miR-296-3p在心房顫動病人血清中的表達(dá)水平及其臨床意義

薛 睿,丁 莉,任 明

在心律失常類疾病中,心房顫動發(fā)病率逐年上升,目前已迅速成為世界范圍內(nèi)的醫(yī)學(xué)問題[1-2]。心房顫動的病理機(jī)制較復(fù)雜,與多種因素有關(guān)[3-4],如心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)、炎癥、自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和氧化應(yīng)激等。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是非編碼RNA家族的一員,長度為18～25個核苷酸,通過其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)影響基因表達(dá)調(diào)控,從而介入生理過程及病理進(jìn)展中[5]。目前,miRNAs已證實與心房顫動病理過程相關(guān)。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn),miR-10a通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Samds信號通路抑制心房顫動導(dǎo)致心肌纖維化和成纖維細(xì)胞增殖。Lv等[7]研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-27b-3p通過靶向Wnt3a調(diào)控Wnt/catenin信號通路,可減輕心房顫動大鼠心房纖維化。雖已證實多種miRNAs與心房顫動發(fā)生相關(guān),但關(guān)于miR-296-3p在心房顫動中作用的報道較少。本研究通過檢測miR-296-3p在心房顫動病人血清中的變化,與影響心房顫動發(fā)生的臨床危險因素進(jìn)行分析,探究miR-296-3p的潛在靶基因,通過miR-296-3p在心房顫動中的作用,評估m(xù)iR-296-3p作為心房顫動病理進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物的潛力。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年6月—2021年6月于我院心內(nèi)科住院治療的心房顫動病人50例作為心房顫動組,選取同期于我院體檢中心進(jìn)行體檢的健康志愿者15名作為健康對照組。根據(jù)《美國心房顫動治療指南》[8]將心房顫動組病人分為陣發(fā)性心房顫動組(13例)、持續(xù)性心房顫動組(19例)、永久性心房顫動組(18例)3個亞組。所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 病人年齡30～70歲,心電圖或24 h動態(tài)心電圖(holter)證實心房顫動者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 心房顫動病史不明、近期感染、自身免疫病、原發(fā)性膽汁性肝硬化、慢性膀胱疼痛綜合征、結(jié)締組織病、嚴(yán)重腎功能不全、惡性腫瘤、阿爾茨海默病、帕金森綜合征及其他特殊狀態(tài)中的心房顫動(妊娠期心房顫動、急性心肌梗死并發(fā)心房顫動、肥厚型心肌病并發(fā)心房顫動、甲狀腺功能亢進(jìn)并發(fā)心房顫動、外科手術(shù)后心房顫動)

1.3 主要試劑 焦碳酸二乙酯(DEPC)購自日本TaKaRa公司,Trizol氯仿(分析純)購自日本TOYBO公司,熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購自日本TOYBO公司,cDNA合成試劑盒購自日本TaKaRa公司,二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)分析試劑盒、高靈敏化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.4 實驗室檢測 采集心房顫動病人清晨空腹肘靜脈血4 mL,離心后(根據(jù)RNA提取試劑盒說明進(jìn)行)-80 ℃存放備用。①采用羅氏全自動生化儀(Roche Cobas6000)檢測低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、血清總膽固醇(TC)、血肌酐(Cr)、三酰甘油(TG)、N末端B型腦鈉肽前體(NT-proBNP)水平。②采用STAGO全自動血凝檢測儀(法國STAGO CS-1300)檢測血清D-二聚體水平。③采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-296-3p mimic抑制SCN5A的效果,按miRNeasySerum/Plasma Kit試劑盒操作說明書提取總RNA,采用260 nm或280 nm處吸光度值(OD)對RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測,通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗后再測定miR-296-3p Ct值,計算miR-296-3p在各組樣本中的表達(dá)水平(內(nèi)參照為U6),取3次重復(fù)實驗的平均值。④采用蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測miR-296-3p mimic抑制SCN5A的效果,采用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞,BCA法檢測蛋白濃度,取上樣緩沖液與樣品混合并置于95 ℃變性10 min;電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,置于5%脫脂奶粉的封閉緩沖液中,封閉2 h。將SCN5A抗體(1∶500),GAPDH抗體(1∶1 000)加入至PVDF膜,GAPDH為內(nèi)參;4 ℃過夜。棄一抗,加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,室溫孵育1 h;棄二抗,ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色,暗室下顯影。⑤采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序,根據(jù)TargetScan(http:// www.targetscan.org)預(yù)測的miR-296-3p在SCN5A的3′-UTR區(qū)域具有的潛在結(jié)合位點,構(gòu)建SCN5A野生型3′-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒wt-SCN5A及其突變型報告基因質(zhì)粒Mut-SCN5A;將miR-NC或miR-296-3p mimics以及wt-SCN5A或Mut-SCN5A共轉(zhuǎn)染到人胚胎腎HEK293細(xì)胞中;轉(zhuǎn)染24 h后,加入1×被動裂解液裂解(PLB)15 min,收集裂解液;將植物無色花青素還原酶(LAR)底物100 μL加入到含有20 μL裂解液的EP管中,酶標(biāo)儀讀取Renilla熒光素酶的熒光值;加入終止試劑100 μL,立即讀取firefly熒光素酶熒光值,用比值計算樣本熒光強(qiáng)度[9]。

