淺黃恩蚜小蜂雌雄蜂胚胎及個體發(fā)育

張曉曼, 楊麗文, 王 甦, 張 帆

(1.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北省動物生理生化與分子生物學(xué)重點實驗室,河北 石家莊 050024;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,北京 100097; 3.北京市植物園管理處/北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心,北京 100093)

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)為半翅目粉虱科小粉虱屬,是世界范圍內(nèi)重要的農(nóng)作物害蟲,由于其寄主多,寄生范圍廣,抗藥性高,對農(nóng)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,所以對煙粉虱的防治尤為重要[1].而生物防治由于其無污染、無毒、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點而被廣泛關(guān)注[2-4].煙粉虱的優(yōu)勢天敵主要有捕食螨、瓢蟲、蝽、寄生蜂等,其中寄生蜂對煙粉虱的防治已在大田應(yīng)用[2].

滑行黑蜂屬(Amitus)、槳角蚜小蜂屬(Eretmocerus)及恩蚜小蜂屬(Encarsia)的寄生蜂為煙粉虱的重要寄生性天敵[5-6].其中淺黃恩蚜小蜂為煙粉虱潛在的優(yōu)勢寄生蜂[7-8],有研究表明在實驗室條件下,淺黃恩蚜小蜂與麗蚜小蜂同時存在時,淺黃恩蚜小蜂有更強的競爭優(yōu)勢,是一種有潛在應(yīng)用價值的寄生蜂[9].淺黃恩蚜小蜂(Encarsiasophia)為單寄生蜂,雌蜂的寄生方式屬于獨性內(nèi)寄生,雄蜂的寄生方式屬于外寄生中的自復(fù)寄生(autoparasitiod),雄蜂的發(fā)育只能過寄生在雌蜂幼上,而不能寄生在雄蜂幼蟲上[10].雌性寄生蜂是由受精卵寄生于煙粉虱體內(nèi)發(fā)育而來的,為初寄生蜂;而雄性寄生蜂為第二寄生蜂,外寄生在初寄生蜂上發(fā)育而來[11],此初寄生蜂可以是同種的雌性寄生蜂也可以是不同種的寄生蜂,如恩蚜小蜂屬和槳角蚜小蜂屬[12]等.

淺黃恩蚜小蜂雌雄異律發(fā)育,雌雄異律發(fā)育的寄生蜂寄生于不同的寄主中或者寄生于同一寄主的不同環(huán)境中,胚胎期與幼蟲期的形態(tài)有所區(qū)別[13].昆蟲的胚胎發(fā)育指自母體產(chǎn)出后到孵出幼蟲或若蟲的階段,胚胎發(fā)育分為卵裂、胚盤形成、胚帶形成、胚膜形成、胚層形成胚體分節(jié)、胚動體壁形成等若干階段[14-15].對于恩蚜小蜂屬的胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育相關(guān)研究較少,胚胎發(fā)育的文章僅見于Encarsiaberlesei,Encarsiacitrina[16]和雙斑恩蚜小蜂(Encarsiabimaculata)[17];胚后發(fā)育相關(guān)研究主要有淺黃恩蚜小蜂(E.sophia)和雙斑恩蚜小蜂(E.bimaculata)[11,18],由于其體型較小,難以觀察,所以胚胎發(fā)育的研究較少.本文主要對淺黃恩蚜小蜂的雌雄蜂胚胎及個體發(fā)育進(jìn)行了研究.淺黃恩蚜小蜂雌蜂為內(nèi)寄生蜂,雄蜂為外寄生蜂,描述雌雄蜂胚胎發(fā)育的不同有助于理清其雌雄蜂不同的寄生方式的客觀原因,以期為了解雌雄蜂不同寄生機制提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx的飼養(yǎng)

淺黃恩蚜小蜂由美國德克薩斯A&M大學(xué)農(nóng)業(yè)實驗站昆蟲系引入,室內(nèi)用煙粉虱繁殖.煙粉虱在室內(nèi)飼養(yǎng)(溫度25～30 ℃,濕度80 %,光照16 h),寄主植物為棉花.離體葉片放在培養(yǎng)皿中,用脫脂棉包裹離體葉片的柄部并注入水起保濕作用.

