基于AQP8、NHE3、CFTR探究參苓白術散對腹瀉幼鼠模型腸黏膜的保護作用及機制

王彥彬，王曉穎，徐國娟，戚敏敏，梁翠才，馬瑋瑋

（河西學院，甘肅 張掖 734000）

腹瀉的臨床發(fā)病率較高，是由于多種原因造成的水、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運失常，常表現(xiàn)為大便次數(shù)增多、大便性狀變化，多發(fā)生于6 個月～2 歲的兒童群體中[1]。水通道蛋白( aquaporins，AQPs) 是腸上皮細胞膜上負責跨細胞轉(zhuǎn)運水分子的主要蛋白[2]。跨膜轉(zhuǎn)運蛋白鈉氫交換體（Na+/H+ exchangers，NHEs）是腸道對Na+的吸收蛋白，可促進腸道對Na+的吸收，進而形成濃度梯度。Cl-的腸道吸收和分泌與囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）通道有關[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，腹瀉時，腸道黏膜中AQPs、NHEs、CFTR 會出現(xiàn)異常表達，使腸道黏膜對H2O、Na+、Cl-的通透性增加，致使水、電解質(zhì)在腸道內(nèi)大量聚集。參苓白術散屬于常用的經(jīng)典中藥方劑，目前廣泛用于小兒腹瀉的治療，多數(shù)患兒可從中獲益。但對于參苓白術散是否可通過影響腸黏膜AQPs、NHEs 和CFTR 的表達來治療腹瀉，目前尚未見報道[5]。本實驗通過檢測腹瀉幼鼠模型結腸黏膜AQP8、NHE3 和CFTR 的表達情況，探討參苓白術散的止瀉作用機制，旨在為參苓白術散治療小兒腹瀉提供現(xiàn)代醫(yī)學理論證據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

購置雄性SD 幼鼠50 只，隨機取10 只設為正常組。其余40 只SD 幼鼠于每日上午予番瀉葉藥液灌胃，連續(xù)干預14 d，建立幼鼠腹瀉模型；建模成功后分為模型組、參苓白術散低、中、高劑量組，每組10 只。50 只SPF 級雄性SD 幼鼠的體重為80 ～100 g，平均（90.00±10.00）g。所有幼鼠均購自甘肅蘭州獸研所。所有幼鼠均進行1 周的適應性喂養(yǎng)，控制室溫在24 ～26℃，自由進食飲水，適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。

1.2 儀器與設備

（1）藥物及試劑：參苓白術散（購于北京德壽堂醫(yī)藥有限公司，人參15 g、茯苓15 g、白術15 g、白扁豆12 g、山藥12 g、蓮子9 g、砂仁6 g、炙甘草9 g）；番瀉葉（購于吉林省松遼制藥有限公司）；AQP8、NHE3、CFTR 一抗（購于北京博奧森生物科技有限公司）；蘇木素- 伊紅（HE）染色液（購于南京建成生物工程研究所）。番瀉葉水煎劑的制備：精確稱取番瀉葉400 g 浸泡于2000 mL 純凈水中，攪拌均勻后靜置30 min；用武火煮沸10 min，使其濃縮至1200 mL，用4 層紗布進行過濾后即完成番瀉葉藥液的制備，藥物濃度最終為0.3 g/mL，置于4℃冰箱中備用。（2）實驗儀器：高速冷凍離心機、電泳儀、電泳槽、UVP凝膠成像系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)、切片機。

