楚雄腮扁葉蜂聚集產(chǎn)卵引誘物質(zhì)初探

閆爭亮，馬惠芬，毛云玲，劉凌，胡光輝

（云南省林業(yè)和草原科學(xué)院森林保護(hù)研究所，昆明 650201）

楚雄腮扁葉蜂（Cephalcia chuxiongicaXiao）隸屬于膜翅目（Hymenoptera）扁葉蜂科（Pamphiliidae）腮扁葉蜂屬（Cephalcia），僅在中國云南省有分布。1984年，肖剛?cè)崾状螆蟮懒嗽撐锓N，它是一種有較大經(jīng)濟(jì)重要性的害蟲[1]。楚雄腮扁葉蜂主要危害云南松（Pinus yunnanensisFranch.）、華山松（Pinus armandiiFranch.）、滇油杉（Keteleeria evelynianaMast.）等重要的經(jīng)濟(jì)林木。該蜂以幼蟲取食松樹葉片，造成樹木畸形、生長緩慢，為害嚴(yán)重時導(dǎo)致寄主死亡。該蜂2年發(fā)生1代，從6月下旬開始，成蟲羽化，然后成蟲發(fā)生期持續(xù)至10月上旬。其幼蟲取食針葉時，吐絲形成灰白色的幕巢，且為害持續(xù)時間長達(dá)5個月之久，然后以老熟幼蟲或預(yù)蛹在地表下10～20 cm處筑土室越冬越夏，長達(dá)17個月，直至第3年化蛹、羽化[2]。由于楚雄腮扁葉蜂獨(dú)特的生物生態(tài)學(xué)特性，因此，對其防治較為困難。

我們前期的研究[3]表明：楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂偏好在云南松、華山松上產(chǎn)卵，極少選擇在滇油杉上產(chǎn)卵，但絕不會在云南擬單性木蘭（Parakmeria yunnanensis）上產(chǎn)卵；而在其喜食寄主云南松、華山松針葉上噴施非寄主植物的樹葉粗提物可抑制其產(chǎn)卵。室內(nèi)試驗表明：云南松松針粗提物、帶卵松針粗提物、產(chǎn)卵雌蜂均對楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂具有明顯的引誘作用，且?guī)阉舍槾痔嵛锏囊T作用明顯大于不帶卵的松針粗提物；此外，松針粗提物雖對楚雄腮扁葉蜂雄蜂具有一定的引誘作用，但與帶卵松針粗提物的引誘作用間沒有顯著差異[4]。而且我們還觀察到，雌蜂產(chǎn)卵于松樹針葉以后的一段時間內(nèi)，可誘集更多的同種雌蜂在同一個松梢上聚集產(chǎn)卵[3]。這些發(fā)現(xiàn)說明，研究利用信息化學(xué)物質(zhì)對楚雄腮扁葉蜂進(jìn)行防控的技術(shù)，是一個合理的思路。