1.2 雌雄卵及幼蟲的獲得

在干凈的棉花葉片上釋放成對的煙粉虱成蟲,每片葉片約100對成蟲,24 h后將煙粉虱移除.待煙粉虱發(fā)育到三齡若蟲時,將寄生煙粉虱若蟲的棉花葉片離體放入培養(yǎng)皿中,接入50頭交配過的雌蜂,在顯微鏡下觀察其產(chǎn)卵情況,在棉花葉片上用數(shù)字標(biāo)記被寄生的煙粉虱若蟲,并記錄下寄生的時間,從剛寄生0 h開始解剖,每2 h間隔解剖一次,若發(fā)現(xiàn)間隔的2 h胚胎發(fā)育有新的變化,則在間隔的2 h內(nèi)再進(jìn)行觀察,直到卵孵化為止,解剖液為PBS(磷酸緩沖液),pH 7.0.寄生煙粉虱后發(fā)育到三齡后期的雌蜂幼蟲為雄蜂寄主,將未交配的雌蜂成蟲釋放到帶有發(fā)育到三齡后期的雌蜂的棉花葉片上,未受精卵發(fā)育成雄蜂,雄卵的發(fā)育解剖時間間隔同雌卵相同.雌雄蜂卵孵化為幼蟲后,每12 h解剖一次.

解剖時,將做標(biāo)記的待解剖的煙粉虱若蟲用解剖針挑入解剖液中,解剖煙粉虱獲得雌卵或雌蟲幼蟲時,煙粉虱體液會隨之一起溢出,此時應(yīng)及時清除,并迅速對雌卵或雌蟲幼蟲在顯微鏡下進(jìn)行拍照.解剖重寄生的煙粉虱獲得雄卵或雄蜂幼蟲時(此時煙粉虱若蟲只剩下體壁)體壁內(nèi)只有雌蜂幼蟲與雄卵或雄蜂幼蟲,解剖時應(yīng)非常小心的剝?nèi)煼凼w壁,即可獲得雄卵或雄蟲幼蟲,將雄卵及其所寄生的雌蜂的幼蟲及雄蟲幼蟲在顯微鏡下拍照.

1.3 雌雄卵及幼蟲的電子顯微鏡觀察

將解剖得到的卵或幼蟲分別在熒光倒置顯微鏡(Leica DMIRB美國萊卡)或電子顯微鏡(Leica MZ205 A美國萊卡)下觀察并拍照,觀察雌雄卵的胚胎發(fā)育及個體發(fā)育.

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Leica Application Suite version 3.60對圖像進(jìn)行處理.對發(fā)育不同時期的雌雄胚胎及幼蟲進(jìn)行測量.

2 結(jié)果與分析

2.1 雌蜂胚胎及個體的發(fā)育

雌卵在36～48 h之間孵化.剛產(chǎn)下的卵的形狀為長橢圓形,兩端鈍圓(圖1a),發(fā)育到2 h左右時卵的一端出現(xiàn)一個小柄(圖1b).隨著胚胎的發(fā)育,周質(zhì)內(nèi)的活質(zhì)體(子核與周圍細(xì)胞形成)在7 h左右出現(xiàn)質(zhì)膜,形成圍繞卵黃的一層單細(xì)胞,在卵端部的柄上連接處開始出現(xiàn)一層膜,稱為胚外膜(圖1c中箭頭B所指).12 h左右時胚胎的胚盤形成(圖1d),12～24 h時胚胎體內(nèi)出現(xiàn)深色代謝物質(zhì)(圖1e).發(fā)育至24 h左右時漿膜在顯微鏡下可見,卵前末端的柄消失(圖1f).24～36 h之間,胚胎開始出現(xiàn)胚動,頂端胚外膜向下凹陷與漿膜連接,中間形成一個細(xì)小的通道與口部連接,顯微鏡下可以看到胚胎可以通過此部位允吸煙粉虱體液(圖1g,m,i),胚胎進(jìn)一步發(fā)育,尾部的胚外膜與漿膜清晰可見(圖1i).發(fā)育至36 h 時,胚胎尾部清晰可見(圖1j),此時胚胎活動劇烈,胚外膜隨著胚胎左右搖擺向尾部移動.48 h時胚胎孵化,蛻皮可見(圖1k).

