博落回生物堿與茶皂素對(duì)2 種茶葉病原菌的聯(lián)合毒力測(cè)定

梁浩，杜曉靜,錢(qián)璽丞，賈長(zhǎng)青，郁建生

（銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院國(guó)家民委中獸藥重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，貴州 銅仁 554300）

茶樹(shù)是我國(guó)南方地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[1]，因其口感獨(dú)特和保健作用，深受廣大消費(fèi)者青睞。由于茶農(nóng)依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥防治茶樹(shù)病蟲(chóng)害，極易造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)。農(nóng)藥殘留已成為我國(guó)茶葉出口歐盟的技術(shù)性壁壘[2]，尋找高效低殘留無(wú)公害農(nóng)藥防治茶樹(shù)病蟲(chóng)害至關(guān)重要。

茶輪斑病和炭疽病是貴州茶區(qū)發(fā)病范圍較廣的重要病害，因缺乏安全有效的防控措施，嚴(yán)重影響著茶樹(shù)生長(zhǎng)和翌年春茶產(chǎn)量[3-4]。目前防治這兩種病害的生物農(nóng)藥較少，主要通過(guò)化學(xué)藥劑防治?；瘜W(xué)農(nóng)藥長(zhǎng)期使用不僅污染環(huán)境，還會(huì)產(chǎn)生抗性問(wèn)題。為確保茶葉的品質(zhì)和安全，篩選出高效安全低毒的農(nóng)藥迫在眉睫[5-6]。

近年來(lái)，植物源農(nóng)藥因其低毒、低殘留和多靶標(biāo)等特點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。作為一種低成本高效的植物源農(nóng)藥，博落回生物堿在防治多種農(nóng)作物病蟲(chóng)害方面表現(xiàn)出了良好的殺蟲(chóng)和抑菌活性[7]。茶皂素作為一種植物源農(nóng)藥，雖然自身抑菌活性不高，但研究表明其對(duì)多種農(nóng)藥都表現(xiàn)出了較好的增效作用，通過(guò)與其他農(nóng)藥復(fù)配，可大大減少農(nóng)藥的用量[8-10]。

據(jù)此，本研究測(cè)定了博落回生物堿和茶皂素2種單劑及其不同比例的混和劑對(duì)茶輪斑病菌和茶炭疽病菌的室內(nèi)毒力以及增效作用，旨在為茶皂素和博落回生物堿對(duì)這兩種病害的田間防治提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

茶輪斑病和茶炭疽病均分離于正大現(xiàn)代高效茶葉示范園區(qū)，經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司鑒定。

1.2 主要材料與試劑

博落回生物堿（純度為76%），參照文獻(xiàn)[11]自制；茶皂素（65%；上海源葉生物科技有限公司）；葡萄糖、瓊脂粉等其他試劑為市售分析純?cè)噭?/p>

1.3 主要儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(jī)（KQ800E，昆山市超聲儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（T10CS，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD，蘇州凈化工作臺(tái)設(shè)備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（YM50，上海三申醫(yī)療器械有限公司）；恒溫恒濕箱（HWS450B，杭州綠博儀器有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 室內(nèi)離體活性測(cè)試 用無(wú)菌水將2 種藥劑配置成100 μg·mL-1的溶液。采用菌落直徑法。在含藥PDA 培養(yǎng)基平板中央分別接供試菌種的新鮮菌絲塊菌碟，菌絲朝下（每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)）。將含藥接菌的培養(yǎng)皿放置于25 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)，定期觀察，采用十字交叉法測(cè)菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.4.2 博落回生物堿與茶皂素對(duì)兩種病原菌的EC50值 測(cè)定博落回生物堿與茶皂素對(duì)2 種植物病原菌的EC50值時(shí)，采用菌落直徑法，設(shè)置5 個(gè)濃度梯度，計(jì)算各個(gè)濃度下對(duì)2 種植物病原菌的抑制率，通過(guò)計(jì)算，得出測(cè)定博落回生物堿與茶皂素對(duì)2 種植物病原菌的EC50值。

