黏質沙雷氏菌H04的有機磷降解活性及促生能力

李 翯, 王鵬宇, 陳子軒, 王柳楠, 徐晨琪, 任 虹

(北京工商大學輕工科學技術學院/北京工商大學中國輕工業(yè)清潔生產和資源綜合利用重點實驗室,北京 100048)

利用解磷菌作為微生物菌劑是一種低成本、生態(tài)安全、可持續(xù)的具有環(huán)境效益和經濟效益的替代策略[6]。解磷菌可通過產酸或酶解將難溶性有機磷和無機磷轉化成有效磷,從而直接或間接促進植物生長[7-9]。解磷菌多來自植物的根際處,主要屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和不動桿菌屬(Acinetobacter)[10-11]。其中,黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)是一類革蘭氏陰性菌株,許多研究表明黏質沙雷氏菌可通過誘導磷酸鹽的溶解、幾丁質酶和蛋白酶的分泌以及鐵載體的產生來促進植物生長[12-14]。Farhat等報道,黏質沙雷氏菌能溶解難溶性無機磷,包括磷礦、磷酸三鈣和羥基磷灰石[15]。George等從椰子樹根際分離得到的黏質沙雷氏菌KiSⅡ具有良好的解磷能力,其分解磷酸三鈣最高可釋放 216 μg/mL 的有效磷,并顯著促進水稻生長[16]。然而,目前關于黏質沙雷氏菌對有機磷源的利用和相應解磷機制的研究較少。

本研究以來自北京工商大學的槐樹根際土壤的黏質沙雷氏菌H04為研究對象,定性、定量評價其對有機磷源(卵磷脂、植酸)的利用能力,探討其解磷機制,并初步探究H04對輪作農作物綠豆和小麥種子早期生長的影響,以期為農作物微生物菌劑的開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 試驗于2021年6—10月在中國輕工業(yè)清潔生產和資源綜合利用重點實驗室完成。黏質沙雷氏菌H04,筆者所在課題組從北京工商大學(116°19′26″E,39°55′24″N)槐樹根際處篩選得到。磷酸酶、植酸酶活性和綠豆小麥發(fā)芽試驗中陽性對照菌株:綠針假單胞菌產金色亞種。

1.1.2 培養(yǎng)基 有機磷固體培養(yǎng)基:葡萄糖 10.0 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·H2O 0.03 g,卵磷脂 0.2 g(或植酸鈣 2.0 g),酵母浸粉 0.5 g,瓊脂 18.0 g,去離子水1 000 mL。

有機磷液體培養(yǎng)基:葡萄糖 10.0 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·H2O 0.03 g,卵磷脂 0.2 g(或植酸鈣 2.0 g),酵母浸粉 0.5 g,去離子水1 000 mL。

NB培養(yǎng)基:牛肉膏 5.0 g,蛋白胨 10.0 g,氯化鈉 5 g,去離子水1 000 mL。

1.2 解磷能力的評價

1.2.1 定性評價 解磷能力的定性評價應用點培養(yǎng)法[17]。使用滅菌的牙簽,將菌株H04分別點接種于以卵磷脂或植酸鈣為唯一磷源的有機磷固體培養(yǎng)基平板上,每個平板接種3個點,3組平行試驗,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)10 d,觀察有無透明圈的產生,并每天測量透明圈直徑(含菌落)與菌落直徑,計算解磷指數,解磷指數=A/B,其中A是包括菌落在內的透明圈直徑,B是菌落直徑。解磷指數大于1表明菌株在平板上有解磷活性。

1.2.2 定量評價 解磷能力的定量評價應用鉬銻抗比色法[18]。菌株H04在NB培養(yǎng)基中以 180 r/min、30 ℃培養(yǎng)過夜,調整D600 nm為0.6。NB培養(yǎng)液接種到以卵磷脂或植酸鈣為唯一磷源的有機磷液體培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃培養(yǎng)。定期取10 mL培養(yǎng)液用鉬銻抗比色法測定其可溶磷的含量。用pH計測定培養(yǎng)基的pH值。