以松葉蜂科（Diprionidae）為代表的廣腰亞目（Symphyta）林木害蟲的信息化學(xué)物質(zhì)研究，主要聚焦在其雌蜂產(chǎn)生的性信息素上[5]。但由于性誘劑只對雄蜂起作用，而不能有效控制大量產(chǎn)卵的雌蜂，所以性信息素的應(yīng)用對控制林間害蟲蟲口密度的效果不大。對廣腰亞目林木害蟲寄主揮發(fā)物的研究，則主要集中于害蟲對適宜和不適宜寄主的辨別上。如歐洲新松葉蜂（Neodiprion sertifer）[6]和歐洲赤松葉鋒（Diprion pini）[7-8]可以通過松樹的揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)指紋圖譜來區(qū)分不同的寄主；為害木質(zhì)部的樹蜂科（Siricidae）云杉樹蜂（Sirex noctilio）的產(chǎn)卵雌蜂依據(jù)不同松樹種類揮發(fā)物的化學(xué)指紋圖譜決定其產(chǎn)卵偏好[9]。扁葉蜂科（Pamphiliidae）的松阿扁葉蜂（Acantholyda posticalis）可根據(jù)不同樹種的氣味區(qū)分適宜與非適宜寄主[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)：松葉蜂科的歐洲赤松葉蜂（D.pini）幼蟲取食時口器分泌物可驅(qū)逐同種產(chǎn)卵雌蜂[12]；歐洲新松葉蜂（Neodiprion sertifer）的卵淋洗液不會對其雌蜂產(chǎn)卵產(chǎn)生驅(qū)避作用[13]，但新松葉蜂屬的Neodiprion fulviceps產(chǎn)卵于針葉內(nèi)時，對其在已著卵針葉附近的針葉上產(chǎn)卵的同種雌蜂會產(chǎn)生驅(qū)避作用[14]。而楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂是否可被正在產(chǎn)卵的雌蜂或者其新卵的揮發(fā)物所引誘而聚集產(chǎn)卵，是一個值得探究的問題。為此，我們對楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂的趨向選擇進(jìn)行了初步的室內(nèi)測試。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx采集于云南省昆明市尋甸回族彝族自治縣河口鎮(zhèn)北大營。在楚雄腮扁葉蜂即將羽化出土的季節(jié)（5月中旬），踏查松林內(nèi)是否有楚雄腮扁葉蜂危害。選擇樹冠下散落有前一年度老熟幼蟲下樹入土前遺留的蟲巢的云南松，在樹干周邊約1 m的半徑范圍內(nèi)，挖掘地面深約20 cm，收集經(jīng)過越冬即將羽化的楚雄腮扁葉蜂蛹，帶回室內(nèi)。在直徑25 cm、高15 cm的透明塑料圓盒中先放入濕潤的森林土壤，然后放入從林間采回的淺綠色蛹，待其羽化后，分別將雌、雄蟲（雌蜂前胸背板及中胸前盾片、盾片和小盾片為銹紅色，而雄蜂則為黑色）放在40 cm×40 cm×40 cm的養(yǎng)蜂籠內(nèi)，喂以10%的蔗糖水，在自然室溫20～27℃、相對濕度60%±10%環(huán)境下飼養(yǎng)，備用。

以雌、雄蟲數(shù)目比1∶2放入養(yǎng)蜂籠內(nèi)任其充分交尾，獲得已交尾雌蜂。進(jìn)行行為測試時，選取未交尾及交尾后1 h的已交尾雌蜂進(jìn)行測試。

1.1.2 氣味源

以云南松新鮮松針、帶卵新鮮松針的二氯甲烷淋洗液、粗提液及未交尾雌蜂、已交尾雌蜂產(chǎn)卵器的二氯甲烷淋洗液為氣味源。

1.2 試驗方法

1.2.1 氣味源的準(zhǔn)備

松針淋洗液、帶卵松針淋洗液的準(zhǔn)備：在野外松林中現(xiàn)場制備。采集新鮮松針和帶有新卵（卵呈現(xiàn)油亮的黃色光澤）的松針。先將帶卵、不帶卵的松針輕輕摘下，不要破壞松針上附著的卵，然后以二氯甲烷淋洗。淋洗時要避免淋洗液接觸到松針基部的傷口，以免淋洗液遭到松針內(nèi)次生代謝物的污染。1束松針（3根松針為1束，1束著卵松針附著約85粒蟲卵）以10 μL二氯甲烷溶劑淋洗。

松針粗提液、帶卵松針粗提液的準(zhǔn)備：采用同時蒸餾萃取法（SDE）提取針葉揮發(fā)油。將帶卵和未帶卵的新鮮松針用醫(yī)用小剪刀剪成長約2 mm的碎屑，各稱取200 g放入同時蒸餾萃取裝置內(nèi)，以50 mL二氯甲烷為萃取劑。同時蒸餾萃取5 h后，以布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去二氯甲烷，剩余萃取溶液30 mL，用無水硫酸鈉干燥。

雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液的準(zhǔn)備：輕輕擠壓雌蜂腹部，待抱卵器伸出后，以二氯甲烷淋洗。每頭雌蜂以10 μL二氯甲烷溶劑淋洗。

以上淋洗液和提取液于4℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2.2 趨向試驗

測試雌蜂趨向行為時，淋洗液直接使用，而帶卵松針和未帶卵松針粗提液需稀釋1 000倍后使用，則10 μL溶液約相當(dāng)于1束松針的提取液。

利用Y型嗅覺儀，參照張同心等[11]的測試方法（單向選擇試驗）。測試時，在一個球形管內(nèi)放入滴有10 μL淋洗液的濾紙條（2.0 cm×0.5 cm）作為氣味源，在另一個球形管內(nèi)放入滴有10 μL相應(yīng)溶劑（二氯甲烷溶液）的濾紙條作為對照。試驗時，將試蟲放入Y型嗅覺儀主管入口處，用黑色聚乙烯膜覆蓋整個嗅覺儀，以免由于趨光性而影響試驗結(jié)果。啟動真空泵，調(diào)節(jié)Y型嗅覺儀主管內(nèi)的氣流流量為100 L/h。引入試蟲2 min后檢查試蟲趨向反應(yīng)：如果試蟲進(jìn)入作為氣味源的支管或球形管中，記為正趨向；如果試蟲進(jìn)入作為對照的支管或球形管中，記為負(fù)趨向；如果試蟲停留在Y型管的主管中，則記為無選擇。用正趨向試蟲數(shù)占被測試的試蟲總數(shù)的百分比來表示被測試樣品的活性（趨向率）。每次測試使用同一批從野外采回的經(jīng)過飼養(yǎng)的楚雄腮扁葉蜂成蟲；每個氣味源測試5次，每次測試時將10頭雌蜂依次試驗；每測試5頭雌蜂，調(diào)換一次氣味源。對經(jīng)過一輪測試的試蟲不再使用。

比較不同氣味源的引誘作用（雙向選擇試驗）時，則在Y型嗅覺儀的2個球形管內(nèi)分別放入不同的氣味源。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖，以t測驗（t-test）進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液、淋洗液對楚雄腮扁葉蜂雌蜂活性的單向選擇試驗

室內(nèi)測試表明，楚雄腮扁葉蜂的未交尾雌蜂和已交尾雌蜂對松針粗提液和帶卵松針粗提液都具有明顯的趨向反應(yīng)（圖1～2）。

圖1 未交尾雌蜂和已交尾雌蜂對云南松松針粗提液的趨向反應(yīng)Fig.1 Approach response of unmated and mated females to crude extracts of fresh needles of P.yunnanensis

從圖3可以看出，松針淋洗液既沒有引起楚雄腮扁葉蜂未交尾雌蜂的趨向反應(yīng)，也沒有引起已交尾雌蜂的趨向反應(yīng)。帶卵松針淋洗液對未交尾雌蜂沒有表現(xiàn)出明顯的引誘作用，但對已交尾雌蜂的引誘作用明顯（圖4）。

圖2 未交尾雌蜂和已交尾雌蜂對云南松帶卵松針粗提液的趨向反應(yīng)Fig.2 Approach response of unmated and mated females to crude extracts of fresh needles with fresh eggs of P.yunnanensis

圖3 未交尾雌蜂和已交尾雌蜂對云南松松針淋洗液的趨向反應(yīng)Fig.3 Approach response of unmated and mated females to eluent of fresh needles of P.yunnanensis

未交尾雌蜂產(chǎn)卵器的淋洗液對未交尾雌蜂和已交尾雌蜂沒有表現(xiàn)出任何的引誘活性（圖5）。已交尾雌蜂產(chǎn)卵器的淋洗液對未交尾雌蜂沒有引誘活性，但對已交尾雌蜂具有引誘作用（圖6）。

