危害茶樹菇新害蟲
——Bradysia peraffinis Tuomikoski 1960(Diptera: Sciaridae)的生物學(xué)特性

王赟萍,賀佩珊,馬吉平,鐘國祥,王素貞,肖銀潤,熊小文,張 誠,*

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所,江西 南昌 330200; 2.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院,江西 宜春 331200)

茶樹菇(Agrocybeaegerita),屬傘菌目(Agaricales)糞銹傘科(Bolbitiacea)[1],它不僅味道鮮美、營養(yǎng)豐富,而且還是民間藥用菌,具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值[2]。由于茶樹菇在栽培過程中,菌絲吃料后會產(chǎn)生酒酚香味物質(zhì)[3],生長的子實(shí)體也會散發(fā)特殊的香味,因而十分受昆蟲的青睞,吸引菇蚊、菇蠅取食產(chǎn)卵,引起茶樹菇蟲害的發(fā)生[4]。

菇蚊、菇蠅是對危害食用菌雙翅目害蟲的統(tǒng)稱,其中眼蕈蚊科遲眼蕈蚊屬(Bradysia)和厲眼蕈蚊屬(Lycoriella)的一些種類對食用菌危害較重[5],在我國多個省份廣泛分布,我國已經(jīng)記錄的菇蚊、菇蠅有100多種[6]。幼蟲取食菌絲,嚴(yán)重時菌袋菌絲被逐漸啃完,出現(xiàn)“退菌”現(xiàn)象;幼蟲啃咬、吞噬原基或幼小的菇蕾,造成嚴(yán)重減產(chǎn),甚至絕收[7]。眼蕈蚊發(fā)育歷期短[8],可以在短時間內(nèi)建立種群,對食用菌產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國眼蕈蚊相關(guān)研究工作起步較晚[6],研究不夠系統(tǒng),因而有必要對眼蕈蚊開展深入的研究,鑒定其種類,明確其生活史、發(fā)生規(guī)律、危害特點(diǎn)等,為探索具有針對性、安全性、高效性的綜合防治措施奠定基礎(chǔ)。

本課題組在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶樹菇種植基地發(fā)現(xiàn)了一種危害茶樹菇的蕈蚊,通過DNA條形碼技術(shù)——利用線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(mitochondrial DNA cytochrome oxidase subunit Ⅰ, mtDNA-COⅠ)基因序列對其進(jìn)行鑒定[9],明確其種類,并對該蕈蚊進(jìn)行制片、拍照,描述其主要形態(tài)特征,另外,通過恒溫箱室內(nèi)飼養(yǎng),觀察和記錄其生物學(xué),旨在為該蟲的綜合治理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的采集與分子鑒定

在茶樹菇出菇期,成蟲標(biāo)本由作者等采自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶樹菇種植基地,并將新鮮標(biāo)本浸泡于無水乙醇(≥99.7%)中帶回實(shí)驗(yàn)室,放置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

使用動物DNA提取試劑盒(TSINGKE,通用型)對該昆蟲進(jìn)行DNA提取,提取步驟參照該試劑盒的方法,將提取獲得的DNA置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

以上述DNA為模板,使用引物L(fēng)CO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)對COⅠ基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系為:擎科金牌 Mix(green) 22 μL,DNA 1 μL,上下游引物各1 μL。PCR程序?yàn)? 98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s;55 ℃ 10 s;72 ℃ 20 s,共計35個循環(huán);72 ℃ 5 min,4 ℃條件下保存。將PCR產(chǎn)物置于-20 ℃條件下保存。

獲得的PCR產(chǎn)物送擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和遺傳距離分析

將公司返回的序列用DNAstar進(jìn)行拼接并去除序列兩端的引物。測序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上用BLAST工具進(jìn)行同源性比對,并結(jié)合GenBank中同源序列,使用MEGA 7.0軟件,采用鄰接法(neighbor-joining method, NJ),以Epidapussp. JQ613871為外群,基于Kimura-2參數(shù)模型,構(gòu)建基于遲眼蕈蚊COⅠ基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行分子鑒定和遺傳距離分析。系統(tǒng)發(fā)育樹各進(jìn)化枝進(jìn)行Bootstrap 1 000次置信度檢驗(yàn)。同時將實(shí)驗(yàn)獲得的序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫獲得對應(yīng)的序列號。

