梨棗果皮中酚類物質(zhì)高效液相色譜分析方法的確定

王 蕊

（山西運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 運(yùn)城 044000）

0 前言

梨棗含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和多種微量元素。在鮮棗果實(shí)中維生素C 的含量很高，每100 g 鮮果肉中含400～600 mg[1]，高于獼猴桃4～6倍，柑桔10倍，蘋果80倍，梨100倍，同時還富含其它多種維生素。梨棗還含有較多的蛋白質(zhì)以及鐵、鈣、磷等人體不可缺少的礦物質(zhì)元素[2]。20 世紀(jì)80 年代，發(fā)現(xiàn)梨棗中含有豐富的環(huán)磷酸腺苷（cAMP）等物質(zhì)[3-4]?？傊r食棗風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，市場廣闊，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

王如福[5]發(fā)現(xiàn)并首次提出棗在樹上會正常著色，棗采后果皮也會轉(zhuǎn)紅，但是采后轉(zhuǎn)紅的棗與樹上正常著色的棗相比顏色暗淡且無光澤。采后棗果皮的轉(zhuǎn)紅不是正?，F(xiàn)象，可能是一種褐變。李紅衛(wèi)[5]研究發(fā)現(xiàn)棗果皮總酚含量與轉(zhuǎn)紅率顯著相關(guān)，推測酚類物質(zhì)的變化參與了果皮轉(zhuǎn)色。本研究主要研究梨棗果皮7 種酚類物質(zhì)的測定方法的確定，下一步進(jìn)行梨棗果皮轉(zhuǎn)紅酚類物質(zhì)的變化機(jī)理研究。

高效液相色譜測定法（high performance liquid chro-matorgraphy，簡稱HPLC）又稱高壓或高速液相色譜法，于1960 年開始應(yīng)用。它是目前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛、最有效的分離分析技術(shù)之一，具有分辨率高、分析速度快、重復(fù)性好、定量分析精確度高等優(yōu)點(diǎn)，并可用作實(shí)驗(yàn)室小量色譜純樣品的制備。HPLC 是色譜法中的一個重要分支，據(jù)估計，自然界70%以上的化合物均可用高效液相色譜法分析[6]。

本試驗(yàn)將創(chuàng)建一種可同時測定7 種酚類物質(zhì)的高效液相色譜測定法（HPLC），并對棗果果皮中的酚類物質(zhì)進(jìn)行分析測定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以梨棗為試材，自樹體東、南、西、北4 個方向，高度基本一致的果樹上采摘均勻一致的果實(shí)，帶回學(xué)院食品營養(yǎng)與檢測實(shí)驗(yàn)室，用于棗的果皮中酚類物質(zhì)高效液相色譜方法的分析確定。

1.2 測定方法

1.2.1 酚類物質(zhì)的測定

使用Waters 高效液相色譜儀（含1525 二元泵、2487 雙通道紫外檢測器、Breeze 色譜管理軟件等）對果皮酚類物質(zhì)進(jìn)行測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將阿魏酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、綠原酸、沒食子酸7 種標(biāo)樣分別準(zhǔn)確稱取0.01 g，用流動相溶解定容到100 mL 棕色容量瓶中當(dāng)母液（100 mg/L）備用。將各種酚類物質(zhì)的母液，配置成不同系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC 混合測定，獲得它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而建立起已知酚類物質(zhì)濃度與HPLC 峰面積大小之間的函數(shù)關(guān)系。

1.2.3 棗果果皮中酚類物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱取3 g 果皮，研成勻漿，加入30 ml 乙酸乙酯超聲提取30 min，過濾后殘渣加入30 ml 乙酸乙酯，超聲提取3 次。將提取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀調(diào)節(jié)38 ℃蒸干。用甲醇溶解提取物定容至5 ml，置于冰箱-18 ℃保存。上機(jī)前用0.45 μm 過濾器過濾。

1.2.4 精密度試驗(yàn)

同一樣品的各測定值的符合程度為精密度，用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值）表示。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算方法為

式中：

S——標(biāo)準(zhǔn)差；

X——n次重復(fù)測定結(jié)果的算術(shù)平均值；

Xi——n次測定中第i個測定值；

n——重復(fù)測定次數(shù)。

1.2.5 回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)用于評價所用測定方法的準(zhǔn)確度。其計算方法為

式中：

P——加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率；

m——加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量；

X1——加標(biāo)試樣的測定值；

X0——未加標(biāo)試樣的測定值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 軟件進(jìn)行整理，并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的篩選

1）色譜柱的選擇。常見的色譜柱有C18（ODS）和C8這2 種。由于C8填料的碳鏈長度比ODS短，相對極性較強(qiáng)，對極性相近的物質(zhì)分離效果不理想。而梨棗果皮中的多酚物質(zhì)的極性相近，分離時C18柱的柱效明顯高于C8柱[7]。故本試驗(yàn)采用C18柱。由于要測定7 種酚類物質(zhì)，使用長的色譜柱能提高分離度，本試驗(yàn)采用250 mm×4.6 mm，5 μm 的色譜柱可達(dá)到分離度的要求。

