高良姜素減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)心臟纖維化的作用機(jī)制

摘要 目的：探討高良姜素（Galangin）對異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)心臟纖維化的作用機(jī)制。方法：將30只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、ISO組、高良姜素低劑量組［25 mg/（kg·d）］、高良姜素中劑量組［50 mg/（kg·d）］、高良姜素高劑量組［100 mg/（kg·d）］。處理結(jié)束后行心臟超聲評估心功能［左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）］；測量小鼠體質(zhì)量（BW）、心臟重量（HW）、脛骨長度（TL），計(jì)算心臟重量與體質(zhì)量比值（HW/BW）、心臟重量與脛骨長度比值（HW/TL），評估心肌肥厚情況。天狼星紅染色評價(jià)心臟纖維化程度；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測炎癥標(biāo)志物白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和纖維化標(biāo)志物膠原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）、膠原蛋白Ⅲ（Collagen Ⅲ）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）mRNA水平；試劑盒檢測心臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：與正常組比較，ISO組小鼠HW/BW、HW/TL、LVEDD及LVESD升高，LVEF和LVFS降低，IL-6、IL-1β、TNF-α、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和TGF-β1 mRNA表達(dá)水平升高，心臟SOD和CAT活性降低，MDA含量升高，心肌細(xì)胞橫截面積增大，心臟纖維化面積增加（P＜0.05）。與ISO組比較，高良姜素高劑量組心臟纖維化面積減小，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、IL-6 mRNA表達(dá)水平降低，SOD活性升高，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高良姜素中劑量組TGF-β1低于ISO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：高良姜素可減輕ISO誘導(dǎo)的心臟纖維化，其機(jī)制可能與抑制炎癥、氧化應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞 心臟纖維化；高良姜素；異丙腎上腺素；炎癥；氧化應(yīng)激；小鼠；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.24.009

Mechanism of Galangin on Isoprenaline-induced Cardiac Fibrosis

SHANG Ruru， TONG Manlin， LIU Xiaohong

Shanxi Provincial People′s Hospital， Taiyuan 030012， Shanxi， China

Corresponding Author LIU Xiaohong， E-mail： docliuxh@163.com

Abstract Objective：To investigate the mechanism of Galangin on isoprenaline（ISO）-induced cardiac fibrosis.Methods：Thirty C57BL/6 mice were randomly divided into the normal group，ISO group，low-dose galangin group［25 mg/（kg·d）］，medium-dose galangin group ［50 mg/（kg·d）］，and high-dose galangin group ［100 mg/（kg·d）］.After treatment，cardiac ultrasound was performed to detect cardiac function ［left ventricular ejection fraction（LVEF），left ventricular short-axis shortening（LVFS），left ventricular end-systolic internal diameter（LVESD），and left ventricular end-diastolic internal diameter（LVEDD）］.The body mass（BW），heart weight（HW），and tibia length（TL） of the mice were measured，and the heart weight-weight to body mass ratio（HW/BW） was detected，and the heart weight to tibia length ratio（HW/TL）were collected to assess cardiac hypertrophy.The degree of cardiac fibrosis was detected by sirius scarlet staining.The inflammatory markers interleukin-6（IL-6），interleukin-1β（IL-1β），tumor necrosis factor-α（TNF-α），and fibrotic markers collagen Ⅰ（Collagen Ⅰ），collagen Ⅲ（Collagen Ⅲ），transforming growth factor-β1（TGF-β1） mRNA levels were detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（qPCR）.The kit was used to detect the oxidative stress indicators superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT） activity，and malondialdehyde（MDA） content in heart tissue.Results：Compared with the normal group，HW/BW，HW/TL，LVEDD，and LVESD in the ISO group were higher，LVEF and LVFS were less，levels of IL-6，IL-1β，TNF-α，Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ，and TGF-β1 mRNA were higher，SOD and CAT activities were less，and MDA content was higher.The cardiomyocyte cross-sectional area and cardiac fibrosis area were higher（P＜0.05）.Compared with the ISO group，the area of cardiac fibrosis was less in the high-dose galangin group，the expression levels of Collagen Ⅰ，Collagen Ⅲ，and the mRNA of IL-6 were less，the activity of SOD was higher，and the content of MDA was less（P＜0.05）.TGF-β1 in the medium-dose galangin group was less than that in the ISO group（P＜0.05）.Conclusion：Galangin could alleviate isoproterenol-induced cardiac fibrosis，and its mechanism might be related to inhibiting inflammation and oxidative stress.

Keywords cardiac fibrosis; Galangin; isoproterenol; inflammation; oxidative stress; mice; experimental study

心力衰竭是心血管疾病的終末階段，發(fā)病率及死

基金項(xiàng)目 山西省衛(wèi)生健康委科研課題項(xiàng)目（No.2021112）

作者單位 1.山西省人民醫(yī)院（太原" 030012）；2.山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院

通訊作者 劉曉紅，E-mail：docliuxh@163.com

引用信息 尚茹茹，童曼琳，劉曉紅.高良姜素減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)心臟纖維化的作用機(jī)制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2023，21（24）：4524-4529.

