4種天然產(chǎn)物對(duì)福壽螺肝臟和頭足酶活性的影響

岑小鳳，李晶晶

（廣西衛(wèi)健委全生命周期健康與保健研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西環(huán)境暴露組學(xué)與全生命周期健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西 桂林 541199）

【研究意義】福壽螺（Pomacea canaliculata）隸屬于瓶螺科（Ampullariidae）福壽螺屬，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域，是世界性惡性入侵物種[1]。在2003 年被我國國家環(huán)?？偩謱⑵淞腥胧着肭治覈?6 種外來物種的“黑名單”[2]。福壽螺取食容易，導(dǎo)致田間水稻幼苗死亡，并因其繁殖快、繁殖量大等特點(diǎn)給水稻等農(nóng)作物種植和生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重危害和影響[3-4]。除此之外，福壽螺還是人類廣州管圓蟲（Angiostrongylus cantonensis）自然感染或?qū)嶒?yàn)室感染的中間宿主，該線蟲的幼蟲能侵犯人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎[5-6]。關(guān)于福壽螺的防治方法主要有物理防治、化學(xué)防治以及生物防治法[7]，化學(xué)防治仍是主要的防治手段，但缺乏安全性好、殺螺效果佳的防螺藥物。雖有較多的文獻(xiàn)報(bào)道植物提取物對(duì)福壽螺的殺滅效果，但較少研究涉及其有效成分對(duì)福壽螺的殺螺活性和作用機(jī)制的研究[8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，對(duì)植物源殺螺劑的作用機(jī)理研究主要集中在酶活性方面，包括能量代謝相關(guān)酶、轉(zhuǎn)氨酶、神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)酶、磷酸酶以及氧化應(yīng)激相關(guān)酶[9-15]。近年來，蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)被用于研究福壽螺的抗藥機(jī)制和免疫保護(hù)機(jī)制。牟希東等[16]利用iTRAQ 蛋白質(zhì)組技術(shù)發(fā)現(xiàn)，殺螺劑四聚乙醛會(huì)引起氨基酸、賴氨酸等代謝紊亂、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成和肌肉收縮，引起免疫應(yīng)答，造成細(xì)胞凋亡和神經(jīng)毒性。Yu等[17]通過蛋白組學(xué)分析表明，齊墩果酸的脅迫導(dǎo)致福壽螺肝臟葡萄糖代謝、能量合成和蛋白質(zhì)合成的中斷，并觸發(fā)了一系列分子通路，其中包含許多參與免疫過程的關(guān)鍵蛋白。Xiong等[18-20]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，脂多糖干預(yù)后福壽螺氧化反應(yīng)和解毒作用相關(guān)基因表達(dá)的顯著上調(diào)。槲皮素（quercetin）、木犀草苷（luteoloside）、芹菜素（apigenin）和香草酸（vanillic acid）均為多酚類化合物，在植物中含量豐富。國內(nèi)外對(duì)這4種化合物的生物活性研究主要在抗癌、抗肥胖、抗糖尿病、抗菌、抗炎和抗氧化等藥理活性[21-24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在前期研究[25]中筆者首次報(bào)道了白肉榕葉乙醇提取物對(duì)福壽螺的毒殺活性，以及牛耳楓葉甲醇提取物的抑菌活性和殺蟲活性，并從上述兩種提取物中分離鑒定出包括香草酸、芹菜素、槲皮素和木犀草素[26-27]在內(nèi)的10余種化合物。然而，除槲皮素外，這些化合物對(duì)福壽螺的毒殺作用至今未見研究報(bào)道，其殺螺作用機(jī)理仍不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在研究槲皮素、木犀草苷（木犀草素衍生物）、芹菜素和香草酸脅迫對(duì)福壽螺的存活率，福壽螺肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，ALT/GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，AST/GOT）活性，福壽螺頭足中乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、一氧化氮合酶（nitric oxide sythase，NOS）活性的影響，并通過RT-qPCR 技術(shù)測(cè)定福壽螺肝臟和頭足中相關(guān)基因的表達(dá)量，初步探討其作用機(jī)理，以期從中尋找具有開發(fā)潛力的植物源殺螺劑先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試福壽螺：采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院桂北分院桂林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。采集的福壽螺用自來水清洗干凈其表面后，投放入到裝有去氯水的容器中，于室溫（25±2）℃，濕度（60%±5%）條件下飼養(yǎng)7 d后，選用螺殼表面無損傷、大小一致的福壽螺用于試驗(yàn)研究。

