基于GABA信號(hào)通路探究柏子養(yǎng)心湯對(duì)失眠大鼠睡眠時(shí)相的影響

譚高峰,喬明亮,郭 健,鄭偉鋒,趙彥青,張希倩

0 引言

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 124只健康雄性SPF級(jí)6～7周齡Sprague Dawley(SD)大鼠,體重(200±20) g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001。所有大鼠在河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),許可證號(hào)：SYXK(豫)2021-0018,于12 h光暗循環(huán)、溫度20～22 ℃和濕度50%～55%的房間中飼養(yǎng),喂食期間大鼠可自由飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào)：HNZYY20210819)。

1.2 主要藥品、試劑及儀器 柏子養(yǎng)心湯：柏子仁10 g,遠(yuǎn)志10 g,酸棗仁20 g,黨參20 g,枸杞子15 g,黃芪20 g,當(dāng)歸10 g,白芍10 g,五味子10 g;飲片購(gòu)自河南省中醫(yī)院,常規(guī)方法煎煮,雙層棉紗布進(jìn)行過(guò)濾,收集濾液并文火煎煮濃縮制成2 g生藥/ml的水提物,分裝后4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。?duì)氯苯丙氨酸(Para-chlorophenylalanine,PCPA)(C6506)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;大鼠GABA檢測(cè)試劑盒(FS-E6774)購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司;大鼠Glu檢測(cè)試劑盒(AKAM002U)購(gòu)自北京盒子生工科技有限公司;兔源一抗谷氨酸脫羧酶67(Glutamate decarboxylase 67,GAD67)(ab213508)、γ-氨基丁酸A型(γ-aminobutyric acid type A receptor,GABAA)受體α1(GABRA1,ab252430)、GABAA受體β2(GABRB2,ab156000)、GABAA受體γ2(GABRG2,ab288564)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。71000全自動(dòng)腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);SleepSign動(dòng)物睡眠生物解析系統(tǒng)(日本KisseiComtec公司);Multiskan GO酶標(biāo)儀(Thermo Scientific,美國(guó));BX61光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);ABI Prism 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.3 主要方法

1.3.1 腦電圖(Electroencephalogram,EEG)和肌電圖(Electromyogram,EMG)電極埋置 用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠并固定在腦立體定位儀中,暴露頭骨。參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[13]將2個(gè)螺釘電極(直徑1 mm)植入顱骨(AP-2,R2;AP+2,R2)作為皮層電極,另一個(gè)置于額骨中心(AP+5,R0)作為皮層電極接地電極。皮層電極必須接觸硬腦膜,但不穿破硬腦膜。電極通過(guò)引線連接到微型插座上,并用牙科丙烯酸水泥固定在頭骨上。將2根采集EMG的電極分別插入兩側(cè)頸部斜方肌中[14]。術(shù)后,將大鼠放入單獨(dú)的有機(jī)玻璃盒中,并在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)在電磁屏蔽記錄室中。每只大鼠腹腔注射45 000 U青霉素3 d預(yù)防感染,每天1次?；謴?fù)7 d后,測(cè)試前,將附有EEG記錄導(dǎo)線的插頭連接到大鼠頭部電極插座5.5 h以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件。

1.3.2 模型的建立 PCPA混懸液配置：NaHCO3片劑用30～40 ℃的溫水溶解,調(diào)配成濃度為5%的NaHCO3溶液,在一定量生理鹽水中緩慢滴加配置好的NaHCO3溶液,在滴入過(guò)程中用pH精密試紙測(cè)試,將pH值調(diào)至7～8之間。然后加入PCPA,攪拌后加阿拉伯膠,再用超聲處理15 min即可。將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=24)和造模組(n=100),參考文獻(xiàn)方法[15]建立失眠大鼠模型：將PCPA用生理鹽水溶解,造模組大鼠于每日上午8至9點(diǎn)以300 mg/kg的劑量腹腔注射PCPA溶液,注射體積為10 ml/kg,每天1次,連續(xù)注射2 d。對(duì)照組注射等量生理鹽水。第2次注射PCPA后12 h,觀察造模組大鼠的狀態(tài),并將對(duì)照組和造模組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50 mg/ml)進(jìn)行戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn),記錄大鼠睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間。若大鼠出現(xiàn)躁動(dòng)不安,晝夜節(jié)律紊亂,對(duì)外界聲、光等刺激敏感性增加,且戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,造模組大鼠的睡眠時(shí)間縮短、睡眠潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05),提示造模成功。實(shí)驗(yàn)共造模100只大鼠,有96只大鼠成功建立失眠模型。