2 結(jié) 果

2.1 健康對照組與心房顫動組一般資料比較 兩組高血壓病史、風(fēng)濕性心臟病病史、左房內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)以及血清LDL-C、Cr、NT-proBNP、hs-CRP、D-二聚體水平、血清miR-296-3p表達(dá)比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

2.2 心房顫動亞組間miR-296-3p表達(dá)水平比較 心房顫動亞組間miR-296-3p表達(dá)水平比較,陣發(fā)性心房顫動組<持續(xù)性心房顫動組<永久性心房顫動組,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 心房顫動亞組間miR-296-3p的表達(dá)水平比較(±s)

2.3 心房顫動病人血清miR-296-3p表達(dá)水平與一般資料的Pearson分析 采用Pearson相關(guān)分析法分析心房顫動病人血清miR-296-3p的表達(dá)水平與一般資料的相關(guān)性,結(jié)果顯示,心房顫動病人miR-296-3p表達(dá)水平與年齡、左房內(nèi)徑呈正相關(guān)(r值分別為0.293,0.422,P<0.05)。詳見表3。

表3 心房顫動病人血清miR-296-3p表達(dá)水平與一般資料的Pearson相關(guān)分析

2.4 TargetScan預(yù)測miR-296-3p在SCN5A的3′-UTR潛在的結(jié)合位點 采用TargetScan(http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-296-3p的潛在靶基因,結(jié)果顯示,SCN5A的3′-UTR區(qū)域存在位點與miR-296-3p形成互補(bǔ)結(jié)合(見圖1),表明SCN5A是miR-296-3p的潛在靶基因。且TargetScan預(yù)測結(jié)果已顯示SCN5A的3′-UTR區(qū)域存在位點與miR-296-3p形成互補(bǔ)結(jié)合,將轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-296-3p以及構(gòu)建的SCN5A野生型3′-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒wt-SCN5A或突變型報告基因質(zhì)粒Mut-SCN5A共轉(zhuǎn)染進(jìn)人胚胎腎HEK293中,然后進(jìn)行雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-296-3p對wt-SCN5A質(zhì)粒及Mut-SCN5A質(zhì)粒熒光素酶活性的影響,結(jié)果顯示,不同濃度的miR-296-3p均可直接靶向作用于SCN5A的3′-UTR區(qū)域(見圖2)。

圖1 TargetScan預(yù)測miR-296-3p在SCN5A的3′-UTR有潛在的結(jié)合位點

與miR-NC比較,＊ P<0.01。圖2 不同濃度miR-296-3p轉(zhuǎn)染后熒光素酶活力檢測結(jié)果比較

2.5 qRT-PCR檢測miR-296-3p mimic抑制SCN5A的效果 不同濃度的miR-296-3p mimic均可結(jié)合SCN5A的3′-UTR進(jìn)而抑制SCN5A的表達(dá)。詳見圖3。