試劑及儀器：芹菜素、香草酸、槲皮素和木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度均≥98%，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；茶皂素原粉（60%），中國農(nóng)科院茶葉研究所；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型），碧云天生物技術(shù)有限公司；ALT/GPT 試劑盒、AST/GOT 試劑盒、AChE 試劑盒、NOS 試劑盒購于南京建成生物工程中心；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）以及原肌球蛋白（tropomyosin，TM）引物，廣州維伯鑫生物科技有限公司；Trizol Reagent，美國ambion 公司；Thermo RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit、ABI PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix，美國Thermo Fisher Scientific 公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。101A-1E 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L600臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Varioskan LUX User Manual Chinese 酶標(biāo)儀、NanoDrop 2000、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；分析天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 4 種天然產(chǎn)物溶液的配置 分別準(zhǔn)確稱取一定量的槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸，用適量甲醇溶解后加入去氯水配制成100 mg/L 的溶液（甲醇含量不超過2%），以相同含量的甲醇去氯水做空白對(duì)照。

1.2.2 福壽螺室內(nèi)毒殺活性測(cè)定 參照WHO 室內(nèi)藥劑浸泡法[28]，選擇口徑大小相近的福壽螺，隨機(jī)分為6組，分別為空白組、茶皂素組（對(duì)照藥劑）、槲皮素組、木犀草苷組、芹菜素組和香草酸組。用燒杯盛放500 mL藥液，每杯放入20頭幼螺，放入菜葉作為其食物，杯口用紗布封口以防其逃逸。施藥后24 h觀察和記錄福壽螺死亡情況。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)首先挑選出已經(jīng)明顯開口死亡的福壽螺個(gè)體，對(duì)于一直都緊閉螺殼的福壽螺個(gè)體，可以選擇洗去表面藥物后放于清水中，浮上水面或者懸浮于水中30 min 后，用鑷子尖端輕輕插進(jìn)厴甲與螺殼間隙無任何反應(yīng)的則為死螺[28]。觀察后及時(shí)記錄福壽螺的死亡個(gè)數(shù)，并計(jì)算福壽螺的校正死亡率。

1.2.3 福壽螺肝臟和頭足酶活性的測(cè)定 在藥劑處理24 h后隨機(jī)取6只活福壽螺，去殼后取出福壽螺的肝臟和頭足部分，用濾紙吸干福壽螺組織表面的水分，存置于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩７謩e稱取0.5 g福壽螺肝臟和頭足組織，按福壽螺組織質(zhì)量1∶9 的比例，加入0.9%的生理鹽水，肝臟組織用微量電動(dòng)勻漿器于4 ℃勻漿，頭足組織采用20 mL 玻璃器研磨，將兩者待測(cè)組織勻漿離心分離（4 ℃，3 500 r/min，15 min），然后取上清液采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定福壽螺肝臟和頭足中蛋白質(zhì)濃度，參照試劑盒說明書分別測(cè)定福壽螺肝臟中的ALT/GPT、AST/GOT的酶活性，以及頭足中AChE、NOS的酶活性。

1.2.4 福壽螺肝臟和頭足中基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 參照Trizol 操作說明書提取福壽螺組織中的RNA，然后用NanoDrop 2000 測(cè)定RNA 的濃度和純度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為RT-qPCR 模板。設(shè)計(jì)特異性引物，選擇a-tubulin 作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品的內(nèi)參及目的基因做3 個(gè)復(fù)孔。RT-qPCR 反應(yīng)體系為：1 μL cDNA 模板，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），SYBR Green Master Mix 12.5 μL，dd 水10.5 μL，總體積25 μL。PCR 反應(yīng)程序：50 ℃初始變性2 min，95 ℃變性2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共40 個(gè)循環(huán)。相對(duì)定量采用2-△△Ct法，其中△△Ct＝（Ct目的基因，槲皮素組-Ct內(nèi)參基因，槲皮素組）-（Ct目的基因，空白組-Ct內(nèi)參基因，空白組）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 和SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料使用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。多組間采用One-Way ANOVA 進(jìn)行差異分析，方差檢驗(yàn)齊性用LSD 法，方差不齊性用Games-Howell 法檢驗(yàn)；兩組間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種化合物對(duì)福壽螺的毒殺作用

槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸處理后的福壽螺死亡情況見表2。在100 mg/L 濃度下，處理24 h后，槲皮素的殺螺活性最好，福壽螺死亡率達(dá)到45%，其次為木犀草苷27.3%和芹菜素23.5%，最后為香草酸12.0%。

表2 4種化合物對(duì)福壽螺死亡率的影響Tab.2 Effects of four compounds on the mortality rate of P.canaliculata

2.2 4種化合物對(duì)福壽螺肝臟兩種轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

如圖1所示，與空白相比，槲皮素、木犀草苷、芹菜素、香草酸處理后，福壽螺肝臟中的ALT/GPT 酶活性均顯著下降（P＜0.05），分別降低了72.9%、58.9%、66.8%、66.5%。而福壽螺肝臟中AST/GOT 酶活性均顯著高于空白組（P＜0.05），分別升高了115.5%、103.8%、70.5%和88.2%。

圖1 4種化合物對(duì)福壽螺肝臟ALT/GPT（A）、AST/GOT（B）酶活性的影響Fig.1 Effects of four compounds on the activities of ALT/GPT（A）and AST/GOT（B）in the liver of P.canaliculata

2.3 4種化合物對(duì)福壽螺頭足兩種酶活性的影響

槲皮素、木犀草苷、芹菜素、香草酸處理后，與空白相比，福壽螺頭足中AChE 酶活性分別下降了43.9%、29.6%、24.8%和42.2%，均顯著低于空白組（P＜0.05）。福壽螺頭足中NOS 酶活性顯著下降（P＜0.05），分別比空白組降低了55.9%、38.8%、37.9%和30.2%（圖2）。

圖2 4種化合物對(duì)福壽螺頭足AChE（A）、NOS（B）酶活性的影響Fig.2 Effects of four compounds on the enzyme activities of AChE（A）and NOS（B）in the head-foot of P.canaliculata

2.4 槲皮素處理后福壽螺肝臟SOD、CAT、IDH的mRNA相對(duì)表達(dá)量

如圖3所示，與空白組相比，槲皮素處理下福壽螺肝臟中SOD、CAT的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而IDH的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。

圖3 槲皮素對(duì)福壽螺肝臟SOD、CAT、IDH相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of quercetin on relative expression levels of SOD，CAT and IDH in the liver of P.canaliculata

2.5 槲皮素處理后福壽螺頭足SOD、CAT、TM的mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖4可見，槲皮素處理后，與空白組相比，福壽螺頭足中SOD的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而TM的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。

圖4 槲皮素對(duì)福壽螺頭足SOD、CAT、TM相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of quercetin on relative expression levels of SOD，CAT and TM in the head-foot of P.canaliculata

3 討論與結(jié)論

肝臟是福壽螺解毒的重要器官，其解毒過程涉及到ALT/GPT和AST/GOT這兩種重要的轉(zhuǎn)氨酶，這兩種轉(zhuǎn)氨酶與蛋白質(zhì)代謝密切相關(guān)[29]。其中ALT/GPT 還涉及能量產(chǎn)生的相關(guān)途徑，尤其是三羧酸循環(huán)，AST/GOT 酶活性的高低與肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[30]。本研究中經(jīng)槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸4種天然產(chǎn)物處理后，福壽螺肝臟中ALT/GPT 酶活性均顯著降低，而福壽螺肝臟中AST/GOT 活性均顯著升高。其趨勢(shì)與魚腥草生物堿[31]、白頭翁皂苷[32]和檳榔堿[33]對(duì)釘螺的殺螺實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。說明4 種化合物可能通過影響福壽螺肝臟的蛋白質(zhì)和能量代謝而致其死亡。

福壽螺頭足位于螺體的前端，集中著大量的神經(jīng)元，是最先接觸到藥液的組織，也是受損最嚴(yán)重的部位。乙酰膽堿是生物體中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，AChE 作為水解乙酰膽堿的一種酶，在頭足表皮分布較多[7]，主要參與神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和物質(zhì)代謝，是神經(jīng)細(xì)胞功能和性質(zhì)的重要指標(biāo)。在銀杏葉提取物[33]、檳榔堿[34]，以及氯硝柳胺[35]、滅螺酯[36]等化學(xué)殺螺劑處理釘螺后，觀察到AChE活性下降。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4種天然產(chǎn)物處理后，福壽螺頭足的AChE 活性明顯降低，而AChE 活性降低將會(huì)導(dǎo)致水解乙酰膽堿的速度減慢，乙酰膽堿在突觸間隙堆積，此時(shí)突觸后膜會(huì)持續(xù)性興奮，導(dǎo)致福壽螺的頭足麻痹，外周神經(jīng)和以神經(jīng)為主的腺體生理功能紊亂，最終造成螺的死亡[14,37]。