1.3 解磷機制的初步研究

1.3.1 種子液的配制 菌株H04在NB培養(yǎng)基中180 r/min、30 ℃培養(yǎng)過夜,調整D600 nm為0.6。

1.3.2 磷酸酶活性測定 將菌株H04以2%的接種量接種于以卵磷脂為唯一磷源的有機磷液體培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃培養(yǎng)4 d。用酸性磷酸酶和堿性磷酸酶試劑盒檢測酶活性。以37 ℃中1 mL液體1 min水解1 μmol對硝基苯磷酸二鈉產生對硝基苯酚定義為一個酶活單位。所有測量進行3組重復,以未接種的培養(yǎng)基作為陰性對照,以已被報道具有植物生長促進活性和抗菌活性的微生物綠針假單胞菌產金色亞種作為陽性對照(CK+)[19]。

1.3.3 植酸酶活性測定 將菌株H04以2%的接種量接種于以植酸鈣為唯一磷源的有機磷液體培養(yǎng)基中,180 r/min、30 ℃培養(yǎng)4 d。以GB/T 18634—2009《飼用植酸酶活性的測定 分光光度法》為標準,采用分光光度法測定菌株H04的植酸酶活性[20]。在37 ℃、pH值5.5條件下,每分鐘從5.0 mmol/L植酸鈉溶液中釋放1 μmol無機磷,即為一個植酸酶活性單位。用下列公式計算植酸酶活性:

植酸酶活性(U/mL)=(y×n)/(m×t)。

式中:y代表無機磷含量,μmol;m代表樣品體積,mL;t代表酶解反應時間,min;n代表樣品稀釋倍數;所有測量均重復3次,以未接種的培養(yǎng)基作為陰性對照。綠針假單胞菌產金色亞種作為陽性對照(CK+)。

1.4 H04對綠豆和小麥早期生長的影響

為制備接種物,將菌株置于NB培養(yǎng)基中 30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)8 h。接種前,綠豆和小麥種子表面用0.1% NaClO滅菌5 min,無菌去離子水洗滌3次。以每30粒種子15 mL的比例,將細菌懸浮液作為種子浸液施用3 h后風干。然后將每30粒風干種子轉移到放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中,設置3組平行。培養(yǎng)皿中,種子在黑暗下培養(yǎng)48 h,然后在室溫下以晝夜為周期進行培養(yǎng)。按照要求用無菌去離子水澆水。以無菌去離子水浸種的種子為陰性對照(CK-),綠針假單胞菌產金色亞種為陽性對照(CK+)。

培養(yǎng)3 d,統(tǒng)計綠豆和小麥種子發(fā)芽數。7 d時,測定綠豆幼苗的根長、根粗、鮮質量、干質量和根系活力,同時測定小麥幼苗的出苗率、根長、芽長、鮮質量、干質量和總葉綠素含量。

應用TTC法計算根系活力[21],并用TTC還原強度來表示:

TTC還原強度[μg/(g·h)]=TTC還原質量(μg)/根鮮質量(g)×時間(h)。

應用研磨提取法,并用80%丙酮提取總葉綠素[22],按公式計算葉綠素含量:

葉綠素a含量(mg/g)=(12.7D663 nm-2.59D645 nm)×提取液體積(mL)/1 000×樣品質量(g);

葉綠素b含量(mg/g)=(22.9D645 nm-4.67D663 nm)×提取液體積(mL)/1000×樣品質量(g)。

總葉綠素含量(mg/g)=葉綠素a含量(mg/g)+葉綠素b含量(mg/g)。

1.5 統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 25.0進行。通過方差分析和皮爾遜相關性分析對數據進行分析。為了檢測均值之間差異的統(tǒng)計學意義(α=0.05),進行了鄧肯多重范圍檢驗。

2 結果與分析

2.1 解磷能力評價

定性試驗發(fā)現,菌株H04在分別含有卵磷脂、植酸鈣為唯一磷源的有機磷固體培養(yǎng)基中均能產生明顯的透明圈(圖1),解磷指數分別為1.94和5.89。

