6種生物刺激素對(duì)水稻吸收氯蟲苯甲酰胺的影響

周春麗, 萬(wàn) 群, 程金金, 蔣文奇, 劉嘉楠, 陸 順, 張 國(guó), 于居龍, 曹崇江, 余向陽(yáng)

(1.中國(guó)藥科大學(xué)工學(xué)院,江蘇南京 211198; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇南京 210014;3.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇句容 212400)

近年來(lái),稻縱卷葉螟呈暴發(fā)性發(fā)生,嚴(yán)重危害水稻生產(chǎn)[1]。目前,防治稻縱卷葉螟的方法主要是噴霧[2-4]或施用氯蟲苯甲酰胺顆粒劑[5-6]。此外,于居龍等的研究表明,使用氯蟲苯甲酰胺處理水稻種子可以增強(qiáng)對(duì)稻縱卷葉螟的防治效果并且可長(zhǎng)效防控稻縱卷葉螟,減少前期稻縱卷葉螟防治用藥次數(shù)[1,7-9]。但是拌種處理水稻種子仍舊存在著一些問(wèn)題:一方面是農(nóng)藥容易吸附在土壤中,使得大部分農(nóng)藥沒有被植物的根系吸收,降低了農(nóng)藥的利用率[10];另一方面是田間水分對(duì)藥劑有淋溶作用,使作物為實(shí)際靶標(biāo)的有效利用率大幅度降低[11]。因此,提高農(nóng)藥的利用率,降低種子處理過(guò)程中農(nóng)藥使用量的問(wèn)題亟待解決。

生物刺激素是一種激素類物質(zhì),具有促進(jìn)種子萌發(fā)、提高作物品質(zhì)、增強(qiáng)植物抵抗鹽堿及病蟲害的能力[12]。赤霉素是一種二萜類化合物和植物激素,可激活細(xì)胞分裂以及細(xì)胞增大過(guò)程,可以促進(jìn)作物提前發(fā)芽[13],促進(jìn)根系和莖的伸長(zhǎng)[14];脫落酸能調(diào)控植物的多種生理活動(dòng),使用低濃度的脫落酸浸種水稻種子對(duì)秧苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[15-16];復(fù)合氨基酸可以為作物提供多種氨基酸,促進(jìn)作物合成蛋白質(zhì),促進(jìn)作物的生長(zhǎng);亞精胺屬于脂肪含氮物,楊安中等使用亞精胺浸種發(fā)現(xiàn),亞精胺能提高水稻種子的發(fā)芽率[17];烯效唑浸種可提高稻苗光合效率,使用低濃度的烯效唑可以促進(jìn)種子發(fā)芽[18-20];海藻酸鈉是一種多糖類物質(zhì),張運(yùn)紅等研究發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉可以緩解鎘對(duì)水稻的毒害[21]。

有關(guān)生物刺激素與殺蟲劑混配使用的研究較少。楊富軍等研究發(fā)現(xiàn),使用赤霉素與氯蟲苯甲酰胺進(jìn)行花生種子拌種處理之后,可以增加花生的防治效果[22]。此外生物刺激素與除草劑混配對(duì)除草劑也有增效作用,赤霉素可以增強(qiáng)草甘膦、芐嘧·唑草酮的作用,蕓薹素內(nèi)酯可以增強(qiáng)芐嘧·唑草酮的作用[23-24]。但有關(guān)生物刺激素與氯蟲苯甲酰胺混配拌種處理影響水稻中氯蟲苯甲酰胺含量的研究尚未見報(bào)道。因此,本試驗(yàn)以不添加生物刺激素為對(duì)照,研究6種生物刺激素(赤霉素、脫落酸、氨基酸、亞精胺、烯效唑、海藻酸鈉)分別與氯蟲苯甲酰胺的3個(gè)梯度濃度混配進(jìn)行拌種,旨在研究不同混配組合對(duì)水稻吸收農(nóng)藥的影響,以期提高水稻吸收氯蟲苯甲酰胺的能力,為水稻藥劑拌種減藥增效提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試品種