1.4 形態(tài)特征觀察與描述

將成蟲觸角、下顎須、前足脛節(jié)、尾器、前翅制成玻片標(biāo)本,標(biāo)本制作參照Steffan[10]和張曉云等[11]的方法。用尼康顯微鏡(Nikon, SMZ25),觀察成蟲和標(biāo)本的形態(tài)特征,并拍照、描述。

1.5 飼養(yǎng)與生活史觀察

2020年8月至2021年8月在江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶樹菇種植基地對蕈蚊的生活習(xí)性、危害特點(diǎn)進(jìn)行觀察記錄。按照張宏瑞等[12]的方法,將新產(chǎn)的卵放入長滿茶樹菇3號菌絲的培養(yǎng)皿中,在人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件溫度(25±1) ℃,相對濕度(75±5)%,光周期L∶D=12 h∶12 h。羽化后的成蟲轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)皿中。觀察并記錄該幼蟲的孵化、取食、化蛹、羽化、交配、產(chǎn)卵等行為。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO Ⅰ基因擴(kuò)增與測序

對該蟲提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)凝膠電泳結(jié)果顯示,在約750 bp處有1條特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。

1,眼蕈蚊樣品;2,陰性對照;M,DL5000 DNA marker。1, Sample of Sciaridae; 2, Negative control; M, DL5000 DNA marker.圖1 CO Ⅰ基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of the CO Ⅰ gene

2.2 分子鑒定與遺傳距離分析

將擴(kuò)增引物剪切后,COⅠ基因片段長658 bp。將測序結(jié)果在GenBank中對序列進(jìn)行Blast同源性比對分析,結(jié)果顯示該蟲與Bradysiaperaffinis的COⅠ序列(登錄號:JQ613799)有99.85%相似性,其種內(nèi)遺傳距離為0.002,與其他Bradysia屬的種間遺傳距離在0.162～0.198。序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫,登錄號為MZ956154?；?6個遲眼蕈蚊COⅠ的遺傳距離見表1。

表1 十六個遲眼蕈蚊CO Ⅰ基因序列的種內(nèi)與種間的遺傳距離Table 1 Intra-and inter-specific genetic distances of 16 Bradysia species based on the sequence of mitochondrial CO Ⅰ genes

將測定的序列與遲眼蕈蚊屬16條COⅠ基因序列進(jìn)行比對后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2),以Epidapussp. JQ613871為外群。其聚類分析結(jié)果表明,遲眼蕈蚊屬不同種的遲眼蕈蚊位于不同的分支,不同種的遲眼蕈蚊區(qū)分明顯。江西省采集的標(biāo)本B.peraffinisMZ956154,與B.peraffinisJX418077和B.peraffinisJQ613799聚為一支。

☆,江西采集的樣本?！? The specimen collected in Jiangxi province.圖2 運(yùn)用鄰接法構(gòu)建16個遲眼蕈蚊昆蟲CO Ⅰ基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 NJ trees based on the analysis of 16 Bradysia species CO Ⅰ gene sequences

2.3 分類地位及形態(tài)特征

分類地位:B.peraffinis屬于雙翅目(Diptera)眼蕈蚊科(Sciaridae)遲眼蕈蚊屬(Bradysia)。

形態(tài)特征如下。

卵:成蟲常產(chǎn)卵于培養(yǎng)料縫隙中,一般為聚產(chǎn)(圖3-A、B),也有散產(chǎn),散產(chǎn)有1粒、2粒、3粒、4粒等,聚產(chǎn)少的有20～30粒,多的有60～120粒。卵為橢圓形,卵長約0.20 mm(表2),表面光滑有光澤。初產(chǎn)時淡黃色(圖3-A、B),約2～3 d后卵一端逐漸變成深黃色,在孵化前變成黑色。

幼蟲:體細(xì)顯頭無足形,老熟收縮狀態(tài)下平均體長約5.43 mm(表2),頭部黑色堅硬,全身透明,咀嚼式口器,無腹足和剛毛,有吐絲拉網(wǎng)的習(xí)性(圖3-C、D)。