1.3 方法

（1）動物分組。將50 只SPF 級雄性SD 幼鼠（體重80 ～100 g）分為正常組、模型組、參苓白術散低、中、高劑量組，每組10 只。除正常組外，其余各組用番瀉葉藥液灌胃，根據(jù)參考文獻[6]確定番瀉葉藥液的濃度為0.3 g/mL。按10 mL/kg 灌胃，每日1 次，連續(xù)干預14 d，建立幼鼠腹瀉模型。正常組予等量蒸餾水灌胃。（2）給藥方法。為參苓白術散低、中、高劑量組使用參苓白術散藥液灌胃，給藥體積均為10 mL/kg ；低劑量組的給藥劑量為1.2 g/kg，中劑量組的給藥劑量為2.3 g/kg ；高劑量組的給藥劑量為4.6 g/kg。正常組、模型組予等量蒸餾水灌胃。各組均連續(xù)灌胃14 d。每3 天完成1 次體重稱量，并動態(tài)調(diào)整藥物劑量。同時，給藥過程中觀察幼鼠情況，并完成糞便的收集。（3）標本采集。對各組幼鼠進行灌胃后，以3.5% 水合氯醛（10 mL/kg）完成麻醉，取遠端結腸組織，常規(guī)清洗，一部分置于福爾馬林液中浸泡，一部分置于-80℃冰箱中凍存。

1.4 觀察指標

（1）幼鼠表征觀察。每日觀察并記錄幼鼠的皮毛色澤、活動狀態(tài)和糞便性狀；稱量幼鼠的體重，計算其腹瀉指數(shù)。（2）HE 染色情況。取各組幼鼠的結腸組織，經(jīng)石蠟組織固定后完成切片的制備，并進行常規(guī)的HE 染色，于光鏡下觀察結腸的病理改變情況[7]。（3）結腸黏膜的AQP8、NHE3 和CFTR 表達。用免疫組織化學法檢測各組結腸黏膜AQP8、NHE3和CFTR 的表達情況。用Western blot 法檢測各組結腸黏膜中AQP8、NHE3 和CFTR 的含量[8]。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組幼鼠的一般情況

2.1.1 幼鼠表征觀察 正常組幼鼠行動靈活，精神狀態(tài)良好，飲食正常，毛發(fā)濃密有光澤，大便正常。與正常組比較，模型組幼鼠行動遲緩，精神萎靡不振，毛發(fā)稀疏，伴有毛發(fā)脫落，肛門紅腫、周圍體毛有少量稀便沾染。與模型組相比，參苓白術散低、中、高組幼鼠的行動靈活性、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度等情況均得到不同程度的改善。見圖1。

圖1 各組幼鼠表征

2.1.2 各組幼鼠體重、腹瀉指數(shù)的比較 正常組幼鼠體重增長迅速，模型組幼鼠體重增長緩慢，且差異明顯（P＜0.05）。參苓白術散各組體重均有明顯的增長；參苓白術散組的腹瀉指數(shù)低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組幼鼠體重、腹瀉指數(shù)的比較（± s）

表1 各組幼鼠體重、腹瀉指數(shù)的比較（± s）

注：a 與正常組比較，P ＜0.05 ；b 與模型組比較，P ＜0.05。

組別 只數(shù) 體重（g）腹瀉指數(shù)造模前 干預后 造模前 干預后參苓白術散組低劑量組 10 102.98±9.52 138.41±15.67ab 0.00±0.00 0.63±0.14ab中劑量組 10 103.11±9.56 140.39±15.69ab 0.00±0.00 0.65±0.16ab高劑量組 10 103.03±9.53 139.63±15.68ab 0.00±0.00 0.64±0.15ab模型組 10 103.52±9.56 114.39±12.31a 0.00±0.00 0.85±0.14a正常組 10 102.99±9.51 142.98±16.72 0.00±0.00 0.00±0.00

2.1.3 各組幼鼠糞便的變化情況 除正常組外，其他組幼鼠在予番瀉葉藥液灌胃3 天后均出現(xiàn)糞便呈濕軟質(zhì)黏狀態(tài)、附著于濾紙上的情況。5 天后糞便成為夾雜黏液的水樣稀便，且排便次數(shù)增加。正常組的糞便為質(zhì)硬橢圓形糞便。與正常組相比，其他組幼鼠的糞便含水量和腹瀉指數(shù)均明顯更高。參苓白術散各劑量組給予相應藥物干預3 天后，糞便基本成形，質(zhì)地濕軟。5 天后糞便皆為成形便，含水量明顯下降，但是與正常組的糞便相比，還是偏松軟。見圖2。