1.3.3 分組與給藥 將96只失眠大鼠隨機(jī)分為模型組及柏子養(yǎng)心湯低、中、高劑量組,每組24只。柏子養(yǎng)心湯組大鼠分別給予5.625 g/kg、11.25 g/kg、22.5 g/kg的柏子養(yǎng)心湯灌胃,對(duì)照組和模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃,每天1次,連續(xù)7 d。柏子養(yǎng)心湯劑量換算：根據(jù)人和動(dòng)物的體表面積計(jì)算藥物的等效劑量(大鼠日劑量約為成人的6.3倍)。成人體重以70 kg計(jì)算,柏子養(yǎng)心湯成人每日給藥劑量相當(dāng)于生藥125 g,則大鼠每日給藥劑量為125 g/70 kg×6.3=11.25 g/kg。因此,設(shè)置藥物低、中、高劑量為5.625 g/kg、11.25 g/kg、22.5 g/kg。

1.3.4 大鼠一般活動(dòng)狀態(tài) 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤和晝夜節(jié)律變化以及活動(dòng)情況,給藥結(jié)束后稱量體重。

1.3.5 大鼠睡眠時(shí)相分析 末次給藥后2 h,將大鼠置于安靜的實(shí)驗(yàn)室,連接動(dòng)物睡眠生物解析系統(tǒng),從第1天19∶00開(kāi)始,到次日19∶00結(jié)束,連續(xù)記錄自由活動(dòng)大鼠的EEG和EMG,分析睡眠覺(jué)醒(Wake)時(shí)間、非快速眼動(dòng)(Non-rapid eye movement,NREM)睡眠時(shí)間和快速眼動(dòng)(Rapid eye movement,REM)睡眠時(shí)間,觀察大鼠睡眠時(shí)相變化。睡眠Wake以8 Hz以上α和β波為主,伴有明顯的EMG信號(hào);NREM睡眠以0.5～4 Hz δ波為主,EMG信號(hào)不明顯;REM睡眠以4～8 Hz θ波為主,EMG信號(hào)基本沒(méi)有[14]。根據(jù)判定結(jié)果,統(tǒng)計(jì)夜晚(19∶00～次日7∶00)和白天(次日7∶00～19∶00)大鼠Wake總量和NREM、REM睡眠總量。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)大鼠下丘腦5-HT、Glu與GABA含量 每組隨機(jī)選取6只大鼠,取出全腦后分離下丘腦(將大鼠腦組織翻轉(zhuǎn)后可見(jiàn)2個(gè)對(duì)應(yīng)的菱形突起,用眼科剪左右各剪2刀,深度約1～2 mm,然后取出即可),濾紙吸干后稱重,稱重后用PBS研磨(按1∶9的重量體積比)制備10%的組織勻漿,在4 ℃下1 000 g離心15 min。收集上清液,采用ELISA試劑盒檢測(cè)下丘腦中5-HT、Glu與GABA含量。

