煙草根黑腐病拮抗菌的分離鑒定和生防作用特性研究

黃婉媛,李彩斌,彭 宇,李章海,黃衍章,丁 婷,*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,作物有害生物綜合治理安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230061; 2.貴州省煙草公司畢節(jié)市公司,貴州 畢節(jié) 551700; 3.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 煙草與健康研究中心,安徽 合肥 230061)

近年來,隨著貴州煙區(qū)煙草連作增多、栽培制度的變化,由根串珠霉(Thielaviopsisbasicola)引起的煙草根黑腐病在貴州畢節(jié)不同煙區(qū)均有不同程度的發(fā)生,且危害持續(xù)加重,已成為畢節(jié)煙區(qū)主要的土傳病害之一[1]。目前化學(xué)防治是防控該病害的主要方法,但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期施用易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性,造成環(huán)境污染等問題。生物防治因其綠色、無殘留和長(zhǎng)效性等優(yōu)點(diǎn),在煙草根黑腐病害防治中占有越來越重要的地位[1]。以煙草根黑腐病菌為靶標(biāo),相繼篩選獲得了多個(gè)芽孢桿菌屬及木霉屬的微生物并應(yīng)用于生產(chǎn)[2-4]。

功能菌要充分發(fā)揮其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)及防治病害中的作用,接種至土壤中的菌株能否在植物根部成功定殖至關(guān)重要[5]。菌株的定殖特性已成為篩選、評(píng)價(jià)功能菌的一個(gè)重要指標(biāo)。了解菌株的定殖特性,可以最大程度地發(fā)揮菌株的防病效果,實(shí)現(xiàn)生防菌的合理利用。本研究以煙草根黑腐病菌為靶標(biāo),對(duì)從貴州畢節(jié)煙區(qū)根際土壤中分離得到的多株根際微生物進(jìn)行拮抗菌株篩選,開展高效功能菌脂肽抑菌活性及編碼基因的檢測(cè)。研究畢節(jié)煙區(qū)主栽煙品種K326根系分泌物及其產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)功能菌趨化及生物膜形成的影響,以明確功能菌的定殖特性。本研究旨在從畢節(jié)煙區(qū)分離的根際微生物中篩選出生物脅迫下煙株根系分泌物表現(xiàn)出更強(qiáng)趨化性和生物膜形成能力的拮抗菌株,為開發(fā)效果穩(wěn)定的微生物農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草品種為貴州煙區(qū)主栽品種K326,煙草根黑腐病菌由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植病教研室提供。2020年5月從貴州省畢節(jié)市金沙、大方等煙區(qū)采集健康煙草根際土壤22份,其中拮抗菌S2-1和SNSY15-5均分離自貴州畢節(jié)大方煙區(qū)。

拮抗菌的分離和培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基,拮抗菌脂肽的培養(yǎng)采用Landy培養(yǎng)基,拮抗菌生物膜的培養(yǎng)采用Msgg培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 菌株的篩選和分離

稱取除雜過篩后的煙草根際土樣5.00 g(精確到0.01 g),無菌水定容至50 mL,28 ℃、200 r·min-1充分振蕩30 min,即成母液菌懸液,用無菌移液管吸取1.0 mL上述母液,加入9 mL無菌水,按10n進(jìn)行系列稀釋,依次得到10-2～10-6稀釋倍數(shù)的菌懸液。每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜的稀釋度,分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL,加至預(yù)先制備好的NA固體培養(yǎng)基平板上,用涂布棒在培養(yǎng)基表面將菌液來回推散涂抹均勻。每一稀釋度重復(fù)3次,于28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d。挑取生長(zhǎng)形狀不同的單菌落,多次平板培養(yǎng)和純化,直至獲得純化的單菌落,甘油保存。

1.2.2 抑菌活性檢測(cè)