蛹:長2.29 mm(表2),化蛹前幼蟲身體變短變粗(圖4-A),剛化蛹顏色較淺,淡黃色(圖4-B、C)逐漸變成深黃色,復(fù)眼逐漸變黑,羽化前蛹體暗褐色(圖4-D)。被蛹,復(fù)眼、翅牙、足清晰可見,腹部向腹面彎曲。

A,化蛹前;B,蛹,腹面觀,C,蛹,側(cè)面觀;D,羽化前。A, Before pupation; B, Pupa, ventral view; C, Pupa, lateral view; D, Before eclosion.圖4 Bradysia peraffinis的蛹Fig.4 Pupas of the Bradysia peraffinis

雄成蟲(圖5-C、D):平均體長2.08 mm(表2),體黑褐色;觸角、頭部、胸部、腹背及尾器深于其他部位;前翅淡色,翅脈明顯;足細(xì)長,淺黑褐色,基節(jié)、腿節(jié)較脛節(jié)、跗節(jié)淺;觸角第4 鞭節(jié)長約為寬的1.19倍(圖6-A);下顎須3節(jié)(圖6-B),基節(jié)具毛,中節(jié)卵圓形,端節(jié)長約為中節(jié)的1.16倍;前足脛節(jié)有一橫排脛梳(圖6-C);尾器方形(圖6-D),著生細(xì)長剛毛,生殖刺突長約為寬的2.69倍,端部密生剛毛,末端著生大刺;前翅翅脈C和R具毛,M和Cu無毛,R1≈0.54 R,C≈0.61 W(圖6-E)。

A,雌蟲,背面觀;B,雌蟲,側(cè)面觀; C,雄蟲,背面觀;D,雄蟲,側(cè)面觀;E,交配。A, Female, dorsal view; B, Female, lateral view; C, Male, dorsal view; D, Male, lateral view; E, Mating.圖5 Bradysia peraffinis的成蟲Fig.5 Adults of the Bradysia peraffinis

A,第4鞭節(jié);B,下顎須;C,前足脛節(jié);D,雄性尾器腹面觀;E,雌性翅脈。A, The 4th flagellomere; B, Palpus; C, Fore tibiae; D, Hypopygium, male, ventral view; E, Wing vein, female.圖6 Bradysia peraffinis的主要形態(tài)特征Fig.6 Morphological characteristics of the Bradysia peraffinis

雌成蟲(圖5-A、B):平均體長2.54 mm(表2),特征與雄成蟲相似。

表2 Bradysia peraffinis各蟲態(tài)體長Table 2 Body length of Bradysia peraffinis

2.4 中國分布

湖北省[13]、江西省(新紀(jì)錄)。

2.5 寄主

可危害香菇[13]和茶樹菇。

2.6 生活習(xí)性和危害特征

2.6.1 生活史觀察

對卵、幼蟲、蛹、成蟲歷期觀察表明,在培養(yǎng)箱內(nèi)溫度(25±1) ℃,相對濕度(75±5)%,眼蕈蚊完成一代需20～29 d,各蟲態(tài)發(fā)育歷期見表3。

表3 四種蟲態(tài)歷期Table 3 The development time of 4 stages

2.6.2 成蟲交配及產(chǎn)卵習(xí)性

觀察發(fā)現(xiàn),成蟲活潑善飛,具有趨光性,喜歡在菇房電燈周圍、玻璃窗上行動,常在培養(yǎng)料、菌袋口、子實(shí)體上爬行、交尾,交尾時雄蟲表現(xiàn)主動,腹部末端向腹內(nèi)彎,成鉤狀,緊追雌蟲,快速挨靠雌蟲尾端,張開抱器鉗住雌蟲腹部末端進(jìn)行交尾(圖5-C)。交尾1～2 d后雌蟲產(chǎn)卵,產(chǎn)卵后1～2 d內(nèi)死亡。

茶樹菇菌包開袋出菇時,成蟲從袋口處進(jìn)入菌包,將卵產(chǎn)至濕潤、隱蔽處,如培養(yǎng)料間隙、菌柄叢的間隙、菌褶間等。

2.6.3 危害特點(diǎn)