歸納單向選擇試驗（氣味源和二氯甲烷）結(jié)果，可以得到以下結(jié)論：未交尾雌蜂可被松針和帶卵松針的粗提液所引誘，但對松針、帶卵松針、未交尾雌蜂產(chǎn)卵器及已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液沒有做出趨向反應(yīng)。已交尾雌蜂對松針淋洗液、未交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液沒有表現(xiàn)出趨向反應(yīng)，但可被松針粗提液、帶卵松針粗提液和淋洗液、已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液所引誘。

圖4 未交尾雌蜂和已交尾雌蜂對云南松帶卵松針淋洗液的趨向反應(yīng)Fig.4 Approach response of unmated and mated females to eluent of fresh needles with fresh eggs of P.yunnanensis

圖5 未交尾雌蜂和已交尾雌蜂對未交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液的趨向反應(yīng)Fig.5 Approach response of unmated and mated females to ovipositors’eluent of unmated females

圖6 未交尾雌蜂和已交尾雌蜂對已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液的趨向反應(yīng)Fig.6 Approach response of unmated and mated females to ovipositors’eluent of mated females

2.2 提取液、淋洗液對楚雄腮扁葉蜂雌蜂活性的雙向選擇試驗

單向選擇試驗表明：未交尾雌蜂、已交尾雌蜂可被松針粗提液、帶卵松針粗提液所引誘；此外，已交尾雌蜂還可被帶卵松針淋洗液、已交尾雌蜂產(chǎn)卵器的淋洗液所引誘。為了進(jìn)一步比較楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂對這些具有引誘活性的氣味源的趨向反應(yīng)是否存在差異，我們進(jìn)行了雙向選擇趨向試驗。

從圖7可以看出，無論是新鮮不帶卵松針還是帶卵的松針，其粗提液對楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂的引誘作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其淋洗液的引誘作用。如圖8所示，與松針淋洗液相比較，楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂選擇趨向帶卵松針淋洗液和已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液，而對未交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液沒有做出選擇。與未交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液相比較，已交尾雌蜂更偏向帶卵松針淋洗液；而在帶卵松針淋洗液與已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液之間沒有做出選擇（圖9）。產(chǎn)卵器淋洗液之間的比較表明，已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液更有引誘力（圖10）。

圖7 已交尾雌蜂對新鮮松針、帶卵松針的粗提液和淋洗液的趨向反應(yīng)對比Fig.7 Comparison of approach response of mated females to eluents and crude extracts of fresh needles with or without fresh eggs

3 討論與結(jié)論

圖8 已交尾雌蜂對新鮮松針淋洗液和其他不同淋洗液氣味源的趨向反應(yīng)Fig.8 Approach response of mated females to eluent of fresh needles and other different eluent odors

圖9 已交尾雌蜂對帶卵松針淋洗液與其他淋洗液氣味源的趨向反應(yīng)Fig.9 Approach response of mated females to eluent of fresh needles with fresh eggs and other eluent odors

圖10 已交尾雌蜂對未交尾雌蜂和已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液的趨向反應(yīng)Fig.10 Approach response of mated females to ovipositors’eluent of unmated and mated females