(a)雌卵,寄生0 h; (b)發(fā)育到2 h的胚胎,箭頭部位為卵柄; (c)7 h的胚胎,A為向周邊移動的單細(xì)胞層,B為胚外膜; (d)12 h的胚胎,此時胚盤形成即A箭頭所指; (e)12～24 h的胚胎體內(nèi)可以看到深色代謝物質(zhì),箭頭所指為胚外膜; (f)24 h胚胎,漿膜出現(xiàn); (g,m,i)24～36 h出現(xiàn)胚動,(g)和(m)中箭頭所指為口器小孔,(i)中A為漿膜,B為胚外膜; (j)36 h,褐色物質(zhì)周圍出現(xiàn)一層肌細(xì)胞; (k)48 h胚胎,卵孵化,箭頭所指為胚胎的蛻皮.圖1 淺黃恩蚜小蜂雌蜂的胚胎發(fā)育Fig.1 Embryonic Development of E. sophia Female

淺黃恩蚜小蜂雌蜂胚后發(fā)育主要經(jīng)歷3個階段,幼蟲、預(yù)蛹和黑蛹、成蜂.一齡幼蟲體節(jié)分化不明顯(圖2b);二齡初期幼蟲的體節(jié)有明顯的分化(圖2c);圖2中的d為三齡幼蟲;預(yù)蛹和黑蛹階段小蜂排泄物可見(圖2e,f);羽化為成蜂后,雌蜂可以將未受精卵外寄生在雌蜂三齡幼蟲、預(yù)蛹或發(fā)育前期的黑蛹上(圖2 m),未受精卵發(fā)育成雄蜂.

(a)雌卵,箭頭為胚外膜與口之間連接的管道; (b)一齡雌蜂幼蟲; (c)二齡雌蜂幼蟲,體節(jié)有明顯的分化; (d)三齡幼蟲,成C字形; (e)預(yù)蛹,箭頭為雌蜂排泄物; (f)黑蛹; (g)雌蜂成蟲; (m)雌蜂產(chǎn)未受精卵,發(fā)育成雄蜂.圖2 淺黃恩蚜小蜂雌蜂個體發(fā)育Fig.2 Ontogeny Development of E. sophia Female

2.2 雄蜂胚胎及個體發(fā)育

雌蜂產(chǎn)下未受精卵之后發(fā)育成雄蜂在本文中稱為雄卵,外形與受精卵(之后發(fā)育成雌蜂,在本文中稱為雌卵)有所區(qū)別,后端成鈍圓形,前端尖銳并生長有一個柄(圖3a),雄卵發(fā)育到2 h時,卵前端的柄與卵體之間出現(xiàn)胚膜(圖3b),柄可以很有力的吸附在寄主雌蜂上,以取食雌蜂幼蟲的營養(yǎng).胚胎發(fā)育到6 h左右時,質(zhì)膜出現(xiàn),并開始圍繞卵黃向周邊移動(圖3c),12 h左右時,胚盤形成,并且緊貼在寄主雌蜂幼體上(圖3d),發(fā)育至12～24 h時,漿膜出現(xiàn)并在胚體中央開始出現(xiàn)深色代謝物質(zhì),到24 h左右時,深褐色物質(zhì)進(jìn)一步積累(圖3e),發(fā)育至36 h時,有胚動,深褐色物質(zhì)周圍出現(xiàn)一層肌細(xì)胞(圖3f),48 h 左右時雄蜂胚胎孵化(圖3g).偶爾雌蜂會將2個以上的未受精卵產(chǎn)在寄主雌蜂幼蟲上,實驗過程中,發(fā)現(xiàn)最多時有10個未受精卵產(chǎn)在同一個寄主上.當(dāng)雌蜂將2個以上未受精卵產(chǎn)在寄主雌蜂幼蟲上時,只有一個卵存活,其他的卵無法存活,如圖3m,在卵期死亡,與孵化的雄卵(圖3g)在同一個寄主內(nèi).

(a)剛寄生的卵; (b)放大部分為發(fā)育2 h的雄蜂胚胎; (c)發(fā)育至6 h的胚胎,質(zhì)膜出現(xiàn),開始向周邊移動; (d)放大部分為12 h發(fā)育的胚胎,此時胚盤形成; (i)發(fā)育至22 h的胚胎,可以明顯的看到2層膜,外面一層為漿膜,體內(nèi)出現(xiàn)褐色代謝物; (e)發(fā)育至24 h胚胎,褐色代謝物進(jìn)一步積累加深; (f)36 h有胚動,箭頭A所示為一層肌細(xì)胞; (g)48 h,雄蜂胚胎已孵化; (m)寄生48 h的未孵化的雄蜂卵(已經(jīng)死亡),與(g)中已孵化的雄卵寄生在同一個寄主上,生長被抑制.圖3 淺黃恩蚜小蜂雄蜂的胚胎發(fā)育Fig.3 Embryonic Development of E. sophia Male

雄蜂的胚后發(fā)育也同樣包括3個階段,幼蟲期、預(yù)蛹黑蛹期、成蜂期.一齡的雄蜂體節(jié)沒有分化(圖4b),二齡的雄蜂有明顯的分化(圖4c),三齡的雄蜂成C字形圍繞寄主(圖4d),其預(yù)蛹(圖4e)和黑蛹(圖4f)排泄物成黑褐色,明顯區(qū)別于雌蜂的排泄物,雄蜂成蜂成褐黃色(圖4g),與雌蜂的淺黃色有區(qū)別.