供試水稻品種為南粳9108。

1.2 儀器與試劑

儀器:QTRAP 5500+液相色譜-質(zhì)譜儀、AB 5500+高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)、Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm,美國(guó)Phenomenex公司)、離心機(jī)(Centrifuge 5804 R,美國(guó)eppendorf公司)、干冰研磨機(jī)。

試劑:20%氯蟲苯甲酰胺(CAP)懸浮劑(美國(guó)杜邦公司生產(chǎn));氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%,德國(guó)Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司);乙腈(色譜純,上海麥克林生化科技有限公司);無(wú)水MgSO4(西隴科學(xué)股份有限公司);C18、PSA分析純(分析純,中國(guó)安譜公司);紅色著色劑;赤霉素、脫落酸、氨基酸、亞精胺、烯效唑、海藻酸鈉(上海源葉生物科技有限公司);6種生物刺激素使用濃度溶液的配制:赤霉素11 g/L、脫落酸1 g/L、氨基酸93.75 g/L、亞精胺14.525 g/L、烯效唑0.2 g/L、海藻酸鈉 10 g/L)。

1.3 種子處理方法

以氯蟲苯甲酰胺100%推薦量、75%推薦量和50%推薦量(最終氯蟲苯甲酰胺藥劑有效用量分別為2.0、1.5、1.0 g/kg種子)3個(gè)濃度拌種作為3個(gè)處理對(duì)照,以不拌藥處理為空白處理,以氯蟲苯甲酰胺(100%推薦量、75%推薦量或50%推薦量)+赤霉素/脫落酸/氨基酸/亞精胺/烯效唑/海藻酸鈉作為試驗(yàn)處理。種子處理方法采用濕拌法,濕拌法參考于居龍等的拌種方法[1],稱取44 kg的水稻種子,放入網(wǎng)袋在清水中將稻種浸泡48 h,瀝干12 h,平均分成22份種子(每份相當(dāng)于2 kg干種子)置于一次性自封袋中,其中1份不做任何處理。氯蟲苯甲酰胺100%推薦量/75%推薦量/50%推薦量+赤霉素/脫落酸/氨基酸/亞精胺/烯效唑/海藻酸鈉6個(gè)試驗(yàn)處理:分別量取20、15、10 g的20%氯蟲苯甲酰胺,加入6種生物刺激素各10 mL于自封袋中,再加入紅色著色劑。3個(gè)對(duì)照處理則以清水代替生物刺激素。各個(gè)處理在添加完藥劑和試劑后快速晃動(dòng)自封袋至整個(gè)袋子中種子出現(xiàn)均勻紅色,即種子與藥液、試劑已充分混勻,平鋪于紙上,陰干后播種。

1.4 田間試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心基地進(jìn)行。各處理的稻種播種在12個(gè)硬質(zhì)塑料育秧盤(60 cm×30 cm×3.5 cm)中,2021年6月7日播種,6月20日大田移栽。各處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)小區(qū),每個(gè)重復(fù)小區(qū)的移栽面積大于75 m2。用單泥埂將重復(fù)小區(qū)分開,用雙泥埂將各處理隔開,各處理單獨(dú)排灌,避免各處理之間的田水串流。各處理在播種后30、60、80、110 d取樣,測(cè)定水稻植株中莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量,并計(jì)算添加生物刺激素處理與未添加生物刺激素處理在水稻生長(zhǎng)全周期中莖和葉組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量的變化量。莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量變化率公式如下:

式中:C1為(100%、75%、50%推薦量+生物刺激素)氯蟲苯甲酰胺殘留量,mg/kg;C2為(100%/75%/50%推薦量)氯蟲苯甲酰胺殘留量,mg/kg。