1.3.7 免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)大鼠下丘腦GAD67表達(dá) 每組隨機(jī)選取6只大鼠的下丘腦,用4%多聚甲醛固定過(guò)夜,經(jīng)梯度乙醇脫水后,用石蠟包埋并連續(xù)切5 μm厚的切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,用3%過(guò)氧化氫處理10 min,微波法進(jìn)行抗原修復(fù),正常山羊血清封閉20 min。然后將切片與一抗GAD67(1∶100)在4 ℃下孵育過(guò)夜,PBS清洗后,滴加二抗在37 ℃下孵育30 min;DAB顯色、蘇木精復(fù)染。最后,二甲苯透明,封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察GAD67陽(yáng)性表達(dá)(細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色染色),每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野,計(jì)數(shù)每個(gè)視野中GAD67陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度(Average optical density,AOD)值。

1.3.8 Western blot檢測(cè)下丘腦GABAA受體亞基(GABRA1、GABRB2和GABRG2)蛋白表達(dá) 每組隨機(jī)選取6只大鼠,斷頭取腦,分離下丘腦,液氮速凍后,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液盒提取下丘腦組織中的總蛋白。將等量的總蛋白加到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上,通過(guò)電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h后,與一抗GABRA1(1∶1 000)、GABRB2(1∶1 000)、GABRG2(1∶1 000)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin,1∶2 000)在4 ℃下孵育過(guò)夜。然后洗滌膜并在室溫下與結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(1∶5 000稀釋)孵育1 h。最后,使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯影,Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。β-actin用作內(nèi)參對(duì)照。

1.3.9 RT-qPCR檢測(cè)下丘腦組織中GABAA受體亞基(GABRA1、GABRB2和GABRG2)mRNA表達(dá) 每組剩余6只大鼠,取下丘腦組織,Trizol試劑提取總RNA,然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用Green Premix PCR試劑盒在ABI Prism?7500型RT-qPCR儀上將該cDNA用作擴(kuò)增的靶標(biāo)。熱循環(huán)方案：95 ℃ 10 min,然后95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s和72 ℃ 10 s的50個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt(Ct為循環(huán)閾值)方法計(jì)算基因表達(dá),并將靶基因的相對(duì)表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)和體重變化 對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好,毛發(fā)有光澤,晝夜節(jié)律明顯,白天活動(dòng)較少;與對(duì)照組相比,模型組大鼠精神狀態(tài)較差,毛發(fā)凌亂枯黃、無(wú)光澤,晝夜節(jié)律消失,白天活動(dòng)增多,對(duì)外界的反應(yīng)增強(qiáng),體重顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養(yǎng)心湯低、中、高劑量組大鼠精神和活動(dòng)狀態(tài)明顯改善,毛發(fā)有光澤,體重顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見(jiàn)表2。

2.2 各組大鼠睡眠時(shí)相變化 與對(duì)照組相比,模型組Wake總量顯著增加,NREM和REM睡眠總量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養(yǎng)心湯低、中、高劑量組Wake總量顯著減少,NREM和REM睡眠總量顯著增加(P<0.05),且呈劑量依賴性。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠體重比較

表3 各組大鼠夜晚和白天Wake、NREM和REM睡眠總量比較

2.3 各組大鼠下丘腦中5-HT、Glu與GABA含量 與對(duì)照組相比,模型組大鼠下丘腦中Glu含量和Glu/GABA比值顯著升高,5-HT、GABA含量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養(yǎng)心湯低、中、高劑量組Glu含量和Glu/GABA比值顯著降低,5-HT、GABA含量顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠下丘腦中5-HT、Glu與GABA含量比較

2.4 各組大鼠下丘腦中GAD67表達(dá) 與對(duì)照組相比,模型組大鼠下丘腦中GAD67陽(yáng)性表達(dá)顯著減少(P<0.05);與模型組相比,柏子養(yǎng)心湯低、中、高劑量組GAD67陽(yáng)性表達(dá)顯著增加(P<0.05),且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖1、表5。

圖1 各組大鼠下丘腦中GAD67表達(dá)(IHC,200×)

表5 各組大鼠下丘腦中GAD67表達(dá)比較

2.5 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比,模型組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養(yǎng)心湯低、中、高劑量組GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見(jiàn)圖2、表6。