單向選擇試驗顯示，未交尾雌蜂和已交尾雌蜂可被松針粗提液和帶卵松針粗提液所引誘，但未對松針淋洗液表現(xiàn)出趨向反應(yīng)。松針粗提液和淋洗液活性的差別在于其揮發(fā)物組成上的差異。植物體內(nèi)的次生物質(zhì)是通過表皮滲透到體表或通過腺體結(jié)構(gòu)分泌到體表的，成為該植物的“指紋”信息化合物，進(jìn)而影響植食性昆蟲對產(chǎn)卵寄主的選擇性[15-16]，說明松針內(nèi)部的各個單萜烯化合物的相對比例在經(jīng)過針葉體表蠟質(zhì)后發(fā)生了改變。揮發(fā)物的提取方法不同，最后的分析結(jié)果差異也很大。如利用水蒸氣蒸餾法[17]和利用頂空收集法[18]采集到的云南松針葉揮發(fā)物在組成和含量上差異很大；另外，用溶劑提取的粗提液中單萜烯的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于破損的針葉在自然狀態(tài)下釋放的單萜烯的濃度。針葉淋洗液中的主要成分是葉面蠟質(zhì)[19]，其單萜烯的濃度極低而可能不被楚雄腮扁葉蜂察覺。由測試結(jié)果可以推測，針葉中對楚雄腮扁葉蜂未交尾雌蜂和已交尾雌蜂具有引誘活性的揮發(fā)性物質(zhì)是單萜烯，而不是針葉體表的蠟質(zhì)。在雙向選擇試驗中，松針、帶卵松針粗提液對楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂的引誘作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其淋洗液，進(jìn)一步證實(shí)了單萜烯對未交尾、已交尾楚雄腮扁葉蜂雌蜂的引誘作用。然而，已交尾雌蜂可被帶卵松針的淋洗液所引誘，由此可以推測，帶卵松針淋洗液中引誘已交尾雌蜂的活性物質(zhì)應(yīng)該是卵體表附著的產(chǎn)卵分泌物。

未交尾雌蜂對未交尾雌蜂和已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液未表現(xiàn)出明顯的趨向反應(yīng)，而已交尾雌蜂對已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液趨向反應(yīng)明顯。由此可見，在已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液中含有對已交尾雌蜂具有引誘活性的物質(zhì)。松針淋洗液分別與帶卵松針淋洗液、已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液相比較表明，已交尾雌蜂更偏好帶卵松針和已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液的氣味，試驗進(jìn)一步證實(shí)已交尾雌蜂分泌物或者雌蜂新產(chǎn)的卵附著的分泌物中含有引誘性物質(zhì)。此外，待產(chǎn)卵的雌蜂趨向帶卵松針淋洗液而不是未交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液，但未在帶卵松針淋洗液和已交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液之間做出選擇，說明卵附著的分泌物和待產(chǎn)卵雌蜂產(chǎn)卵器分泌物具有同等的引誘效應(yīng)。已交尾雌蜂選擇趨向待產(chǎn)卵雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液而不是未交尾雌蜂產(chǎn)卵器淋洗液，也說明了兩者之間成分的差異。這種差異也說明，楚雄腮扁葉蜂雌蜂交尾后，其生理狀態(tài)發(fā)生了改變，因而其蟲體揮發(fā)物也發(fā)生了變化。

至此，可以得到一幅圖景：羽化出土的楚雄腮扁葉蜂雌、雄蜂，首先接觸到了林間各種各樣的揮發(fā)性物質(zhì)，經(jīng)過辨別，它們最終選擇了來自松樹的氣味[3]；找到其適宜寄主后，雌蜂釋放性信息素引誘雄蜂前來交尾[20]。這個交尾后的雌蜂（先驅(qū)性雌蜂）選擇合適的松樹梢并在其針葉上產(chǎn)卵；此時，該雌蜂不再引誘雄蜂，而通過其生殖副腺及其所產(chǎn)新卵揮發(fā)出相關(guān)的活性物質(zhì)，召喚更多的待產(chǎn)卵雌蜂聚集到同一個松梢上產(chǎn)卵。這種聚集產(chǎn)卵及此后的幼蟲聚集取食，應(yīng)該是昆蟲抵抗寄主植物防御機(jī)制的一種生存策略[21]。