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法,打孔器打取直徑為6 mm的煙草根黑腐病菌(T.basicola)菌餅接種至PDA空白培養(yǎng)基中央,于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d后形成菌落,在距菌落中心25 mm處等距離接種拮抗細(xì)菌,以只接種T.basicola菌的PDA培養(yǎng)基作空白對(duì)照(CK),每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù),置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng),逐日觀察記載病原菌菌落直徑,計(jì)算拮抗指數(shù)。

此外,拮抗菌與T.basicola對(duì)峙培養(yǎng)第7天,挑取與拮抗菌對(duì)峙培養(yǎng)面的T.basicola菌絲,鏡檢,以只接種病原菌的PDA培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

1.2.3 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定

拮抗細(xì)菌基因組提取參見謝永麗等[6]方法。16S rDNA擴(kuò)增上游引物:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;下游引物:5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。將16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化及測(cè)序,利用BLAST軟件進(jìn)行同源性比較,初步確定其所在地屬。在此基礎(chǔ)上,對(duì)上述已通過16S rDNA測(cè)序的拮抗菌株進(jìn)一步開展GyrB鑒定,GyrB擴(kuò)增上游引物:5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTC-3′;下游引物:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTY-

GA-3′。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,利用MEGA 10.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 拮抗菌脂肽粗提物對(duì)煙草根黑腐病菌的抑制活性

根據(jù)不同的地質(zhì)條件、潮汐風(fēng)浪等環(huán)境因素，對(duì)具有相同建設(shè)條件、有代表性的燈樁進(jìn)行設(shè)計(jì)（包括基礎(chǔ)選擇、選材、作用、尺寸、樓梯設(shè)計(jì)），以此為依據(jù)編制燈樁標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)施工圖紙。

拮抗菌脂肽粗提物的制備。采用Hsieh等[7]的HCl沉淀法提取拮抗物質(zhì),挑取拮抗菌單菌落至NA液體培養(yǎng)基,28 ℃,200 r·min-1培養(yǎng)24 h,獲得拮抗菌培養(yǎng)液。按照3%的接種量,將拮抗菌培養(yǎng)液接種于150 mL Landy培養(yǎng)液中,30 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)38 h后,離心去除菌體細(xì)胞,上清液加入HCl(6 mol·L-1)調(diào)pH值至2.0,4 ℃靜置過夜后收集沉淀,加入適量色譜級(jí)甲醇,用無菌棒攪拌溶解,4 ℃靜置8 h,上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)凍干,即為拮抗菌脂肽粗提物。脂肽粗提物用無菌水溶解,配制成10 mg·mL-1備用。

拮抗菌粗脂肽對(duì)煙草根黑腐病菌生長(zhǎng)的影響。融化后的PDA培養(yǎng)基降溫至45 ℃,15 mL PDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿,滴加脂肽粗提物母液充分混合,使PDA含粗脂肽提取物終濃度為0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mg·mL-1,制成含毒培養(yǎng)基。將培養(yǎng)好的T.basicola用打孔器打成直徑0.6 cm的菌碟,接種至平板中央,待空白對(duì)照(即皿內(nèi)粗脂肽提取物終濃度為0 mg·mL-1)長(zhǎng)至滿皿后,測(cè)量各濃度培養(yǎng)基上的菌落直徑,計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出拮抗菌脂肽粗提物對(duì)煙草根黑腐病菌的毒力回歸方程,相關(guān)系數(shù)和EC50及EC90。

拮抗菌脂肽合成基因的鑒定。用于鑒定脂肽合成基因bmyB、fenD、ituC、srfAA、srfAB、bioA、yngG和yndJ的8對(duì)特異引物均由安徽通用生物公司合成,引物序列見表1,擴(kuò)增條件參考楊瑞先等[8]方法。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后測(cè)序,所得序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)。

表1 用于鑒定脂肽合成基因的引物Table 1 Primer sequences for amplification of lipopeptide functional genes