NO 是一種新型神經(jīng)遞質(zhì)，可作為信號(hào)分子參與軟體動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)，是生物體內(nèi)常見的第二信使[35,38]，而NOS 是催化NO 生物合成的唯一限速酶，研究表明[39]，當(dāng)NOS 活性降低時(shí)，NO 合成受阻，神經(jīng)傳遞受到抑制。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過4種天然產(chǎn)物處理后，福壽螺頭足中NOS活性下降，與李洪軍[40]等使用氯硝柳胺懸浮劑對(duì)釘螺的浸殺實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NOS 活性受到抑制的結(jié)果一致。表明4種天然化合物可能通過干擾神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，降低福壽螺肌肉運(yùn)動(dòng)能力，使福壽螺頭足不能閉合，以增加福壽螺與藥劑的接觸面積，最終導(dǎo)致福壽螺個(gè)體的死亡。

課題組研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)福壽螺存活率和酶活性的影響最為明顯，因此對(duì)槲皮素的殺螺作用機(jī)制開展進(jìn)一步研究。SOD 和CAT 可以防止活性氧自由基對(duì)機(jī)體中生物大分子的氧化損傷，對(duì)清除氧化脅迫過程中產(chǎn)生的活性氧自由基起著決定性作用[41]，SOD、CAT活性的改變，可以反映生物體在不同脅迫條件下的生理狀況[42]。IDH 是三羧酸循環(huán)中的限速酶[43]，TM 能調(diào)控肌鈣蛋白復(fù)合物和肌動(dòng)蛋白之間的相互作用，起到調(diào)節(jié)肌肉收縮的作用[44]。本研究RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)槲皮素處理后，福壽螺肝臟和頭足中的SOD、CAT 的mRNA 表達(dá)上調(diào)，而肝臟中IDH 和頭足中TM 的mRNA 表達(dá)水平降低。表明槲皮素能引起福壽螺的氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響福壽螺正常能量代謝和肌肉運(yùn)動(dòng)功能。

天然活性化合物庫的分子結(jié)構(gòu)多樣性是新藥物開發(fā)的源泉。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已確定具有生物活性的天然產(chǎn)物在20 萬種以上，其中有生物活性的植物天然產(chǎn)物有10 萬種，占所有天然產(chǎn)物的一半[45]。植物源殺螺藥物具有低毒、易降解等優(yōu)點(diǎn)，利用植物次生代謝產(chǎn)物成功防治有害生物的例子很多，如印楝素、魚藤酮、煙堿等植物源農(nóng)藥已市場化很多年，在田間廣泛使用。然而，目前已成功推廣應(yīng)用的植物源殺螺藥物極少，研究與開發(fā)新的植物源殺螺劑，具有極其廣闊的市場前景。槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸是廣泛存在于植物的根、莖、葉中。在前期篩選的植物中，白肉榕和牛耳楓都具有開發(fā)成為植物源農(nóng)藥的潛力，筆者從中分離出了與這些植物防治效果一致的活性化合物，開發(fā)高效安全的殺螺藥物可能性很大。

綜上所述，本研究結(jié)果表明槲皮素、木犀草苷、芹菜素和香草酸可以降低福壽螺肝臟中ALT/GPT 的活性，升高AST/GOT 的活性，影響福壽螺肝臟組織的正常生理功能；同時(shí)抑制福壽螺頭足神經(jīng)系統(tǒng)中AChE、NOS的酶活性，影響福壽螺頭足的正常神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)。RT-qPCR 測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)槲皮素處理后福壽螺肝臟中SOD、CAT 酶的mRNA 表達(dá)量和頭足中SOD 酶的mRNA 表達(dá)量上升，肝臟中IDH 酶和頭足中TM 的mRNA 表達(dá)量下降。這些為4種天然產(chǎn)物在防治福壽螺方面的應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。