與miR-NC比較,＊ P<0.05,# P<0.01。圖3 qRT-PCR檢測不同濃度miR-296-3p mimic抑制SCN5A mRNA表達(dá)比較

2.6 Western Blot檢測miR-296-3p mimic抑制SCN5A的效果 不同濃度的miR-296-3p mimic都可結(jié)合SCN5A的3′-UTR進(jìn)而抑制SCN5A的蛋白表達(dá)水平。詳見圖4、圖5。

與miR-NC比較,＊ P<0.05,# P<0.01。圖4 Western Blot檢測不同濃度miR-296-3p mimic抑制SCN5A蛋白表達(dá)比較

圖5 Western Blot檢測不同濃度miR-296-3p mimic抑制SCN5A蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

心房顫動的疾病誘因具有復(fù)雜性及多樣化,在可能導(dǎo)致心房顫動發(fā)展的潛在因素中,miRNAs已經(jīng)證實與其發(fā)病機(jī)制相關(guān)。研究顯示,多種miRNAs參與心律失常等疾病的發(fā)生,如miRNA-155[10]、miRNA-320[11]等。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)miR-122可能通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)的激活促進(jìn)心房顫動心肌細(xì)胞凋亡;Ling[13]研究發(fā)現(xiàn),在心房顫動病人中miR-499顯著上調(diào),導(dǎo)致SK3下調(diào),從而參與心房顫動的電重構(gòu)。在心肌纖維化病人血清中miR-296表達(dá)升高[14],但是miR-296與心房顫動是否具有相關(guān)性尚未明確。本研究檢測到,在臨床心房顫動病人血清中miR-296-3p的表達(dá)水平呈明顯升高狀態(tài),并和年齡、左房內(nèi)徑呈正相關(guān)。進(jìn)一步對導(dǎo)致心房顫動危險因素(年齡、冠心病、風(fēng)濕性心臟瓣膜病、高血壓、NT-proBNP、LVEF等)進(jìn)行調(diào)整后,miR-296-3p的表達(dá)水平依舊和左房內(nèi)徑呈正相關(guān),且miR-296-3p的表達(dá)水平和左房內(nèi)徑均伴隨心房顫動持續(xù)時間的增加而增大。通過以上結(jié)果可知,miR-296-3p可能與心房重構(gòu)有關(guān)。本研究通過TargetScan預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實SCN5A是miR-296-3p的潛在靶基因,miR-296-3p可直接與相關(guān)基因SCN5A的3′-UTR區(qū)域相結(jié)合[15]。SCN5A基因負(fù)責(zé)編碼人類主要心臟鈉離子通道蛋白的ɑ亞單位(Nav1.5),并參與和維持心肌動作電位的形成,近年來,隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用,臨床心臟病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),擴(kuò)張型心肌病、心房顫動和心臟傳導(dǎo)疾病的綜合征等均與SCN5A基因突變導(dǎo)致的Nav1.5結(jié)構(gòu)的異常有關(guān)[16]。有研究顯示,SCN5A基因多樣性與心房顫動發(fā)生相關(guān),此外,飲酒和高血壓也會影響SCN5A基因的多態(tài)性[17]。結(jié)合以往研究結(jié)果,本研究通過qRT-PCR法和Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn),miR-296-3p可調(diào)控SCN5A的mRNA和蛋白表達(dá),提示miR-296-3p可能通過調(diào)控靶基因SCN5A參與心房顫動的發(fā)生。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,miR-296-3p在心房顫動病人血清中的表達(dá)水平明顯升高,并與左心房內(nèi)徑及心房顫動持續(xù)時長有關(guān),miR-296-3p可負(fù)調(diào)控SCN5A表達(dá),初步評估了miR-296-3p成為心房顫動新靶點的可能性。但是miR-296-3p調(diào)控SCN5A能否對心房電重構(gòu)和解剖結(jié)構(gòu)重構(gòu)發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用仍需進(jìn)一步研究。