(a)放大部分為雄卵; (b)放大部分為一齡雄蜂幼蟲; (c)放大部分為二齡雄蜂幼蟲,體節(jié)開始變化; (d)三齡雄蜂幼蟲,整個身體成C字形包裹寄主雌蜂幼蟲; (e)雄蜂預(yù)蛹; (f)雄蜂黑蛹,箭頭F為雄蜂排泄物; (g)雄蜂成蜂.圖4 淺黃恩蚜小蜂雄蜂個體發(fā)育Fig.4 Ontogeny Development of E. sophia Male

圖5中的A和B為同一個雌蜂幼蟲寄主寄生了2個雄卵,發(fā)育到72 h時另一個雄卵消失.圖5A中兩個雄卵產(chǎn)在寄主的兩邊,圖5B中兩個雄卵產(chǎn)在同一側(cè),24 h之后其中一個雄卵出現(xiàn)胚動,從第二個雄卵口器與寄主之間穿過,阻斷了第二個雄卵的取食渠道,第二個雄卵死亡.

(A)a為0 h同時寄生在同一個寄主中的2個雄卵,b為發(fā)育24 h后的2個雄蜂胚胎,其中1個出現(xiàn)胚動開始移動,c為48 h后的2個雄蜂幼蟲,其中一個已經(jīng)不移動,另一個發(fā)育為一齡,d為72 h后的雄蜂幼蟲,其中一個卵已經(jīng)消失,另一個已經(jīng)發(fā)育為二齡幼蟲.(B)a為0 h同時寄生在同一個寄主中的兩個雄卵,b為發(fā)育24 h后的兩個雄蜂胚胎,其中一個先出現(xiàn)胚動,移動后阻斷另一個卵的取食途徑,72 h后其中一個發(fā)育為二齡幼蟲,另一個卵消失.圖5 雌蜂幼蟲同時被2個未受精卵寄生Fig.5 The Female Larvae Are Parasitized with Two Unfertilized Eggs

2.3 雌雄蜂胚胎體長變化

雌雄胚胎從0 h 到48 h孵化,體長變化不同,雌蜂胚胎0 h 到36 h體長增長較快(0.198～0.280 mm),而雄蜂胚胎在此時間內(nèi)體長變化較小,為0.163～0.187 mm.從36 h到48 h雌雄蜂胚胎孵化,體長都有明顯增加,雌蜂從0.280 mm增長到0.367 mm,雄蜂從0.170 mm增長到0.255 mm,如圖6.從圖中可以看出,雌蜂胚胎從0 h開始體長增長較快,而雄性胚胎在48 h孵化時才有較明顯的增長.

圖6 雌雄胚胎48 h內(nèi)體長變化Fig.6 Changes in Body Length of Male and Female Embryos in 48 h

3 討 論

首次報道了淺黃恩蚜小蜂雌雄蜂胚胎的發(fā)育,雌雄蜂個體的發(fā)育雖然已有報道[11,19],但對雄蜂的個體發(fā)育都是在寄主體內(nèi)進(jìn)行觀察,本實驗是將雄蜂幼蟲剖出對各個發(fā)育階段進(jìn)行了拍照描述,雌雄蜂分別經(jīng)歷了卵期,幼蟲,預(yù)蛹黑蛹期和成蟲期,一齡雌蜂孵化時尾部出現(xiàn)一個尾巴,這可能跟以后產(chǎn)卵器的發(fā)生有關(guān),且雌雄蜂都在幼蟲發(fā)育到二齡時有明顯體節(jié)分化.

