準貯備液，備用。精密量取樣品2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，作為供試品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》復(fù)方氯化鈉滴眼液項下處方工藝（除抑菌劑）配制，取氯化鈉0.9 g、氯化鉀0.014 g、碳酸氫鈉0.02 g，精密稱定，以及羥丙甲纖維素適量（視終溶液黏度調(diào)整），加注射用水至100 mL，制成空白對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2項下3種溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，輔料及主藥均不干擾抑菌劑羥苯乙酯的測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.EthylparabenA.Reference solution B-D.Test solution（Lot No.：2008041，210909，21091401） E.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下標準貯備液，加流動相制成質(zhì)量濃度分別為3.31，6.61，13.23，26.45，52.90，105.80 μg/mL的系列標準溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=56.798X-5.799 1（r=1，n= 6）。結(jié)果表明，羥苯乙酯質(zhì)量濃度在3.31～105.80 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限確定：取2.2 項下標準貯備液，加流動相逐級稀釋，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄各質(zhì)量濃度下對照品峰的信噪比（S/N）。以S/N為3∶1和10∶1 時的質(zhì)量濃度作為檢測限和定量限. 結(jié)果羥苯乙酯的檢測限為0.08 μg/mL，定量限為0.15 μg/mL。

精密度試驗：精密量取樣品（批號為2008041）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果羥苯乙酯峰面積的RSD為0.36%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取精密度試驗項下供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果羥苯乙酯峰面積的RSD為1.50%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取精密度試驗項下供試品溶液適量，分別于室溫放置0，4，8，12，16，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果羥苯乙酯峰面積的RSD為0.61%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號2008041）1.0 mL，共9 份，置10 mL 容量瓶中，分別加入標準貯備液0.25，0.40，0.50 mL，加流動相定容，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果平均加樣回收率為99.81%，RSD為1.42%（n=9）。

耐用性試驗：分別改變柱溫（25～35 ℃）、流速（0.8～1.2 mL/ min）、檢測波長（251～261 nm）、流動相pH 值（4.8～5.2）和色譜柱［Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），Ultimate LP-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）］，其他條件不變，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果測定結(jié)果不受影響，表明方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

分別取9 批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果見表1。

表1 樣品中羥苯乙酯含量測定結(jié)果（mg/mL，n=3）Tab.1 Results of the content determination of ethylparaben in samples（mg/mL，n=3）

2.5 抑菌效力測定

2.5.1 菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物接種于TSB培養(yǎng)基中，取白色念珠菌和黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至SDB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 后，用pH 7.0 的無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液逐級稀釋至10-7，分別用TSA 培養(yǎng)基和SDA 培養(yǎng)基計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果將原菌液配制成含菌107～108cfu/mL 的菌懸液，備用。

2.5.2 抑菌效力測定

取企業(yè)A、企業(yè)B、企業(yè)C的復(fù)方氯化鈉滴眼液各5瓶，分別加入上述5種菌液0.1 mL，使每瓶滴眼液中含菌量為105～106cfu/ mL，20 ℃避光貯存，分別于6，24 h 及7，14，28 d 取樣，稀釋法計數(shù)，換算成lg 值，并與接種菌數(shù)lg值比較差值。結(jié)果見表2。

表2 樣品中羥苯乙酯抑菌效力測定結(jié)果Tab.2 Evaluation results of the bacteriostatic efficacy of ethylparaben in samples

3 討論

由表1可知，各批號的復(fù)方氯化鈉滴眼液中羥苯乙酯的含量均未超過相應(yīng)標示量，各生產(chǎn)企業(yè)較好地控制了制劑中羥苯乙酯的含量。

通過對3 家企業(yè)生產(chǎn)的復(fù)方氯化鈉滴眼液進行抑菌效力評價，發(fā)現(xiàn)制劑中添加的羥苯乙酯的抑菌效力都不能完全達到2020年版《中國藥典（四部）》所規(guī)定的抑菌效力的要求；從抑菌效力的結(jié)果來看，制劑的抑菌效力是隨著羥苯乙酯的添加量而增強的。提示生產(chǎn)企業(yè)在合理范圍內(nèi)可適當增加羥苯乙酯的添加量而保障制劑的抑菌效果。

現(xiàn)行標準對于復(fù)方氯化鈉滴眼液中抑菌劑的種類及添加量均無明確要求。眼用制劑中的常用抑菌劑有羥苯乙酯、羥苯丙酯、苯扎氯銨、苯扎溴銨、硫柳汞等，市售復(fù)方氯化鈉滴眼液中的抑菌劑均為羥苯乙酯，且不同的生產(chǎn)企業(yè)的添加量有較大差異，但各滴眼液的抑菌效力均不符合2020年版《中國藥典（四部）》通則1121 抑菌效力檢查法的要求。

羥苯乙酯對眼刺激性較大，美國食品和藥物管理局并未推薦其在眼用制劑中使用，在口服和皮膚制劑的最大用量為0.05%［16］。相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)重新對復(fù)方氯化鈉滴眼液中所用抑菌劑種類及添加量進行篩選和評估。