1.4.3 博落回生物堿與茶皂素最佳配比篩選 采用Horsfal 方法[12-13]進(jìn)行混配比例設(shè)計(jì)，以博落回生物堿與茶皂素2 種單劑的的EC50為基礎(chǔ)濃度，將2 種藥劑EC50藥液按照體積比和空白對(duì)照共設(shè)置12 個(gè)處理進(jìn)行測(cè)定（100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、0∶100、0∶0），見(jiàn)表1。每處理3 個(gè)重復(fù)，采用十字交叉法參照1.4.1 計(jì)算各配比抑制率，再根據(jù)以下公式計(jì)算毒性比率（毒性比率＞1.25 為增效；毒性比率＜0.75 為拮抗；0.75≤毒性比率≤1.25 為相加）。在此基礎(chǔ)上，初步篩選出最佳配比。

表1 各處理博落回生物堿與茶皂素EC50 值劑量百分比

1.4.4 最佳配比聯(lián)合毒力測(cè)定 采用Wadley 法[14]定量篩選，根據(jù)初步篩選出的最佳配比（1.4.3 試驗(yàn)結(jié)果），將有增效作用的體積配比進(jìn)行混合測(cè)定聯(lián)合毒力并計(jì)算混劑的增效系數(shù)SR（SR＞1.5 為增效，0.5≤SR≤1.5 為相加，SR＜0.5 為拮抗），評(píng)價(jià)復(fù)配劑增效比。

式中，EC50(ob)(A)、EC50(ob)(B)分別代表混劑中博落回生物堿和茶皂素的EC50實(shí)測(cè)值；EC50(ob)（實(shí)測(cè)值）、EC50(th)（理論值）；a（博落回生物堿的百分含量%）、b（茶皂素在混劑中的百分含量%）；SR 代表增效系數(shù)。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析 采用orgin 9.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算各處理平均菌落直徑和平均抑制率；采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對(duì)藥劑濃度對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的菌絲生長(zhǎng)抑制率幾率值進(jìn)行回歸分析，求出各單劑及其不同配比混劑的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r 和EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)離體活性測(cè)試

抑菌活性測(cè)定結(jié)果表明（表2），博落回生物堿對(duì)茶輪斑病和茶炭疽病均表現(xiàn)出了較好的抑菌活性，其中，對(duì)茶輪斑病的抑菌活性高于同濃度的多菌靈和吡唑醚菌酯。

表2 博落回生物堿與茶皂素對(duì)2 種病原菌離體活性測(cè)試100（μg·mL-1）

2.2 博落回生物堿與茶皂素對(duì)2 種病原菌的EC50 值

由表3 可知，博落回生物堿對(duì)2 種茶樹(shù)病原菌均有較好的抑菌活性，EC50值分別為6.219、51.674 μg·mL-1；茶皂素對(duì)2 種病原菌的抑菌活性較差，EC50值分別為416.435、453.925 μg·mL-1。

表3 博落回生物堿與茶皂素對(duì)2 種植物病原菌EC50 值

2.3 博落回生物堿與茶皂素最佳配比篩選

以單劑博落回生物堿與茶皂素的近似EC50值為基礎(chǔ)，采用采用交互測(cè)定法進(jìn)行最佳配比的篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明（表4），在所選配比中，博落回生物堿與茶皂素EC50體積比90∶10、80∶20、60∶40、50∶50、30∶70、20∶80、10∶90 對(duì)茶輪斑病菌的毒性比率分別為1.07、1.08、1.15、1.15、1.13、1.17、1.11，表現(xiàn)為相加作用，當(dāng)博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例為70∶30、40∶60 時(shí)，對(duì)茶輪斑病菌的毒性比率分別為1.32、1.41，表現(xiàn)為增效作用；當(dāng)博落回生物堿與茶皂素EC50體積比90∶10、80∶20、10∶90 對(duì)茶炭疽病菌的毒性比率分別為0.98、1.20、1.21，表現(xiàn)為相加作用，當(dāng)博落回生物堿與茶皂素EC50值體積比為70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80 時(shí)，對(duì)茶炭疽菌的毒性比率分別為1.29、1.39、1.52、1.64、1.70、1.67，表現(xiàn)為增效作用。綜合以上結(jié)果，對(duì)茶輪斑病菌分別取博落回生物堿與茶皂素EC50值體積比70:30、40:60，對(duì)茶炭疽菌分別取博落回生物堿與茶皂素EC50值體積比70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80 作聯(lián)合毒力驗(yàn)證。