1.5 氯蟲苯甲酰胺LC-MS/MS分析檢測(cè)方法

1.5.1 儀器方法 液相色譜條件:色譜柱為Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm),進(jìn)樣體積2 μL,柱溫保持40 ℃;流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B),流速為0.3 mL/min,梯度洗脫程序:0～1.0 min,20% B;1.0～2.0 min,20% B;2.0～3.0 min,85% B;3.0～4.0 min,100% B;4.0～5.0 min,100% B;5.0～6.0 min,20% B;6.0～7.0 min,20% B。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源ESI,正離子模式,霧化氣(N2)、輔助氣(N2)為55 psi,離子源溫度為 550 ℃,電噴霧電壓為5.50 kV,定量定性離子對(duì)為484.0/453.0(m/z)。

1.5.2 試驗(yàn)方法 樣本預(yù)處理:五點(diǎn)取樣法每個(gè)處理取一定數(shù)量的水稻,取樣后地上部分莖和葉組織分開處理,干冰研磨機(jī)研磨之后每個(gè)處理稱取1 g樣品,重復(fù)4次,加入乙腈5 mL提取,用移液槍移取1 mL上清液于加有無(wú)水MgSO4(0.15 g)、C18(0.025 g)和PSA(0.025 g)的2 mL離心管中,渦旋混勻30 s,8 000 r/min離心2 min,過(guò)0.22 μm濾膜,待LC-MS/MS測(cè)定。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 用電子天平準(zhǔn)確稱取 0.01 g 的氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,用乙腈溶解配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。以空白水稻的莖、葉提取液為基質(zhì)液,用系列稀釋法將1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至所需的質(zhì)量濃度(0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/L),以質(zhì)量濃度對(duì)峰面積作圖,即得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5.4 添加回收率的測(cè)定 分別稱取莖空白樣品1 g、葉空白樣品1 g,莖、葉分別配制0.05、0.1、1 mg/L 3個(gè)添加水平,重復(fù)3次,按照“1.5.2”節(jié)的提取方法處理之后,用LC-MS/MS 進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算添加回收率。

利用Microsoft Excel 2010與Gradpaph Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)處理均未經(jīng)轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

從表1可以看出,在0.001～1 mg/L范圍內(nèi),氯蟲苯甲酰胺的濃度與儀器響應(yīng)呈良好線性,r2≥0.996。

2.2 準(zhǔn)確度和精密度

從表1可以看出,在水稻莖和葉基質(zhì)中添加不同質(zhì)量濃度的氯蟲苯甲酰胺,平均回收率范圍為83%～97%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.3%～4.4%。實(shí)驗(yàn)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

表1 氯蟲苯甲酰胺在各基質(zhì)的添加回收率

2.3 各處理水稻莖組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量

播種后30、60、80、110 d,對(duì)水稻植株的莖進(jìn)行取樣,并測(cè)定氯蟲苯甲酰胺的殘留量,具體如圖1所示?？梢钥闯?隨著播后時(shí)間增加,莖組織中氯蟲苯甲酰胺殘留量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。6種生物刺激素與氯蟲苯甲酰胺100%推薦量混合拌種后,水稻莖組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻的整個(gè)生育期比對(duì)照多的是添加了赤霉素、氨基酸的處理;與氯蟲苯甲酰胺75%推薦量混合拌種后,水稻莖組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻的整個(gè)生育期比對(duì)照多的是添加了赤霉素、氨基酸、亞精胺的處理;與氯蟲苯甲酰胺50%推薦量混合拌種后,水稻莖組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻的整個(gè)生育期比對(duì)照多的是添加了赤霉素、氨基酸、亞精胺、烯效唑的處理。