亡率均較高，心力衰竭發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，尚未明確。目前認(rèn)為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活導(dǎo)致的心室重塑是引起心力衰竭的關(guān)鍵因素，心臟纖維化是心室重塑的主要病理特征，炎癥在心臟纖維化過程中發(fā)揮著重要作用［1］。心力衰竭發(fā)展過程中產(chǎn)生大量的促炎因子，這些促炎因子導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和心臟纖維化。因此，抑制心臟炎癥、纖維化有助于改善心力衰竭預(yù)后。高良姜素（Galangin，3，5，7-三羥基黃酮）是一種天然來源的黃酮醇類化合物，主要分布于姜科植物高良姜的干燥根莖中。多項(xiàng)研究顯示，高良姜素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤及抗纖維化等作用［2-3］。有研究顯示，高良姜素可減少活性氧生成，抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)及氣道重塑［4］。本研究探討高良姜素通過抗炎、抗氧化、抗纖維化等抑制心臟纖維化發(fā)揮抗心力衰竭的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物模型及分組

C57BL/6小鼠購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司［生產(chǎn)許可證：SCK（京）2019-0010］，6～8周齡，雄性，體質(zhì)量23.5～25.5 g。飼養(yǎng)于無特定病原體（SFP）級環(huán)境中，自由攝取食物，晝夜12 h。異丙腎上腺素（ISO）組（6只）小鼠在實(shí)驗(yàn)第1日皮下注射ISO［5 mg/（kg·d）］，共治療14 d，之后每日灌胃對應(yīng)體積的0.5%羥甲基纖維素溶液，持續(xù)4周。高良姜素各劑量組（每組6只）在實(shí)驗(yàn)第1天皮下注射ISO［5 mg/（kg·d）］同時(shí)給予不同濃度的高良姜素（重懸于0.5%羥甲基纖維素溶液，每次灌胃前混勻）灌胃，ISO使用14 d，之后持續(xù)灌胃高良姜素至4周。正常組（6只）從實(shí)驗(yàn)開始每日灌胃對應(yīng)體積的0.5%羥甲基纖維素溶液，持續(xù)4周。詳見圖1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

高良姜素（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；ISO（sigma，美國）；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的麥胚芽凝集素（WGA）染色試劑盒（Sigma，美國）；天狼星紅染色試劑盒（北京索萊寶）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成）；過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成）；心臟超聲測量系統(tǒng)（美國GE公司Vivid 7 pro超聲系統(tǒng)）；熒光顯微鏡（Nikon）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）儀（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心臟超聲心動(dòng)圖檢查

實(shí)驗(yàn)4周，行心臟彩超檢測小鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD），上述數(shù)據(jù)測量3次，取平均值，記錄分析。

1.2.2 小鼠體質(zhì)量、心臟重量及脛骨長度檢測

完成心臟超聲的小鼠，測量體質(zhì)量（body weight，BW），每只小鼠稱量3次，取平均值并記錄。給予1%戊巴比妥鈉溶液（20 mg/kg）腹腔注射，前胸部開口，暴露心臟，心尖部穿刺，用肝素鹽水灌注5 min，取材。測量心臟重量（heart weight，HW）、脛骨長度（tibial length，TL）。計(jì)算心臟重量與體質(zhì)量比值（HW/BW）、心臟重量與脛骨長度比值（HW/TL）。

1.2.3 組織取材、石蠟切片制備、常規(guī)染色

組織取材后，經(jīng)10%甲醛固定，乙醇脫水、石蠟包埋，垂直于心臟長軸連續(xù)切成5 μm的石蠟組織切片，進(jìn)行WGA染色。采用Nikon顯微鏡收集圖像，并使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.4 qPCR檢測

提取小鼠心臟組織總RNA后，將2 μg的RNA按照說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用SYBR（Servicebio公司），按照說明書檢測相關(guān)基因，引物序列如下：膠原蛋白（Collagen）Ⅰ，正向引物5′AAGAAGCACGTCTGGTTTGGAG3′，反向引物5′GGTCCATGTAGGCTACGCTGTT3′；Collagen Ⅲ，正向引物5′TTTCTTCTCACCCTTCTTCATCC3′，反向引物5′CATATTTGACATGGTTCTGGCTTC3′；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1），正向引物5′TAATGGTGGACCGCAACAAC3′，反向引物5′CCACATGTTGCTCCACACTTGAT3′；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），正向引物5′TCAAATCTCGCAGCAGCACATC3′，反向引物5′CGTCACACACCAGCAGGTTATC3′；IL-6，正向引物5′CCCCAATTTCCAATGCTCTCC3′；反向引物5′CGCACTAGGTTTGCCGAGTA3′；腫瘤壞死因子-α（TNF-α），正向引物5′CCCTCACACTCACAAACCACC3′，反向引物5′CTTTGAGATCCATGCCGTTG3′；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），正向引物5′CCTCGTCCCGTAGACAAAATG3′，反向引物5′TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT3′。