表4 博落回生物堿與茶皂素不同比例混劑對(duì)2 種病原菌的毒性比率

2.4 最佳配比聯(lián)合毒力測(cè)定

結(jié)合2 個(gè)單劑的EC50值，根據(jù)Wadley 法計(jì)算博落回生物堿與茶皂素不同比例混劑理論上的EC50(th)，并與實(shí)際觀察的EC50(ob)比較，計(jì)算增效系數(shù)(SR)。由表5 可知，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例40∶60 配比混劑對(duì)茶輪斑病菌的增效系數(shù)為1.095，均介于0.5～1.5 之間，表現(xiàn)為相加作用，比例40∶60 配比混劑對(duì)茶輪斑病菌的增效系數(shù)為1.545，大于1.5，表現(xiàn)為增效作用。博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例30∶70、20∶80 配比混劑對(duì)茶炭疽病菌的增效系數(shù)為1.181、0.616，均介于0.5～1.5 之間，表現(xiàn)為相加作用，比例70∶30、60∶40、50∶50、40∶60 配比混劑對(duì)茶炭疽病菌的增效系數(shù)為2.698、2.345、2.974、1.533，均大于1.5，表現(xiàn)為增效作用。

表5 博落回生物堿與茶皂素不同比例混劑對(duì)2 種病原菌的聯(lián)合毒力

3 討論與結(jié)論

研究表明，農(nóng)藥合理混配不但可以延緩藥劑抗性的發(fā)生和發(fā)展，亦可擴(kuò)大防治譜，提高防效，降低單位面積內(nèi)的用藥, 將不同作用機(jī)理的殺菌劑復(fù)配表現(xiàn)出優(yōu)于單劑的防治效果，極大地促進(jìn)了復(fù)配殺菌劑的快速發(fā)展[15-16]。目前博落回生物堿對(duì)茶樹(shù)病害活性研究方面主要集中在對(duì)茶樹(shù)蟲(chóng)害的防治，對(duì)茶樹(shù)病害的防治較少[17-19]。茶皂素對(duì)茶輪斑病、茶白星病和茶炭疽病均有一定的防治效果[20]，最近國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者報(bào)道了茶皂素對(duì)農(nóng)藥的增效作用[21]，茶皂素與山蒼籽油、代森錳鋅和多菌靈復(fù)配，對(duì)茶葉炭疽病和輪斑病顯示出明顯的增效作用[22-23]。

本試驗(yàn)研究了博落回生物堿與茶皂素單劑和復(fù)配對(duì)茶輪斑病菌和茶炭疽病菌的抑菌活性，結(jié)果表明博落回生物堿對(duì)茶樹(shù)輪斑病和茶樹(shù)炭疽病的EC50分別為6.219、51.674 μg·mL-1；茶皂素對(duì)茶樹(shù)輪斑病和茶樹(shù)炭疽病的EC50分別為416.435、453.925 μg·mL-1；通過(guò)毒性比率篩選和聯(lián)合毒力測(cè)定，確定了博落回生物堿與茶皂素對(duì)2 種病原菌的最佳抑菌配比。針對(duì)茶輪斑病菌，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例為70∶30（質(zhì)量比為1∶28.7）的增效系數(shù)最大，可作為最佳配比；針對(duì)茶炭疽病菌，博落回生物堿與茶皂素EC50值劑量比例為50∶50（質(zhì)量比為1∶8.8）的增效系數(shù)同樣最大，但該配比混劑中博落回生物堿的實(shí)際含量明顯高于70∶30、60∶40 配比；從降低農(nóng)藥使用成本等方面考慮，茶皂素價(jià)格遠(yuǎn)低于博落回生物堿，因此選擇博落回生物堿與茶皂素EC50值體積比例為70∶30（質(zhì)量比為1∶3.8）進(jìn)行混配較為合理[12]。本試驗(yàn)可以為茶葉炭疽病和茶葉輪斑病綠色防治提供科學(xué)的參考。最近國(guó)內(nèi)外報(bào)道了茶皂素作為一種非離子型表面活性劑，可進(jìn)一步增強(qiáng)農(nóng)藥在生物體表面粘著力和劑在靶體表面的持留能力，從而提高農(nóng)藥對(duì)病害的田間防治效果[10]。但是關(guān)于博落回生物堿和茶皂素在茶園的田間協(xié)同防治效果還亟需進(jìn)一步開(kāi)展田間防效研究，還需結(jié)合對(duì)非靶標(biāo)生物的安全性及其對(duì)茶園天敵昆蟲(chóng)等有益生物的影響，這將對(duì)茶園科學(xué)防控和綠色防控具有重要的指導(dǎo)意義。