淺黃恩蚜小蜂雌雄蜂的胚胎發(fā)育形態(tài)有所區(qū)別,雌蜂胚胎有胚外膜,而在雄蜂胚胎發(fā)育時沒有發(fā)現(xiàn).雌雄蜂形態(tài)的不同是在發(fā)育的過程中產(chǎn)生的[20].首先,雌雄蜂卵形態(tài)不同可能是因為雌蜂產(chǎn)受精卵和未受精卵時處理不同;其次,雌雄蜂胚胎形態(tài)不同跟外胚胎膜的有無有關(guān).不同的寄生蜂早期發(fā)育有所區(qū)別,伯恩蚜小蜂胚胎極體不消解,在胚的外層形成一層胚外膜,又稱滋養(yǎng)膜(trophamnion),認(rèn)為與營養(yǎng)及寄主免疫有關(guān),異養(yǎng)的Encarsiaporteri雌蟲胚胎有一層膜包圍著胚胎,而雄胚胎中沒有發(fā)現(xiàn),也有研究報道雙斑恩蚜小蜂Encarsiabimaculata雌蟲胚胎也有一層胚外膜[17-18],已有研究表明,胚外膜直接參與寄主的免疫抑制作用,Encarsiaberlesei和Encarsiacitrina在孵化時胚外膜釋放畸形細(xì)胞,抑制寄主對其的免疫[16].Encarsiaconiugata,Encarsiapartenopea和E.berlesei雌雄胚胎發(fā)育相似,不形成胚外膜[13].淺黃恩蚜小蜂雌蜂卵及幼蟲期在煙粉虱體液內(nèi)生長,而雄蜂外寄生于雌蜂上,所以雌蜂寄生階段尤其是胚胎期需要更強的免疫力抑制寄主淋巴系統(tǒng)對其的免疫,因此雌蜂胚胎的胚外膜可能直接與抵抗寄主的免疫力有關(guān),本研究也表明雌蜂胚胎在發(fā)育0～36 h時體長有明顯的增長,而雄蜂胚胎體長在此時間內(nèi)變化不明顯,所以猜測雌蜂的這層胚外膜也可能與提供營養(yǎng)有關(guān).

淺黃恩蚜小蜂雌蜂胚胎在發(fā)育過程中,卵前末端的柄從沒有(0 h的卵)到出現(xiàn)(發(fā)育2 h左右)再到消失(發(fā)育到24 h左右時);胚胎發(fā)育前期前末端的柄與胚外膜相連,形成一個吸收煙粉虱體液的進(jìn)食管道,后消失.而雄蜂在整個胚胎過程中都有卵柄出現(xiàn),并且吸附在寄主雌蜂幼蟲上,這與錢明惠[17]報道的雙斑恩蚜小蜂雌蜂的卵一端的柄有所區(qū)別.有些寄生蜂是異律發(fā)育(heteronomous development),雌雄蜂發(fā)育的方式不同,胚胎的形態(tài)有所不同,有些異律發(fā)育的早期胚胎,雄卵前末端有一個柄,而雌卵不具備,而淺黃恩蚜小蜂雌蜂胚發(fā)育前期也有卵柄出現(xiàn),其雄蜂胚胎的卵柄一直沒有消失,這可能與其外寄生的方式有關(guān),以便于吸附在寄主體上吸取營養(yǎng).雄蜂胚胎發(fā)育的過程中沒有胚外膜的出現(xiàn),所以無法抵抗煙粉虱體液對其的免疫作用,這可能是雌蜂只能把雄卵(未受精卵)產(chǎn)在煙粉虱體液已干燥的環(huán)境[11]中的主要原因.雌蜂胚胎隨著發(fā)育時間的增加體長有顯著差異,而雄蜂體長變化較小,原因可能是雌蜂胚胎發(fā)育的過程中比雄蜂胚胎中的胚外膜有免疫和吸收營養(yǎng)的功能,從而導(dǎo)致雌蜂胚胎生長速度不同.

對于寄生蜂之間的競爭機制,已有研究表明,卵較大者如果能提前孵化或幼蟲個體大小占優(yōu)勢,則能夠在競爭中勝出[21],本研究中,雌蜂幼蟲寄主上同時寄生的2個雄卵,先出現(xiàn)胚動和孵化的雄卵能夠存活下來,另一個72 h時已經(jīng)消失,原因可能是一個雄蜂卵對另一個雄蜂卵的免疫抑制或?qū)ζ淙∈惩緩降淖钄?有些寄生蜂能夠識別寄主是否是同種或他種寄生蜂寄生[22],麗蚜小蜂在產(chǎn)卵時,能夠?qū)⒓闹黧w內(nèi)其它的寄生蜂通過產(chǎn)卵器殺死[23],也有研究表明淺黃恩蚜小蜂產(chǎn)雌卵時,能夠識別寄主是否被寄生過[9],但在產(chǎn)雄卵時的競爭并沒有相關(guān)報道.關(guān)于異律發(fā)育的寄生蜂,產(chǎn)雄且為自復(fù)寄生時,其識別機制及產(chǎn)多個卵時的競爭機制需要進(jìn)一步研究考證.