1.2.5 煙草根系分泌物及有機(jī)酸對(duì)拮抗菌定殖特性的影響

煙草根系分泌物制備。煙草根系分泌物收集參考吳凱等[9]方法,將K326煙草種子播種在裝有營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的盆缽中,置28～30 ℃條件下培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗交替),待煙草長(zhǎng)至4～5片葉時(shí),取出煙草植株,在自來水下沖洗干凈根系,蒸餾水潤(rùn)洗3次后,將其轉(zhuǎn)入盛有150 mL無菌雙蒸水的燒杯中,所有根系都浸入水中培養(yǎng)48 h(28～30 ℃,16 h光照/8 h黑暗交替),收集培養(yǎng)液并冷凍干燥備用。

煙草根系分泌物及有機(jī)酸對(duì)拮抗菌生物膜形成的影響。采用六孔板培養(yǎng)拮抗菌,每孔加6 mL NA液體培養(yǎng)基、500 μL K326 根系分泌物(終濃度為10 mg·mL-1)或500 μL有機(jī)酸溶液(終濃度為10 mg·mL-1的蘋果酸、草酸、檸檬酸及100 mg·mL-1琥珀酸)、10 μL拮抗菌S2-1和SNSY15-5菌懸液(1×108CFU·mL-1),以在NA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的S2-1和SNSY15-5為對(duì)照,30 ℃靜置培養(yǎng)72 h后,觀察生物膜的形成。

參照Hamon等[12]的方法,利用96孔板法定量生物膜,測(cè)定K326根系分泌物及其有機(jī)酸對(duì)拮抗菌S2-1和SNSY15-5生物膜形成的影響。96孔板上每孔加150 μL NA液體培養(yǎng)基、50 μL K326根系分泌物(終濃度為10 mg·mL-1)或50 μL有機(jī)酸標(biāo)樣(終濃度為10 mg·mL-1的蘋果酸、草酸、檸檬酸及100 mg·mL-1琥珀酸)、20 μL拮抗菌S2-1和SNSY15-5菌懸液;對(duì)照組每孔加150 μL NA液體培養(yǎng)基、50 μL無菌水、20 μL拮抗菌S2-1和SNSY15-5菌懸液。30 ℃條件下靜置培養(yǎng)72 h,緩慢吸出生物膜下面的培養(yǎng)液,用PBS緩沖液反復(fù)沖洗3～4遍后洗凈培養(yǎng)液,室溫靜置,自然風(fēng)干。在30 ℃條件下用1%的結(jié)晶紫染色15 min后,再用PBS緩沖液反復(fù)沖洗至無色,再加入200 μL 90%乙醇靜置30 min,使用分光光度計(jì)在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定拮抗菌生物膜量。

K326根系分泌物及其有機(jī)酸對(duì)拮抗菌生物膜成膜基因的表達(dá)影響。分別將6 mL拮抗菌S2-1及SNSY15-5的液體培養(yǎng)物(均為1×108CFU·mL-1)和5 mL K326根系分泌物(終濃度10 mg·mL-1)或不同有機(jī)酸類物質(zhì)(終濃度10 mg·mL-1的蘋果酸、草酸、檸檬酸及100 mg·mL-1琥珀酸)接種至200 mL NA無菌培養(yǎng)液中,以接種至200 mL NA無菌培養(yǎng)液中正常生長(zhǎng)的S2-1及SNSY15-5為對(duì)照,30 ℃、200 r·min-1,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)RNA提取試劑盒(購(gòu)于TaKaRa)說明書提取RNA,隨后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞生物工程,湖南)根據(jù)說明書將RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到的cDNA利用核酸定量?jī)xThermoscientific NANODROP 1000進(jìn)行定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)得的各項(xiàng)數(shù)據(jù)采用DPS (Data Processing System) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行差異顯著性分析,Duncan新復(fù)極差法處理,在0.05水平上分別分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草根際拮抗菌的分離篩選