2.4 各處理水稻葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量

播種后30、60、80、110 d,對(duì)水稻植株的葉進(jìn)行取樣,并測(cè)定氯蟲苯甲酰胺的殘留量(圖2)?？梢钥闯?隨著播后時(shí)間增加,水稻植株葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量總體呈下降趨勢(shì)。6種生物刺激素與氯蟲苯甲酰胺100%推薦量混合拌種后,水稻葉組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻大部分生育期比對(duì)照多的是添加了赤霉素、氨基酸、海藻酸鈉的處理;與氯蟲苯甲酰胺75%推薦量混合拌種后,水稻葉組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻大部分生育期比對(duì)照多的是添加了赤霉素、氨基酸的處理;與氯蟲苯甲酰胺50%推薦量混合拌種后,水稻葉組織中的氯蟲苯甲酰胺殘留量在水稻大部分生育期比對(duì)照多的是添加了赤霉素、氨基酸的處理。

2.5 各處理水稻莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺殘留量的變化率

表2為6種生物刺激素分別與氯蟲苯甲酰胺100%推薦量、75%推薦量、50%推薦量混合拌種后在水稻的生育期110 d內(nèi)莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺殘留量的變化率。赤霉素、脫落酸、氨基酸、亞精胺、烯效唑、海藻酸鈉與氯蟲苯甲酰胺100%推薦量混合拌種后水稻莖中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對(duì)照分別增加了86%、18%、48%、7%、19%、35%,葉中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對(duì)照分別增加了58%、9%、12%、-46%、-37%、33%;與氯蟲苯甲酰胺75%推薦量混合拌種后水稻莖中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對(duì)照分別增加了112%、37%、69%、45%、29%、13%,葉中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對(duì)照分別增加了8%、21%、34%、-36%、-7%、-5%;與氯蟲苯甲酰胺50%推薦量混合拌種后水稻莖中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對(duì)照分別約增加了98%、39%、88%、91%、121%、14%,葉中氯蟲苯甲酰胺殘留量比對(duì)照分別增加了52%、17%、23%、-26%、-3%、-7%。

表2 6種生物刺激素對(duì)水稻不同生育期氯蟲苯甲酰胺殘留量的變化率

因此,6種生物刺激素分別與100%推薦量、75%推薦量、50%推薦量混合拌種后,赤霉素和氨基酸在水稻大多數(shù)生育期都能夠增加水稻莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量,分別添加赤霉素和氨基酸后,100%、75%、50%推薦量下,水稻莖中氯蟲苯甲酰胺的殘留量分別增加了86%、112%、98%和 48%、69%、88%;葉中氯蟲苯甲酰胺的殘留量分別增加了58%、8%、52%和12%、34%、23%。脫落酸、亞精胺、烯效唑和海藻酸鈉多數(shù)在前期(30～60 d)有少量增加莖或葉中氯蟲苯甲酰胺的殘留量,但在后期(80～110 d)莖或葉中氯蟲苯甲酰胺的殘留量基本沒有增加或者是比對(duì)照少。

3 討論

藥劑處理水稻種子是一種經(jīng)濟(jì)、有效、省工省力的方式,可以達(dá)到長(zhǎng)效、可持續(xù)綠色防控害蟲的效果[25]。近年來(lái),稻縱卷葉螟嚴(yán)重危害水稻的生產(chǎn)[1,26-27]。目前,使用氯蟲苯甲酰胺對(duì)水稻種子進(jìn)行處理可有效防控稻縱卷葉螟。但是種子處理還存在農(nóng)藥利用率低的問(wèn)題,因此,本試驗(yàn)研究了6種生物刺激素(赤霉素、脫落酸、氨基酸、亞精胺、烯效唑、海藻酸鈉)分別與氯蟲苯甲酰100%推薦量、75%推薦量和50%推薦量混合拌種后是否能夠增強(qiáng)氯蟲苯甲酰胺的藥效試驗(yàn)。