綜上所述，松針揮發(fā)物、生殖副腺分泌物中的揮發(fā)性成分（包括新產(chǎn)卵體表的揮發(fā)性物質(zhì)、待產(chǎn)卵雌蜂產(chǎn)卵器分泌物）都對楚雄腮扁葉蜂已交尾雌蜂具有明顯的引誘作用。雌蜂的聚集產(chǎn)卵和幼蟲的群集危害，是楚雄腮扁葉蜂危害的突出特征。楚雄腮扁葉蜂依賴寄主松樹針葉本身釋放的揮發(fā)物來確定其適宜的產(chǎn)卵寄主，而正在產(chǎn)卵的雌蜂及其新卵的揮發(fā)物則在引導(dǎo)同種雌蜂聚集產(chǎn)卵中發(fā)揮作用。昆蟲產(chǎn)卵時含有調(diào)節(jié)同種或其他種昆蟲產(chǎn)卵行為的化學(xué)信息物質(zhì)，如產(chǎn)卵標(biāo)記信息素，包括產(chǎn)卵忌避信息素、產(chǎn)卵抑制信息素、產(chǎn)卵刺激信息素等[22]。甘藍(lán)地種蠅（Delia radicum）[23]、沙漠蝗（Schistocerca gregaria）[24-25]卵表面附著的生殖副腺分泌物中含有引誘同種雌成蟲聚集產(chǎn)卵的刺激素。膜翅目昆蟲的產(chǎn)卵分泌物含有多種化學(xué)物質(zhì)：蟻類產(chǎn)卵分泌物主要是短鏈烷烴，以及一些萜類、酮類、醇類和酯類；蜜蜂產(chǎn)卵分泌物含有大環(huán)內(nèi)酯、碳?xì)浠衔?、類萜、酮類和酯類等；胡蜂產(chǎn)卵分泌物主要包含5～21個碳原子的長鏈烷烴；寄生蜂產(chǎn)卵分泌物含有豐富的飽和、不飽和烷烴[26]。而楚雄腮扁葉蜂生殖副腺分泌物或新卵體表的具體揮發(fā)性引誘物質(zhì)尚待進(jìn)一步研究。

有關(guān)廣腰亞目林木害蟲產(chǎn)卵誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物的研究，大多關(guān)注植物應(yīng)對植食性昆蟲產(chǎn)卵引發(fā)的直接或間接的防御機(jī)制。在為害針葉樹的膜翅目食葉害蟲中，產(chǎn)卵于針葉內(nèi)的歐洲赤松葉蜂（D.pini）產(chǎn)卵可誘導(dǎo)寄主歐洲黑松（Pinus nigra）揮發(fā)物發(fā)生改變[27]，歐洲赤松葉蜂在其另一個寄主歐洲赤松（Pinus sylvestris）上產(chǎn)卵，其輸卵管分泌物不僅可誘導(dǎo)帶卵針葉而且可誘導(dǎo)同一松梢上靠近帶卵針葉的其他針葉揮發(fā)物發(fā)生變化，這種改變了的揮發(fā)物對卵寄生的紅金姬小蜂（Chrysonotomyia ruforum）具有引誘作用[28-29]，其中（E）-β-法尼烯是關(guān)鍵性物質(zhì)[30]。BEYAERT等認(rèn)為，松葉蜂產(chǎn)卵引起的寄主松樹次生代謝物的變化，是寄主松樹自身對即將遭受的幼蟲危害而發(fā)出的預(yù)警性反應(yīng)[31]。但這種反應(yīng)是滯后的，松葉蜂產(chǎn)卵72 h后，針葉的光合作用[32]、倍半萜合成酶轉(zhuǎn)錄水平[33-34]、揮發(fā)物[27,30,35]組成等的變化才達(dá)到最大。而楚雄腮扁葉蜂產(chǎn)卵于松樹針葉后，誘導(dǎo)改變的針葉揮發(fā)物對其聚集產(chǎn)卵產(chǎn)生了什么影響尚不清楚。可以推測，楚雄腮扁葉蜂產(chǎn)卵誘導(dǎo)松樹針葉揮發(fā)物發(fā)生了改變，在這種改變尚未達(dá)到驅(qū)避或抑制同種雌蜂產(chǎn)卵的效應(yīng)之前，在一定時間內(nèi)反而對同種產(chǎn)卵雌蜂具有誘集作用，但這個推測還需要進(jìn)一步的試驗驗證。