經(jīng)稀釋涂布平板法,從22份煙草根際土樣中分離得到67株菌株。以煙草根黑腐病菌T.basicola為靶標(biāo),經(jīng)平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行初篩和復(fù)篩,得到12個(gè)對(duì)T.basicola有較好拮抗活性的根際微生物。其中SNSY15-5和S2-1對(duì)T.basicola拮抗指數(shù)分別達(dá)到61.56%和52.78%,與正常生長(zhǎng)的T.basicola菌落相比,上述兩株拮抗菌可明顯抑制病原菌的菌絲生長(zhǎng)。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),拮抗菌S2-1和SNSY15-5與T.basicola對(duì)峙培養(yǎng)7 d,均可造成T.basicola菌絲分枝增多、膨大變粗、扭曲畸形,對(duì)照菌絲生長(zhǎng)均勻,光滑,無畸形膨大現(xiàn)象(圖1)。

1,SNSY15-5與煙草根黑腐病菌對(duì)峙培養(yǎng)7 d;2,S2-1生防菌與煙草根黑腐病菌對(duì)峙培養(yǎng)7 d;3,煙草根黑腐病菌培養(yǎng)10 d;a,煙草根黑腐病原菌正常菌絲形態(tài);b,接種拮抗菌對(duì)峙培養(yǎng)7 d后的煙草根黑腐菌絲形態(tài)。1, SNSY15-5 and Thielaviopsis basicola were cultured in confrontation for 7 days; 2, S2-1 and Thielaviopsis basicola were cultured in confrontation for 7 days; 3, Thielaviopsis basicola were cultured separately for 10 days respectively; a, Normal mycelium morphology of Thielaviopsis basicola; b, Mycelial morphology of Thielaviopsis basicola treated with antagonistic bacteria for 7 days.圖1 拮抗菌對(duì)煙草根黑腐病菌的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of antagonistic bacteria on Thielaviopsis basicola

2.2 拮抗菌SNSY15-5和S2-1的分子生物學(xué)鑒定

以煙草根際拮抗菌SNSY15-5和S2-1的基因組DNA為模板進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序,在明確SNSY15-5和S2-1皆為芽孢桿菌屬的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)上述兩個(gè)菌株開展GyrB鑒定,同源性比對(duì)后采用MEGA7.0軟件的最大似然法建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。在SNSY15-5和S2-1的GyrB系統(tǒng)發(fā)育樹中,菌株S2-1與Bacillusvelezensis(MT081105.1)聚類為同一分支,同源性達(dá)到95%,而菌株SNSY15-5與Bacillussubtilis(JQ579620.1)同源性為92%(圖2)。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析,可知菌株S2-1和SNSY15-5均為芽孢桿菌屬細(xì)菌。

圖2 拮抗菌的 GyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of GyrB sequence of antagonistic bacteria

2.3 拮抗菌SNSY15-5和S2-1脂肽粗提物對(duì)T. basicola的抑菌活性

將T.basicola接種至含不同濃度拮抗菌SNSY15-5和S2-1脂肽粗提物的PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7d,觀察T.basicola在含不同濃度拮抗菌脂肽粗提物的PDA培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)T.basicola在脂肽粗提物終濃度0 mg·mL-1的培養(yǎng)基上長(zhǎng)滿整個(gè)平板,而經(jīng)拮抗菌SNSY15-5和S2-1不同濃度粗脂肽提取物處理的T.basicola菌生長(zhǎng)均受到一定程度的抑制,且隨著SNSY15-5和S2-1粗脂肽提取物濃度的增加,對(duì)T.basicola生長(zhǎng)的抑制作用越明顯(圖3)。測(cè)量T.basicola在含拮抗菌SNSY15-5和S2-1脂肽粗提取物不同濃度的PDA培養(yǎng)基中的菌絲直徑,計(jì)算T.basicola的菌絲生長(zhǎng)抑制率,繪制毒力回歸方程,計(jì)算出相應(yīng)的EC50、EC90值(表2)。拮抗菌S2-1和SNSY15-5脂肽粗提物對(duì)T.basicola的EC50分別為1.93和2.56 mg·mL-1, EC90分別為4.43和4.41 mg·mL-1,比較可知,拮抗菌S2-1粗脂肽對(duì)T.basicola的毒力較強(qiáng)。