本研究表明,6種生物刺激素中,赤霉素和氨基酸分別與各推薦劑量的氯蟲苯甲酰胺混合拌種后能夠明顯增加莖和葉組織中氯蟲苯甲酰胺的殘留量。添加赤霉素后,水稻莖中的氯蟲苯甲酰胺殘留量分別增加了86%、112%、98%,葉中的氯蟲苯甲酰胺殘留量分別增加了58%、8%、52%;添加氨基酸后,氯蟲苯甲酰胺在水稻莖中的殘留量增加了48%、69%、88%,在葉中的殘留量增加了12%、34%、23%。

赤霉素是一種二萜類化合物和植物刺激素。赤霉素除了有促進(jìn)種子萌發(fā)的作用,還具有刺激莖節(jié)間伸長(zhǎng)的作用,其效果比生長(zhǎng)素更為顯著,但不改變節(jié)間數(shù),節(jié)間長(zhǎng)度增加的原因是赤霉素能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂[28]。楊富軍等使用赤霉素與氯蟲苯甲酰胺混合對(duì)花生進(jìn)行拌種,研究發(fā)現(xiàn),添加赤霉素后可以增強(qiáng)對(duì)棉鈴蟲、蠐螬和斜紋夜蛾3種主要花生蟲害的防治效果,還可以提高花生的出苗率以及產(chǎn)量[22]。

另外赤霉素作為激素可以與很多基因的啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá),Li等研究發(fā)現(xiàn),缺乏AP2/ERF家族基因SHOEBOX的水稻植株根分生組織嚴(yán)重變小,這些植物在發(fā)芽后根分生組織中的細(xì)胞較短,并且發(fā)現(xiàn)外源赤霉素的應(yīng)用可以使SHOEBOX的野生型植物的根分生組織細(xì)胞的大小恢復(fù)正常[29]。Ragni等研究發(fā)現(xiàn),赤霉素可以直接刺激擬南芥下胚軸木質(zhì)部擴(kuò)張,從而增加下胚軸的水和溶質(zhì)運(yùn)輸能力,推測(cè)赤霉素可以促進(jìn)水稻木質(zhì)部的擴(kuò)張,從而促進(jìn)了水稻轉(zhuǎn)運(yùn)的能力,從而增強(qiáng)水稻對(duì)氯蟲苯甲酰胺的吸收[30]。Chiba等研究發(fā)現(xiàn),赤霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為NRT1/PTR FAMILY(NPF)蛋白,此蛋白最初被鑒定為硝酸鹽或二/三肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,推測(cè)赤霉素激活了農(nóng)藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),從而增強(qiáng)了水稻對(duì)氯蟲苯甲酰胺的吸收[31]。

葛明惠等發(fā)現(xiàn),在水稻幼苗期施用5%復(fù)合氨基酸增效劑可以顯著增加水稻幼苗的株高、葉綠素含量(SPAD值)、根系生長(zhǎng)指標(biāo)、地上部干質(zhì)量和氮、磷、鉀累積吸收量[32]。曹小闖等使用氨基酸肥水溶液對(duì)水稻浸種,并在水稻的幼苗期、分蘗期、破口前進(jìn)行葉面噴施,發(fā)現(xiàn)可以增加水稻營(yíng)養(yǎng)器官氮素積累量以及葉片氮素向穗轉(zhuǎn)運(yùn),有利于提高水稻對(duì)氮素的利用率。因此,推測(cè)氨基酸通過(guò)提高水稻的健康程度及增強(qiáng)植株抗逆境脅迫能力來(lái)提高對(duì)農(nóng)藥的吸收[33]。

4 結(jié)論

結(jié)果表明,生物刺激素赤霉素和氨基酸分別與氯蟲苯甲酰胺混合拌種處理后可以顯著促進(jìn)水稻對(duì)氯蟲苯甲酰胺的吸收,從而達(dá)到提高防效的目的。因此在水稻種植中,可以將其與藥劑混合進(jìn)行種子處理,促進(jìn)水稻吸收藥劑,增加藥劑的藥效。此外,赤霉素和氨基酸促進(jìn)水稻對(duì)氯蟲苯甲酰胺吸收的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。