圖2 參苓白術散各劑量組幼鼠的大便性狀

2.2 各組幼鼠結腸黏膜的形態(tài)學變化

與正常組比較，模型組幼鼠的結腸黏膜表皮細胞壞死明顯，且其結腸黏膜伴有毛細血管的擴張，存在少許中性粒細胞的浸潤；與模型組比較，參苓白術散各劑量組幼鼠的結腸黏膜表皮細胞凋亡壞死、固有層毛細血管擴張充血和中性粒細胞浸潤現(xiàn)象明顯改善。見圖3。

圖3 各組幼鼠結腸黏膜的形態(tài)學變化

2.3 免疫組化法檢測AQP8、NHE3 和CFTR 的表達情況

與正常組比較，模型組幼鼠結腸黏膜AQP8、NHE3 的表達下降，CFTR 的表達升高。與模型組比較，參苓白術散各劑量組幼鼠結腸黏膜AQP8、NHE3的表達明顯升高，而CFTR 的表達明顯下降。見圖4。

圖4 免疫組化法檢測AQP8、NHE3 和CFTR 的表達情況

2.4 Westernblot 法檢測AQP8、NHE3 和CFTR的含量

與正常組比較，模型組幼鼠結腸黏膜AQP8、NHE3 的含量減少，CFTR 的含量增加。與模型組比較，參苓白術散各劑量組幼鼠結腸黏膜AQP8、NHE3的含量明顯增加，而CFTR 的含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖5。

圖5 各組幼鼠結腸黏膜中AQP8、NHE3 和CFTR 含量的比較

3 討論

發(fā)生腹瀉時，常會并發(fā)脫水、電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂。結腸是腸道中吸收水和電解質(zhì)的主要場所，AQPs 的作用主要是調(diào)節(jié)胃腸道內(nèi)的水液代謝，維持機體內(nèi)水液含量的相對穩(wěn)定[9]。哺乳類動物的已知AQPs 有13 種。在其胃腸道中，至少存在11 種AQPs。其中AQP1、AQP3、AQP8 在結腸中的表達水平較高，其表達水平能直接影響消化道疾病的發(fā)生和發(fā)展[10]。既往研究表明，AQP1、AQP3、AQP8 的表達水平與結腸的水液代謝有關。NHEs 共有9 個亞型。其能參與上皮細胞鹽的運輸，從而影響細胞中pH值、細胞體積。NHEs 是一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，其生理作用是使Na+轉(zhuǎn)運到細胞外的同時使H+轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。其是腸道對Na+的吸收蛋白，可促進腸道對Na+的吸收，進而形成濃度梯度。Na+是維持組織液、血漿滲透壓、腸黏膜內(nèi)外水電解質(zhì)平衡的關鍵因素[11]。腸道對電解質(zhì)的吸收，主要是建立在對Na+吸收的基礎上。CFTR 是ATP 結合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette，ABC）超家族中的一種，其作用機制的關鍵是為氯離子跨上皮運動提供了選擇性通道[12]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組幼鼠結腸黏膜AQP8 和NHE3 的表達水平顯著降低，而CFTR 的表達水平顯著升高，說明腹瀉可能與AQP8 和NHE3的表達水平降低、CFTR 的表達水平升高有關。與模型組比較，參苓白術散各劑量組幼鼠結腸黏膜AQP8、NHE3 的含量明顯增加，而CFTR 的含量明顯減少，說明參苓白術散可能是通過上調(diào)AQP8 和NHE3 的表達水平、下調(diào)CFTR 的表達水平來起到止瀉的作用。

綜上所述，參苓白術散可通過調(diào)節(jié)幼鼠腸黏膜AQP8、NHE3、CFTR 的表達水平來促進其體內(nèi)的水液代謝，并能減輕結腸黏膜受損，起到止瀉的作用。