1.2.5 心臟組織氧化應(yīng)激水平檢測

取適量心臟組織，按照試劑盒說明書步驟分別進(jìn)行SOD和CAT活性檢測，同時(shí)檢測心臟組織MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖表制作使用GraphPad Prism 9.5軟件完成。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)比較

與正常組比較，ISO組小鼠HW/BW、HW/TL升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖2。

2.2 各組小鼠心肌細(xì)胞橫截面積及心臟纖維化面積比較

WGA染色結(jié)果顯示：與正常組比較，ISO組小鼠心肌細(xì)胞橫截面積增大（P＜0.05）。天狼星紅染色結(jié)果顯示，與正常組比較，ISO組小鼠心臟纖維化程度加重（P＜0.05）；與ISO組比較，高良姜素高劑量組心臟纖維化程度減輕（P＜0.05）。詳見圖3、圖4。

2.3 各組小鼠心功能指標(biāo)比較

與正常組比較，ISO組小鼠LVEF和LVFS下降，LVEDD、LVESD升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖5。

2.4 各組小鼠心臟Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平比較

與正常組比較，ISO組小鼠心臟纖維化標(biāo)志物Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1 mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與ISO組比較，高良姜素高劑量組心臟纖維化標(biāo)志物Collagen Ⅰ、Collagen ⅢmRNA水平降低，高良姜素中劑量組心臟纖維化標(biāo)志物TGF-β1 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖6。

2.5 各組小鼠心臟組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

與正常組比較，ISO組心臟炎癥標(biāo)志物IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與ISO組比較，高良姜素高劑量組心臟炎癥標(biāo)志物IL-6 mRNA降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖7。

2.6 各組小鼠心臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、CAT水平比較

與正常組比較，ISO組小鼠心臟組織SOD、CAT活性降低，心臟組織MDA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與ISO組比較，高良姜素高劑量組SOD活性升高，MDA含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖8。

3 討 論

心室重塑是心力衰竭發(fā)生發(fā)展中的重要病理過程，心肌細(xì)胞在持續(xù)壓力超負(fù)荷、缺血、缺氧、炎癥等應(yīng)激條件下發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變，包括左心室形態(tài)改變、心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞凋亡［5］。心肌損傷的早期階段，大量的炎癥細(xì)胞浸潤到心肌損傷區(qū)域并發(fā)揮作用。促炎信號通路是由多種促炎細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-6）介導(dǎo)的，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和凋亡，進(jìn)一步加重炎癥和纖維化，最終導(dǎo)致心室重塑［6］。

氧化應(yīng)激損傷在心臟纖維化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病理情況下，活性氧過量積累導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生，促使細(xì)胞損傷和死亡，引起細(xì)胞功能障礙［7］?；钚匝醴肿咏?jīng)抗氧化酶如CAT和SOD降解為無毒分子?？寡趸烙鶛C(jī)制（SOD、CAT）或內(nèi)源性抗氧化劑（維生素E、抗壞血酸和谷胱甘肽）濃度降低可增加活性氧水平。有研究顯示，心力衰竭病人血漿和心包積液中脂質(zhì)過氧化物水平升高，與病人嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［7］?；钚匝跻l(fā)心臟成纖維細(xì)胞增殖，激活核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB），以此增加基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)聚集，促進(jìn)心肌纖維化［8］。相關(guān)研究表明，竹葉提取物通過緩解氧化應(yīng)激損傷，減輕糖尿病誘導(dǎo)的心臟纖維化［9］。

有研究顯示，順鉑誘導(dǎo)的小鼠腎損傷過程中，高良姜素通過抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡作用發(fā)揮腎臟保護(hù)作用［10］；在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，高良姜素通過改善肝臟的抗氧化應(yīng)激水平，維持高血糖大鼠肝臟的線粒體功能［11］；高良姜素通過抑制炎性因子表達(dá)，減輕尿酸誘導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)［12］。

本研究結(jié)果顯示，在ISO誘導(dǎo)的心臟損傷及纖維化模型中，高良姜素干預(yù)后降低了HW/BW、HW/TL，減輕了心肌間質(zhì)纖維化程度，縮小了心肌細(xì)胞的橫截面積，改善了心功能；高良姜素干預(yù)后下調(diào)了心臟炎癥標(biāo)志物（IL-6、IL-1β、TNF-α）和心臟纖維化標(biāo)志物（Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1）mRNA表達(dá)水平，同時(shí)升高了心臟組織中抗氧化酶SOD、CAT活性，降低了心臟組織中脂質(zhì)氧化物MDA的含量。

綜上所述，高良姜素通過減輕心臟炎癥反應(yīng)、心臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而減輕ISO誘導(dǎo)的心臟損傷及纖維化。但具體分子機(jī)制尚未明確，在今后的研究中將深入探討。

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（收稿日期：2023-03-17）

（本文編輯薛妮）