2）波長的選擇。配備酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液，用紫外分光光度計在190～400 nm 波長范圍內(nèi)測定7 種酚類物質(zhì)的紫外吸收情況。結(jié)果表明，7 種酚類物質(zhì)在280 nm 均具有較強(qiáng)的吸收,故本試驗(yàn)HPLC測定波長選用280 nm。

3）流動相的選擇。經(jīng)查詢資料得知，酚類物質(zhì)的高效液相色譜分析一般采用一定比例的甲醇—水溶液、乙腈—水溶液或甲醇—乙酸—水溶液作流動相，進(jìn)行梯度洗脫。通過試驗(yàn)表明，選用甲醇—乙酸—水溶液作流動相，酚類物質(zhì)可以得到較好的分離。提高流動相的酸度，可以進(jìn)一步改善分離效果[8]。

在乙酸濃度選擇上，酸度為2%時，酚類物質(zhì)的出峰時間提前，基線較平穩(wěn)，但是各峰之間有擠壓，離得較近；酸度為1%時，各峰分離度較好；酸度為0.6%時，由于酸度不夠，基線不平，所以本試驗(yàn)采用甲醇—超純水(1%乙酸)為流動相。

4）柱溫的選擇。柱溫對分析時間影響較明顯，柱溫低，分析物質(zhì)需要時間長；柱溫高，可縮短分析時間。因此選擇硅烷化鍵合相C18反相柱柱溫為35 ℃。

5）流速的選擇。流速的梯度變化對色譜分離的結(jié)果影響不是很大，而在流速1.00 mL/min時，分離效果最好，所以選擇流速為1.00 mL/min。

6）洗脫方式的選擇。本試驗(yàn)開始選擇了等度洗脫，見圖1，色譜條件為：65%甲醇，35%水（1%乙酸），柱溫35 ℃，流速為1.00 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

圖1 3 種酚類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液等度洗脫色譜圖

配制的3 種酚類物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過HPLC 分析，分離效果非常不好，3 種酚類物質(zhì)中只有2 個明顯的峰值，出峰時間為2.632 min 和3.481 min。接著為了定性，分別對沒食子酸，兒茶素，表兒茶素的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，見圖2 至圖4，這3 種單標(biāo)出峰時間與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時間基本相同。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液等度洗脫色譜圖

圖3 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液等度洗脫色譜圖

圖4 表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液等度洗脫色譜圖

由圖5 可知，混標(biāo)為峰值最高的，3 個與其重疊的是沒食子酸、表兒茶素和兒茶素的色譜圖?；鞓?biāo)及單標(biāo)色譜圖匯總圖表示，不管是混合標(biāo)準(zhǔn)溶液還是單個標(biāo)準(zhǔn)溶液，出峰時間均重疊，3 種酚類物質(zhì)完全沒有分離開，分離度太差，說明等度洗脫不能夠使3 種酚類物質(zhì)達(dá)到基線分離。所以本試驗(yàn)選擇梯度洗脫來進(jìn)行酚類物質(zhì)的分離。

圖5 混標(biāo)及3 種單標(biāo)匯總色譜圖

經(jīng)試驗(yàn)確定，5～40 min內(nèi)，流動相甲醇由5%變化至30%，可使樣品中各待測組分達(dá)到基線分離。最終選定梯度洗脫程序?yàn)椋? min 5 %A，40 min 30 %A，45 min 100 %A，55 min 100 %A，60 min 5 %A，標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度為線性變化。流動相是色譜純甲醇和1%的乙酸水溶液2 部分組成，甲醇溶液在40 min 內(nèi)由5%上升到30%，對酚類物質(zhì)進(jìn)行分離，之后濃度升至100%，并維持10 min，把殘留在色譜柱內(nèi)的一些殘留物洗凈，結(jié)束后回到初始狀態(tài)，進(jìn)行平衡色譜柱，準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣分析。在這一色譜條件下，7 種酚類物質(zhì)達(dá)到基線分離，見圖6。

圖6 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度洗脫色譜圖

2.2 酚類物質(zhì)保留時間

通過對色譜條件的篩選，最終確定了采用檢測波長280 nm；柱溫35 ℃；流速1.00 mL/min；流動相A 為甲醇，流動相B 為超純水（1%乙酸）；并采用梯度洗脫程序：0 min 5 %A，40 min 30 %A，45 min 100 %A，55 min 100 %A，60 min 5 %A，為測定棗果果皮中酚類物質(zhì)的最佳色譜條件，結(jié)果見表1。

表1 酚類物質(zhì)的定性分析

2.3 酚類物質(zhì)的定量分析（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）

將酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品配制成已知含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在確定好的色譜條件下，將配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成5 個濃度梯度,依次進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），得出7 種物質(zhì)的線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)詳見表2。從表2 可以看出，7 種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)都達(dá)到0.99 以上。