A, SNSY15-5; B, S2-1.圖3 拮抗菌粗脂肽提取物對(duì)煙草根黑腐病菌生長(zhǎng)的抑制情況Fig.3 Effects of crude lipopeptide extracts of antagonistic bacteria on Thielaviopsis basicola

表2 拮抗菌脂肽粗提取物對(duì)煙草根黑腐病菌生長(zhǎng)的影響Table 2 Antagonistic effect of crude lipopeptide extracts of antagonistic bacteria on Thielaviopsis basicola

2.4 拮抗菌SNSY15-5和S2-1脂肽合成基因的擴(kuò)增

利用8對(duì)脂肽合成基因的特異引物,通過PCR檢測(cè)拮抗菌SNSY15-5和S2-1的部分脂肽合成基因。發(fā)現(xiàn)SNSY15-5含有參與脂肽類家族細(xì)菌素(bacteriocin)、生物素操縱子(operon)和假定蛋白(yngG)合成的基因;S2-1含有參與脂肽類家族生物素操縱子(operon)合成的基因,圖4表明,菌株SNSY15-5和S2-1可能具有產(chǎn)生上述生防物質(zhì)的能力。將擴(kuò)增獲得的特異條帶回收純化,克隆測(cè)序獲得序列,利用BLASTX將獲得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)SNSY15-5和S2-1與貝萊斯芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌生防功能基因的蛋白質(zhì)序列同源性在95%以上,證明本試驗(yàn)利用特異性引物所擴(kuò)增到的基因片段為相應(yīng)的生防功能基因序列(圖5)。

M, DL 2000 marker; 1表示S2-1的功能基因bioA;2、3、4分別表示SNSY15-5的功能基因bioA、bmyB、yngG。M, DL 2000 marker; 1 represent the functional gene bioA of S2-1; 2, 3, 4 represent the functional genes bioA,bmyB and yngG of SNSY15-5, respectively.圖4 拮抗菌S2-1和SNSY15-5脂肽相關(guān)基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of functional genes coding lipopeptides of the S2-1 and SNSY15-5

圖5 拮抗菌S2-1和SNSY15-5脂肽相關(guān)基因的進(jìn)化分析Fig.5 Evolutionary analysis of functional genes coding lipopeptides of S2-1and SNSY15-5

2.5 煙草根系分泌物及有機(jī)酸對(duì)拮抗菌趨化特性的影響

前期試驗(yàn)證實(shí),煙草品種K326根系可分泌草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸這4種有機(jī)酸[10]。利用趨化性試驗(yàn),探究K326煙草根系分泌物及所產(chǎn)生的各種有機(jī)酸對(duì)拮抗菌S2-1和SNSY15-5根部定殖的影響。結(jié)果如表3所示,拮抗菌S2-1和SNSY15-5均可不同程度利用K326煙草根系分泌物及產(chǎn)生的有機(jī)酸。蘋果酸對(duì)S2-1和SNSY15-5均具有較強(qiáng)的吸引作用,分別達(dá)到了63.35×104CFU·mL-1和42.35×104CFU·mL-1;琥珀酸對(duì)S2-1吸引作用最弱,僅為12.30×104CFU·mL-1,檸檬酸對(duì)SNSY15-5吸引作用最弱,為17.35×104CFU·mL-1。兩種拮抗菌的趨化特性依次為,S2-1:蘋果酸>草酸>檸檬酸>K326根系分泌物>琥珀酸>CK;SNSY15-5:蘋果酸>K326根系分泌物>琥珀酸>草酸>檸檬酸>CK。

表3 拮抗菌對(duì)煙草根系分泌物和有機(jī)酸的趨化反應(yīng)Table 3 The chemotactic response of antagonistic bacteria to the K326 tobacco root exudates and organic acid