定量試驗發(fā)現,當磷源為卵磷脂時,可溶性磷含量在1 d時顯著下降,之后逐漸上升,發(fā)酵4 d后達到最大值(2.89±0.12)mg/L,如圖2-A所示。與初始pH值相比, pH值在1 d時降至最低5.02,2 d 時升至7.93,隨后一直穩(wěn)定在堿性(pH值7.93～8.36),隨著pH值的增加,可溶性磷含量逐漸增多,但兩者相關性不顯著。

如圖2-B所示,當磷源為植酸鈣時,可溶性磷含量逐漸升高,在2 d達到(20.26±1.04)mg/L,并維持至7 d達到峰值(22.99±0.45)mg/L。pH值由0 d時的5.75降至1 d時的2.75,2 d至7 d時維持在2.45～2.90之間?？扇苄粤缀颗cpH值呈負相關關系(P<0.05)。

2.2 解磷機制的研究

2.2.1 磷酸酶活性 為了進一步探討可溶性磷含量的增加與相關酶活性的關系, 對菌株H04的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性進行檢測。結果如圖 3-A 和圖3-B所示,與CK+相比,菌株H04的酸性磷酸酶活性較低,而堿性磷酸酶活性明顯高于陽性對照CK+。菌株H04的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性在3 d同時達到最大值,分別為(17.07±0.14)U/L和(35.20±0.46)U/L。

2.2.2 植酸酶活性 H04的植酸酶活性結果如圖3-C所示。菌株H04的植酸酶活性在3 d時達到最大值,為(1 417.01±48.38)U/L,與CK+相比,菌株H04具有更高的植酸酶活性。

2.3 H04對綠豆和小麥種子早期生長的影響

2.3.1 對綠豆生長的影響 菌株H04對綠豆發(fā)芽率和幼苗生長的影響如表1和圖4所示。與陰性對照(CK-)相比,菌株H04處理增加了綠豆的萌發(fā),發(fā)芽率顯著增加了11%,而綠豆幼苗的鮮質量、根長、根粗和根系活力也顯著提高,分別增加了25%、162%、35%和212%。菌株H04對綠豆生長的影響效果大于陽性對照(CK+),尤其,根長和根系活力效果顯著,分別提高了135%和132%。

表1 H04對綠豆發(fā)芽率和早期生長的影響

2.3.2 對小麥生長的影響 菌株H04對小麥發(fā)芽率和幼苗生長的影響如表2所示。與CK-相比,接種H04可顯著促進小麥種子的萌發(fā), 分別顯著提高發(fā)芽率12%和出苗率17%,而生物量和總葉綠素含量方面無顯著差異。菌株H04對小麥早期生長的促進作用明顯優(yōu)于CK+。

表2 H04對小麥發(fā)芽率、出苗率和早期生長的影響

3 討論

本研究對黏質沙雷氏菌H04的解有機磷(卵磷脂和植酸鈣)能力進行定性和定量測定,初步探究其解磷機制,并初步研究其對輪作作物綠豆和小麥的早期生長的影響,為后續(xù)研究和促生應用提供理論基礎和技術支持。

通過有機磷固體培養(yǎng)基上形成解磷透明圈,作為定性評價細菌解磷能力的依據,是一種有用但非決定性的方法。因此,有必要結合解磷菌在液體培養(yǎng)中的定量試驗來評價其解磷能力[23]。解磷能力的定性和定量試驗的結果表明,H04表現出了降解卵磷脂和植酸鈣的能力,解磷指數分別為1.94和5.89,可溶性磷含量最高分別為(2.89±0.12)mg/L和(22.99±0.45)mg/L。

解磷菌對有機磷的礦化作用主要與酶解作用有關[24]。在以植酸鈣為唯一磷源的發(fā)酵試驗中,H04通過分泌植酸酶降解植酸鈣,并且當培養(yǎng)至3 d時,酶活最高可達(1 417.01±48.38)U/L(圖3-C)。Tang等曾報道黏質沙雷氏菌 SM01能分泌植酸酶(500 U/L)[25],與筆者所在課題組的結果相符。另外,試驗中還發(fā)現,H04通過分泌植酸酶來增溶植酸鈣時,培養(yǎng)液的pH值始終維持在2.81～2.88,表明酸性條件有利于黏質沙雷氏菌H04分泌植酸酶,提高植酸酶活性,促進植酸鈣降解。