表2 酚類物質(zhì)在確定色譜條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 樣品測定

如圖7 所示，將制備好的實(shí)際樣品用上述選擇的流動相、柱溫、流速條件進(jìn)行測定，沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素和阿魏酸在樣品色譜圖中的保留時間分別為5.216、9.004、15.287、18.286、20.103、24.632、33.961 min，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖保留時間5.178、9.138、15.306、18.151、20.072、24.695、34.061 min 基本一致。說明本試驗(yàn)分離純化的樣品和HPLC 色譜條件可以滿足HPLC 對棗果果皮中酚類物質(zhì)的分析測定。

2.5 樣品回收率的測定

加標(biāo)回收試驗(yàn)是分析方法中常用的，也是重要的質(zhì)量控制手段，回收率是決定分析結(jié)果準(zhǔn)確度的量化指標(biāo)。本試驗(yàn)分別將100 μg 的7 種酚類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品加入到樣品中，按樣品分析同樣的步驟經(jīng)HPLC定量計算樣品回收率，并做5 次平行試驗(yàn)，測定結(jié)果如表3 所示。結(jié)果表明，7 種待測酚類物質(zhì)的平均回收率分別為沒食子酸：92.1%；原兒茶酸：95.8%；兒茶素：88.3%；綠原酸：92.8%；咖啡酸：94.5%；表兒茶素：91.4%；阿魏酸：92.6%。這說明本色譜分析方法的加標(biāo)回收率符合定量分析要求，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低，因此上述的酚類物質(zhì)提取和純化方法以及高效液相色譜條件是可行的。

表3 酚類物質(zhì)加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3 討論

在梨棗果皮酚類物質(zhì)測定上，棗果皮酚類物質(zhì)提取尤為重要，下面就棗果皮酚類物質(zhì)提取方面進(jìn)行討論。

1）提取溶劑的選擇上，乙酸乙酯萃取后,進(jìn)行真空濃縮，得到的酚類物質(zhì)純度較高,產(chǎn)品的氧化程度較低[9]，故本試驗(yàn)選用乙酸乙酯來進(jìn)行提取。

2）高溫可以明顯提高萃取效率。加熱提升了細(xì)胞壁的通透性，加強(qiáng)了酚類物質(zhì)的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，降低了溶劑的粘度，有利于提取物透過性。但是，提取溫度過高可能導(dǎo)致酚類物質(zhì)降解，因此提取溫度不超過35 ℃。在提取方式上，有震蕩提取及超聲波提取，由于超聲波可以更快速有效地提取出酚類物質(zhì)。本試驗(yàn)采用超聲波提取。

3）增加提取次數(shù)，提取效率也會增高。比如用50 mL 甲醇溶劑提取6 次比用300 mL 提取1 次更有效。對試驗(yàn)材料進(jìn)行連續(xù)3 次以上的提取才能得到較高的提取率，并且能增大試驗(yàn)材料與提取溶劑接觸面。本試驗(yàn)采用乙酸乙酯超聲波萃取3次，酯相合并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，甲醇定容至5 mL 容量瓶，進(jìn)行酚類物質(zhì)的測定。

4）為保護(hù)色譜儀以及得到更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果，流動相甲醇—乙酸溶液也要過0.45 μm 的濾膜，通過超聲波處理除去流動相里的小氣泡。標(biāo)樣及樣品進(jìn)樣量20 μL，微量進(jìn)樣器內(nèi)嚴(yán)格保證沒有氣泡。

從試驗(yàn)結(jié)果看，7 種酚類物質(zhì)的回收率都在90%以上，而且結(jié)果穩(wěn)定，這充分證明本方法是可靠的。但是，本方法能否應(yīng)用于其它酚類物質(zhì)的測定，還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

本試驗(yàn)以梨棗為材料，建立了高效液相色譜測定棗果果皮7 種酚類物質(zhì)的色譜條件，色譜柱：大連依利特反相C18柱；紫外檢測波長280 nm；柱溫35 ℃；流速1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；流動相A為甲醇，流動相B 為超純水（1%乙酸）；梯度洗脫程序：0 min 5%A，40 min 30%A，45 min 100%A，55 min 100 %A，60 min 5%A。7 種酚類物質(zhì)在40 min 內(nèi)得到了很好的分離，且回收率均較高，RSD值也較低。

本文檢測方法的創(chuàng)建對于檢測梨棗果皮酚類物質(zhì)在采后轉(zhuǎn)紅機(jī)制研究有著重要意義，酚類物質(zhì)是否參與棗果采后褐變，這7 種酚類物質(zhì)在采后棗果轉(zhuǎn)紅過程中的具體變化，均可使用本方法測定梨棗果皮酚類物質(zhì)在樹上正常著色及采后轉(zhuǎn)紅過程中變化對比。