2.6 煙草根系分泌物及有機(jī)酸對(duì)拮抗菌生物膜成膜能力的影響

拮抗菌株在NA液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)72 h后,觀察生物膜形成狀態(tài),發(fā)現(xiàn)拮抗菌S2-1在NA液體培養(yǎng)基,以及添加了根系分泌物及有機(jī)酸的培養(yǎng)基中均能形成白色的生物膜,但檸檬酸和蘋果酸處理組形成的生物膜與根系分泌物及琥珀酸等處理組相比,較稀疏,分散呈小斑塊狀;SNSY15-5在NA液體培養(yǎng)基,以及添加了根系分泌物及琥珀酸、檸檬酸的培養(yǎng)基中均能形成明顯的生物膜,呈白色云霧狀團(tuán)集,草酸、蘋果酸對(duì)SNSY15-5生物膜的形成無明顯促進(jìn)作用(圖6)。從外觀可以初步看出,根系分泌物處理后對(duì)拮抗菌生物膜的形成具有促進(jìn)作用。經(jīng)結(jié)晶紫染色,在570 nm下測(cè)定拮抗菌生物膜量。添加K326根系分泌物、草酸及琥珀酸對(duì)S2-1生物膜形成具有促進(jìn)作用,添加上述3種物質(zhì)后的D570均高于對(duì)照組;檸檬酸和蘋果酸對(duì)S2-1生物膜形成沒有作用。草酸、琥珀酸、蘋果酸對(duì)SNSY15-5生物膜的形成無促進(jìn)作用,其D570均低于對(duì)照組;K326根系分泌物及檸檬酸對(duì)SNSY15-5生物膜的形成具有明顯促進(jìn)作用(表4)。上述結(jié)果與拮抗菌生物膜定性分析結(jié)果一致。

圖6 K326根系分泌物及有機(jī)酸對(duì)拮抗菌生物膜成膜能力的影響Fig.6 Effect of the K326 tobacco root exudates and organic acid on the biofilm formation of antagonistic bacteria

表4 K326根系分泌物及有機(jī)酸對(duì)拮抗菌生物膜成膜能力的定量檢測(cè)Table 4 Quantitative detection of the effect of K326 root exudates and organic acids on the biofilm formation of antagonistic bacteria

2.7 煙草根系分泌物及有機(jī)酸對(duì)拮抗菌生物膜成膜基因表達(dá)的影響

明確了K326根系分泌物、檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸等均可促進(jìn)拮抗菌S2-1和SNSY15-5生物膜的形成。選用K326根系分泌物、檸檬酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸5種物質(zhì)研究其對(duì)拮抗菌S2-1和SNSY15-5生物膜合成相關(guān)基因epsD、yqxM、kinC等表達(dá)的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同處理組的S2-1和SNSY15-5的epsD、yqxM、kinC基因的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),K326根系分泌物均可促進(jìn)拮抗菌S2-1和SNSY15-5生物膜成膜基因epsD、yqxM、kinC的表達(dá),K326根系分泌物處理后的S2-1生物膜成膜基因epsD、yqxM、kinC表達(dá)分別上調(diào)1.13、1.21、1.31倍,而K326根系分泌物處理后的SNSY15-5生物膜成膜基因epsD、yqxM、kinC的表達(dá)量分別上調(diào)1.32、1.28、1.38倍。此外,加入草酸可促進(jìn)S2-1生物膜成膜相關(guān)基因kinC、yqxM表達(dá),表達(dá)量比對(duì)照組分別高出1.31、1.40倍;檸檬酸和蘋果酸對(duì)S2-1生物膜成膜基因表達(dá)均呈負(fù)調(diào)控趨勢(shì)。與此同時(shí),檸檬酸對(duì)SNSY15-5成膜基因yqxM、kinC表達(dá)呈正調(diào)控,而草酸、蘋果酸、琥珀酸均對(duì)SNSY15-5生物膜成膜基因表達(dá)呈負(fù)調(diào)控趨勢(shì)。該結(jié)果也在一定程度上表明拮抗菌S2-1和SNSY15-5在K326煙草植株根際具有較好的定殖能力,草酸和檸檬酸分別對(duì)促進(jìn)S2-1和SNSY15-5生物膜成膜起到促進(jìn)作用(圖7)。