B.peraffinis的發(fā)生密度受季節(jié)影響較大,3—6月份為高峰期,主要以幼蟲危害菌絲,一年發(fā)生多代,世代重疊,全年均可發(fā)生。產(chǎn)卵后3～5 d孵化,幼蟲生活在腐殖質(zhì)豐富的潮濕環(huán)境中,但水分過多時,幼蟲和卵均容易溺水死亡。幼蟲多鉆入長滿菌絲的栽培袋內(nèi),啃食菌絲、子實(shí)體以及培養(yǎng)料,被取食過的地方呈珊瑚狀,取食后留下粉塵狀黃褐色糞粒,菌袋內(nèi)形成明顯的“蟲道”,危害嚴(yán)重時,原基消失,子實(shí)體發(fā)爛,菌柄蛀成海綿狀,菌蓋只剩一層表皮,菌絲衰退,不能出菇,基質(zhì)松散,有大量紅褐色粉末,甚至導(dǎo)致整個菌包報廢(圖7-A、圖7-B)。幼蟲從孵化后到化蛹前一直在菌袋內(nèi)發(fā)育,老熟幼蟲爬至培養(yǎng)料口化蛹,羽化后飛出菌袋。

A,袋內(nèi)危害的幼蟲;B,危害后菌絲退化(左)與正常菌袋(右)對比。A, Larvae in the fungus bag; B, Damaged bag (left) and normal bag (right).圖7 危害癥狀圖Fig.7 Damage characteristics

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明,Bradysiaperaffinis是危害江西省茶樹菇的一種蕈蚊,為江西省新紀(jì)錄種。本文描述了其形態(tài)特征,明確了其遺傳距離、發(fā)育歷期、生活史和危害規(guī)律等。

有關(guān)B.peraffinis的報道較少,Shin等[14]將遲眼蕈蚊屬幼蟲的棲息地分為3種類型:活的植物體、腐木和枯枝落葉,B.peraffinis幼蟲棲息地大多為活的植物體,少部分為腐木。張丹鳳等[13]的調(diào)查表明,在湖北省遠(yuǎn)安縣發(fā)現(xiàn)該蟲危害香菇。Shin等[15]在韓國的橡樹木屑栽培的香菇中發(fā)現(xiàn)該蟲,但都未詳細(xì)研究其形態(tài)特征、生活史、危害規(guī)律等。本文首次明確了其發(fā)育歷期、生活史,并發(fā)現(xiàn)B.peraffinis為江西省新紀(jì)錄種。

茶樹菇雖然為江西省的主栽品種,年產(chǎn)量排全國第一名[16],但是江西省對茶樹菇病蟲害防控技術(shù)的研究十分薄弱,在江西省尚未有B.peraffinis的分布記錄,也無其危害茶樹菇的相關(guān)報道。茶樹菇能散發(fā)特殊的香味,因而易吸引害蟲危害[4],但對其具體危害種類的相關(guān)記錄卻不多。張宏瑞等[12]報道異遲眼蕈蚊Bradysiadifformis對茶樹菇的危害較嚴(yán)重。郝姍姍[17]報道,異遲眼蕈蚊Bradysiaimpatiens在茶樹菇上可以正常完成生長發(fā)育。本研究首次發(fā)現(xiàn),B.peraffinis也可危害茶樹菇,為茶樹菇上該蟲的鑒定提供了依據(jù),也提醒了昆蟲學(xué)家和農(nóng)民注意這一對茶樹菇具有重要經(jīng)濟(jì)意義的潛在害蟲,為該害蟲的綜合防控奠定基礎(chǔ)。

我國的茶樹菇栽培以自然環(huán)境的農(nóng)法栽培為主,栽培條件較落后,病蟲害發(fā)生嚴(yán)重[18]。本研究的試蟲均為培養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)所得,而菇房生存環(huán)境更為復(fù)雜,且有關(guān)B.peraffinis的分布、食性、適生環(huán)境等研究未有報道,因此,后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)對B.peraffinis發(fā)生規(guī)律的進(jìn)一步研究,探索綜合防治措施,以期實(shí)現(xiàn)該蟲的綠色防控。

致謝:感謝浙江省柑橘研究所呂佳研究實(shí)習(xí)員、江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所孫楊副研究員和曾榮研究實(shí)習(xí)員對本文的指導(dǎo)、幫助。