圖2 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白表達(dá)

表6 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2蛋白水平比較

2.6 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2 mRNA表達(dá) 與對(duì)照組相比,模型組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,柏子養(yǎng)心湯低、中、高劑量組GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平顯著升高(P<0.05),且呈劑量依賴性。見(jiàn)表7。

表7 各組大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB2和GABRG2的mRNA水平比較

3 討論

中醫(yī)稱失眠為“不寐”、“目不瞑”、“不得眠”、“不得臥”,年老體虛,情志失常,飲食不節(jié),勞逸失度等為其常見(jiàn)病因;病位在心,與肝、脾、腎密切相關(guān)[16-17]。柏子養(yǎng)心湯被廣泛應(yīng)用于失眠的治療[6-7]。柏子養(yǎng)心湯為中醫(yī)經(jīng)典方劑,由柏子仁、酸棗仁、黨參、黃芪、當(dāng)歸、茯苓、遠(yuǎn)志、五味子等中藥組成。方藥中柏子仁、酸棗仁為君藥,有養(yǎng)心安神之效;黨參、黃芪可健脾益氣、溫補(bǔ)元?dú)?、促使陰?yáng)平衡;當(dāng)歸活血補(bǔ)血;茯苓、遠(yuǎn)志能補(bǔ)心安神;五味子補(bǔ)益心腎、寧心安神;諸藥合用共奏補(bǔ)益心腎、調(diào)整陰陽(yáng)、寧心安神的功效,能從根本上調(diào)整患者狀態(tài),改善睡眠質(zhì)量?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,柏子仁可通過(guò)增加GABA水平發(fā)揮抗焦慮作用[8];酸棗仁-茯苓-黨參水提物能調(diào)節(jié)小鼠腦內(nèi)Glu/GABA穩(wěn)態(tài),改善失眠小鼠的睡眠質(zhì)量[10];當(dāng)歸的活性成分當(dāng)歸多糖能夠升高GABA水平,調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo),改善小鼠抑郁行為[11];遠(yuǎn)志可升高失眠大鼠下丘腦GABA含量,降低Glu含量,調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平,從而起到安神益智的功效,提高失眠大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[9];五味子提取物可通過(guò)調(diào)控海馬組織內(nèi)GABAARα1、GABAARγ2表達(dá),改善失眠大鼠睡眠和自主活動(dòng)[12]?；谝陨涎芯?推測(cè)柏子養(yǎng)心湯對(duì)失眠的改善作用可能與GABA信號(hào)通路有關(guān)。

為了驗(yàn)證此推測(cè),本研究通過(guò)腹腔注射PCPA,成功建立了失眠大鼠模型。PCPA是一種5-HT合成酶抑制劑,能阻滯腦內(nèi)5-HT的合成,導(dǎo)致睡眠晝夜節(jié)律消失,引發(fā)失眠。NREM和REM睡眠是睡眠時(shí)相中2個(gè)重要階段,這2種類型睡眠的總量決定了睡眠的質(zhì)量[14]。本研究結(jié)果顯示,柏子養(yǎng)心湯可通過(guò)增加PCPA導(dǎo)致的失眠大鼠5-HT含量、NREM和REM睡眠總量的減少,延長(zhǎng)睡眠時(shí)間,提高失眠大鼠的睡眠質(zhì)量,與既往的研究結(jié)果一致,表明柏子養(yǎng)心湯具有改善睡眠的作用。