CK,對(duì)照組;W1,拮抗菌添加K326根系分泌物處理組;W2,拮抗菌添加檸檬酸處理組;W3,拮抗菌添加蘋果酸處理組;W4,拮抗菌添加草酸處理組;W5,拮抗菌添加琥珀酸處理組。CK, Control group; W1, Antagonistic bacteria treated with K326 root exudates; W2, Antagonistic bacteria treated with citric acid; W3, Antagonistic bacteria treated with malic acid; W4, Antagonistic bacteria treated with oxalic acid; W5, Antagonistic bacteria treated with succinic acid.圖7 K326根系分泌物及有機(jī)酸對(duì)拮抗菌生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of K326 root exudates and organic acids on gene expression related to antagonistic biofilm formation

3 討論

在植物病害生物防治中,芽孢桿菌屬微生物是應(yīng)用較廣泛、生防效果較好的一類細(xì)菌,目前利用芽孢桿菌屬微生物防治青枯病的研究已有大量報(bào)道[13-14]。研究表明,芽孢桿菌可通過產(chǎn)生表面活性素、伊枯草菌素等多種抗菌物質(zhì),以及誘導(dǎo)寄主植物形成對(duì)病原菌的抗性等直接或間接途徑對(duì)植物病原菌生長(zhǎng)形成抑制作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn),SNSY15-5含有參與脂肽類家族細(xì)菌素 (bacteriocin)、生物素操縱子 (operon) 和假定蛋白 (yngG)合成的基因;S2-1菌株中含有參與脂肽類家族生物素操縱子合成的基因。細(xì)菌素作為核糖體合成的天然抑菌產(chǎn)物,具有安全、高效、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),可以作為抗生素的一種有效代替產(chǎn)物來解決耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生、增殖和傳播[16];生物素操縱子和假定蛋白則在芽孢桿菌合成生物素以及相關(guān)抑菌蛋白的過程中發(fā)揮重要作用[17-18];上述結(jié)果表明,S2-1和SNSY15-5產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在生物防治領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力。但芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)較多,S2-1和SNSY15-5對(duì)T.basicola的抑菌作用僅是脂肽類物質(zhì)的作用結(jié)果,還是脂肽物質(zhì)和其他抗菌蛋白共同防病作用,仍需做進(jìn)一步研究。

植物在其生長(zhǎng)過程中,可通過根系向周圍環(huán)境分泌大量的光合產(chǎn)物,如糖、有機(jī)酸和次生代謝產(chǎn)物來影響根際微生物的生存環(huán)境和基因表達(dá)。根際細(xì)菌不僅會(huì)受到植物種類的調(diào)控,還會(huì)受到同種植物不同品種的影響[19]。功能菌要充分發(fā)揮其在促進(jìn)植物生長(zhǎng)及防治病害中的作用,釋放至土壤中的菌株能否在植物根部成功定殖至關(guān)重要[5]。細(xì)菌趨化性和生物膜形成能力被認(rèn)為是評(píng)判其定殖能力的兩個(gè)重要指標(biāo)[20]。細(xì)菌趨化性作為定殖過程中的重要步驟,可對(duì)植物根系分泌物中的特定物質(zhì)進(jìn)行信號(hào)響應(yīng)[20]。Rudrappa等[11]指出,擬南芥根系分泌物中的蘋果酸可強(qiáng)烈誘導(dǎo)芽孢桿菌的趨化性;番茄根系分泌物中的蘋果酸和檸檬酸均可誘導(dǎo)解淀粉芽孢桿菌在根際的趨化性[21]。本研究結(jié)果表明,煙草根系分泌物及其分泌的草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸均對(duì)芽孢桿菌S2-1和SNSY15-5具有正趨化性。其中蘋果酸對(duì)芽孢桿菌S2-1和SNSY15-5的趨化性影響最大,該結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[9]。究其原因,有機(jī)酸引起的細(xì)菌趨化性可能是有機(jī)酸在作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響細(xì)菌趨化性的同時(shí),作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,如蘋果酸及檸檬酸,又影響細(xì)菌自身的三羧酸循環(huán)[22]。