到目前為止,黏質沙雷氏菌對卵磷脂解磷機制的研究尚未見報道。在以卵磷脂為唯一磷源的發(fā)酵試驗中,可溶性磷含量在前3 d呈較低的水平,而酸性磷酸酶和堿性磷酸酶在這期間逐漸升至最高,分別為(17.07±0.14)U/L和(35.20±0.46)U/L,其中,酸性磷酸酶活性低于CK+,而堿性磷酸酶活性明顯高于CK+(圖3-A、圖3-B)。這可能是由于低磷水平下,促使H04分泌磷酸酶,磷酸酶的活性升高,促進難溶卵磷脂的分解。此外,H04溶解卵磷脂時,酸性磷酸酶活性較低,在4.57～17.07 U/L之間,而堿性磷酸酶活始終高于酸性磷酸酶,堿性磷酸酶活性在17.47～35.20 U/L之間。這可能是由于培養(yǎng)液的pH值呈堿性(7.93～8.36)更利于堿性磷酸酶發(fā)揮作用。首次發(fā)現黏質沙雷氏菌 H04對卵磷脂的利用與酸性磷酸酶和堿性磷酸酶有關,并主要分泌堿性磷酸酶來降解卵磷脂。

以黏質沙雷氏菌作為微生物菌劑對于單一作物的促生能力已經有所報道。例如Breitkreuz等[26]研究發(fā)現黏質沙雷氏菌(UFV-E13)對番茄的影響,并能提高番茄株高,控制黑斑病。Hameeda等報道,從堆肥中分離出的黏質沙雷氏菌EB67,可提高玉米的生物量(干質量)和玉米籽粒產量[27]。但是目前已報道的黏質沙雷氏菌促生能力研究多集中于種植單一作物,然而農業(yè)生產往往以輪作的形式進行,在農業(yè)生產中,經常選擇豆科植物和禾本科作物輪作增產,這對于減少農業(yè)生產對化學磷肥和農藥的依賴、保護農田生物多樣性以及提高資源利用效率具有重要意義[28-29]。此外,豆科植物還可以通過改變根際土壤磷的含量,促進相鄰禾本科作物對磷的吸收,從而提高磷的利用率[30]。因此,筆者所在課題組進行了H04對豆科作物(綠豆)和禾本科作物(小麥)的種子萌發(fā)和早期生長的影響試驗,將H04分別接種于綠豆和小麥種子,結果表明,H04對綠豆和小麥的生長有積極的影響,如表1、表2、圖4所示。接種H04可提高綠豆幼苗的發(fā)芽率、鮮質量、根長、根粗和根系活力,還可增強小麥的發(fā)芽率和出苗率,特別對綠豆的根長和根系活力,可分別顯著增長135%和132%。H04能更好地促進這2種作物的種子萌發(fā)和生長發(fā)育。因此,黏質沙雷氏菌H04對于2種輪作農作物(豆科作物綠豆與禾本科作物小麥)種子發(fā)育生長起到有益影響,有望成為改善農作物生長的生物可持續(xù)替代品。

4 結論

黏質沙雷氏菌H04在有機磷固體和液體培養(yǎng)基中均表現出良好的利用卵磷脂和植酸鈣的能力。黏質沙雷氏菌 H04通過分泌堿性磷酸酶來分解卵磷脂、分泌植酸酶來分解植酸鈣。對綠豆和小麥的早期生長試驗表明,黏質沙雷氏菌 H04能提高二者的發(fā)芽率和根系生長,特別是對綠豆的促進作用十分顯著。本研究首次報道了黏質沙雷氏菌對于卵磷脂的利用與酸性磷酸酶和堿性磷酸酶有關,并且主要分泌堿性磷酸酶來降解?？傮w結果表明,H04可以作為植物促生菌劑的潛在候選,在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中,特別是豆科作物和禾本科作物輪作系統(tǒng)中表現出巨大的潛力,進一步的開發(fā)利用將證實這種潛力及其未來的商業(yè)應用。