下丘腦為人體多種生物調(diào)節(jié)節(jié)律中樞,通過(guò)與不同的大腦區(qū)域進(jìn)行交流,在睡眠-覺(jué)醒調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用[18]。GABA、Glu在腦內(nèi),特別是下丘腦內(nèi)含量極高,是睡眠調(diào)節(jié)中不可或缺的重要因素[19]。GABA是哺乳動(dòng)物大腦中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),與正常人相比,睡眠障礙患者的腦內(nèi)GABA濃度顯著降低[20]。另一項(xiàng)研究表明,口服GABA 30 min后可達(dá)峰濃度,可顯著縮短受試者的睡眠潛伏期并增加NREM睡眠時(shí)間[21]。Glu是主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),GABA是Glu在谷氨酸脫羧酶(GAD)作用下脫羧形成的,因此,Glu/GABA的比值可以用來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制狀態(tài)。GAD67是GABA的關(guān)鍵合成酶,GAD67蛋白水平的降低可抑制Glu向GABA轉(zhuǎn)化[22]。本研究檢測(cè)了下丘腦中GABA和Glu的含量,結(jié)果顯示,PCPA模型大鼠下丘腦內(nèi)GABA水平降低,Glu/GABA比值升高,表明神經(jīng)系統(tǒng)處于興奮狀態(tài),而柏子養(yǎng)心湯可以顯著逆轉(zhuǎn)上述變化。此外,IHC結(jié)果表明,PCPA大鼠下丘腦內(nèi)GAD67的表達(dá)量較正常大鼠減少,柏子養(yǎng)心湯可上調(diào)GAD67的表達(dá),表明柏子養(yǎng)心湯可促進(jìn)下丘腦內(nèi)Glu向GABA轉(zhuǎn)化。提示柏子養(yǎng)心湯可上調(diào)GAD67表達(dá),促進(jìn)Glu/GABA穩(wěn)態(tài)平衡的恢復(fù),從而改善失眠。

GABA通過(guò)GABA受體起作用[23]。大腦中的下丘腦含有大量的GABA受體。GABA受體有3種類型：GABAA、GABAB和GABAC。就睡眠而言,最重要的受體是GABAA受體。當(dāng)GABA或其他激動(dòng)劑與GABAA受體結(jié)合時(shí),會(huì)觸發(fā)氯離子流入神經(jīng)元細(xì)胞,導(dǎo)致抑制動(dòng)作電位放電的負(fù)膜電位,因此,GABA通過(guò)激活GABAA受體降低腦細(xì)胞的活性[4]。GABAA受體共有19種亞基,以有限的組合組裝為功能性受體。大腦中主要的功能性GABAA受體多由α、β、γ亞基組成,其中2個(gè)α1亞基、2個(gè)β2亞基和1個(gè)γ2亞基構(gòu)成的五聚體是最常見(jiàn)的GABAA受體亞型[24-25]。α1亞基的基因是GABRA1,β2亞基的基因是GABRB1,γ2亞基的基因是GABRG2。在本研究中,PCPA模型大鼠下丘腦中GABRA1、GABRB1、GABRG2的mRNA和蛋白水平均低于正常大鼠,但柏子養(yǎng)心湯能呈劑量依賴性逆轉(zhuǎn)上述變化,表明柏子養(yǎng)心湯可增加PCPA大鼠下丘腦GABAA受體亞基(GABRA1、GABRB1、GABRG2)的表達(dá)量,提示柏子養(yǎng)心湯可提高失眠大鼠GABAA受體亞基的表達(dá)。

綜上所述,柏子養(yǎng)心湯可增加失眠大鼠NREM和REM睡眠總量,延長(zhǎng)睡眠時(shí)間,改善睡眠質(zhì)量,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)GABA的合成,提高GABAA受體α1、β2和γ2亞基的表達(dá)有關(guān)。本研究初步探索了柏子養(yǎng)心湯改善失眠的作用及潛在的分子機(jī)制,為其應(yīng)用提供了理論參考。但柏子養(yǎng)心湯對(duì)失眠的改善機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證;此外,除GABAA受體外,GABA也可通過(guò)GABAB受體發(fā)揮作用,柏子養(yǎng)心湯改善睡眠的分子機(jī)制是否與GABAB受體有關(guān),在未來(lái)的研究中會(huì)進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。