生物膜是細(xì)菌借助自身產(chǎn)生的多糖、蛋白質(zhì)和DNA等胞外基質(zhì)的黏附力而在液體、固體等介質(zhì)的接觸面形成的多細(xì)胞群體。生物膜中的細(xì)菌能夠共享水分、氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),比游離狀態(tài)的細(xì)菌具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性,有利于細(xì)菌自身抵御外界不良環(huán)境,保持其生防能力?？莶菅挎邨U菌生物膜形成能力越強(qiáng),防治植物病害效果越顯著[23]。本研究發(fā)現(xiàn),加入K326根系分泌物均可明顯促進(jìn)S2-1和SNSY15-5生物膜成膜基因epsD、yqxM、kinC表達(dá),而草酸和檸檬酸分別對(duì)S2-1和SNSY15-5生物膜成膜起到促進(jìn)作用。系列研究結(jié)果表明,植株根系分泌物可促進(jìn)芽孢桿菌生物膜形成,如番茄根系分泌物通過依賴于傳感器組氨酸激酶KinD,從而顯著促進(jìn)Bacillussubtilis生物膜的形成[24]。另一方面,根系分泌物中的蘋果酸和檸檬酸可誘導(dǎo)芽孢桿菌屬微生物成膜基因的表達(dá)[21],Rudrappa等[11]發(fā)現(xiàn),根系分泌物中的蘋果酸可誘導(dǎo)BacillussubtilisFB17菌株的yqxM基因的表達(dá),進(jìn)而影響了生物膜形成中多聚物的生成;0.5～5 mmol·L-1的L-蘋果酸主要通過影響芽孢桿菌KinD-SpoOA通路,間接影響芽孢桿菌的生物膜形成[24];檸檬酸也能較好地促進(jìn)BacillusamyloliquefaciensSQR9的生物膜形成[25]。本研究結(jié)果再次證明了煙草根系分泌物及其分泌的檸檬酸對(duì)根際部分芽孢桿菌生物膜的形成具有正調(diào)控作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)草酸對(duì)生防細(xì)菌趨化、生物膜成膜起到促進(jìn)作用,已有研究結(jié)果表明,草酸可作為提供給細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和信號(hào)分子,對(duì)貝萊斯芽孢桿菌S3-1[26]和煙草青枯病菌R.solanacearum[27]呈現(xiàn)較強(qiáng)的吸引作用;但Anang等[28]的研究結(jié)果指出,草酸有毒的特性會(huì)減少細(xì)菌的數(shù)量,從而表現(xiàn)為草酸對(duì)細(xì)菌的吸引作用并不很強(qiáng)。本研究結(jié)果與Wu等[27]的研究結(jié)果一致,證明了草酸可促進(jìn)部分芽孢桿菌在植株根際的定殖。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)分離得到兩株對(duì)煙草根黑腐病菌T.basicola有較高拮抗活性的煙草根際芽孢桿菌S2-1和SNSY15-5,其脂肽粗提物對(duì)T.basicola毒力較強(qiáng);SNSY15-5含有參與脂肽類家族細(xì)菌素(bacteriocin)、生物素操縱子(operon)和假定蛋白(yngG)合成的基因;S2-1菌株中含有參與脂肽類家族生物素操縱子(operon)合成的基因;煙草根系分泌物產(chǎn)生的蘋果酸對(duì)S2-1和SNSY15-5有較強(qiáng)吸引作用;煙草品種K326根系分泌物及其草酸可促進(jìn)S2-1生物膜形成,而K326根系分泌物及其檸檬酸則促進(jìn)SNSY15-5生物膜形成;綜合說明芽孢桿菌S2-1和SNSY15-5具有較好的生防應(yīng)用潛力。