基于楠木轉錄組的SSR、SNP、Indel分子標記技術特征分析

摘要：楠木（Phoebezhennan）是重要的木材和園林綠化樹種，國家二級保護瀕危種，但氣候急劇變化和濫砍亂伐導致楠木資源破壞嚴重，因此，開展楠木遺傳多樣性評價對種質資源保護和遺傳育種具有重要意義。DNA分子標記技術是研究遺傳多樣性的重要手段，特別是SSR（SimpleSequenceRepeats，微衛(wèi)星DNA）、SNP（singlenucleotidepolymorphism，單核苷酸多態(tài)性）、InDel（insertion-deletion，插入缺失標記）分子標記技術已得到廣泛應用。本研究利用MISA（MIcroSAtelliteidentificationtool）軟件及GATK（GenomeAnalysisToolkit）軟件，對楠木轉錄組數(shù)據(jù)SSR、SNP、InDel位點信息進行分析。根據(jù)60250條unigenes查找，在12916條unigenes上共發(fā)現(xiàn)SSR位點18793個，占比21.44%。其中單堿基重復基元占比最大，二、三、四、五、六堿基重復次數(shù)逐漸遞減，單堿基重復基元A/T出現(xiàn)次數(shù)最多，共9060次占比48.21%，其他類型重復基元的出現(xiàn)次數(shù)同樣逐漸遞減。SNP和InDel位點查找，獲得SNP位點1566350個，平均約每28bp就有一個SNP位點的存在，其中轉變位點有990457個，顛換位點有575893個，占比較高的是T/A和C/G。InDel位點共發(fā)現(xiàn)178227個，平均每253bp就有一個InDel位點的存在。結合數(shù)據(jù)來看楠木轉錄組中有著豐富的SSR、SNP、InDel位點，具有較高的多態(tài)性，為楠木的分子標記開發(fā)及深入研究遺傳多樣性提供了基礎數(shù)據(jù)。

關鍵詞：楠木；轉錄組；SSR；SNP；InDel

中圖分類號：Q755

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）04－0083－05

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.04.014

楠木（PhoebezhennanS.Lee）為樟科（Lauraceae）楠屬（PhoebeNees）常綠大喬木，國家二級瀕危植物，其木質堅硬，經(jīng)久耐用，耐腐性能極好，帶有特殊的香味，能避免蟲蛀，是名貴的材用和園林綠化樹種［1］。目前楠木資源主要分布在湖北西部、貴州西北部及四川等地，呈現(xiàn)片段化分布［2］。由于氣候變遷、自然災害、楠木自身繁殖率較低及人們對楠木的亂砍濫伐，導致楠木資源日益枯竭［3］。因此，對楠木開展保護生物學研究非常重要，這不僅是分子水平的遺傳多樣性保護生物學中的一個中心問題，也是保護生物學的核心領域之一。形態(tài)特征結合分子水平綜合分析，可以更好地反映楠木資源遺傳多樣性水平的變化，探討楠木瀕危機制，提出相應的保護建議，為楠木資源保護提供有效的技術方法和策略。

分子標記是研究生物遺傳多樣性的重要手段，包括限制性片段長度多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）、擴增片段長度多態(tài)性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，AFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD）、ISSR（Inter-simplesequencerepeat）、簡單重復序列（SimpleSequenceRepeats，SSR）、單核苷酸變異（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）、Indel（Inter-SimpleSequenceRepeat）等。江香梅等［4］利用RAPD分子標記技術對8個天然閩楠群體進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)閩楠群體內的變異與群體間的變異相比較高。李娟等［5］通過ISSR技術對7個樹種的35份楠木品種進行檢測，共擴增出126條多態(tài)性條帶，并說明了四川峨眉山、重慶江津的兩個楨楠群體與福建南平、廣西富川、湖北來鳳的3個閩楠群體的遺傳距離較小。丁亞軍［6-7］利用EST-SSR技術對浙江楠群體進行分析發(fā)現(xiàn)地理位置為群體遺傳距離的主要因素。利用AFLP標記技術對楨楠的白化苗與正常苗進行研究，發(fā)現(xiàn)在楨楠的正常苗和白化苗之間有兩對引物（P6和P11）存在差異［8］。第一代分子標記技術與第二、三代分子標記技術相比，檢測時間長、實驗操作繁瑣、花費較高，目前第二代（SSR）與第三代（SNP）分子標記技術被廣泛應用于植物遺傳多樣性研究。

隨著測序技術的不斷完善和發(fā)展，使得越來越多物種的SSR及SNP位點得到標記和應用開發(fā)。劉丹等［9］基于IlluminaHiSeq測序結果利用MISA軟件在閩楠轉錄組中找到35972個SSR位點。何暢等［10］基于油楠的轉錄組數(shù)據(jù)搜索得到SSR位點97443個。時小東等［11］基于楠木轉錄組序列進行SSR分子標記開發(fā)并分析其多態(tài)性，初步驗證了楠木中SSR位點的可行性。本研究基于實驗室獲得的楠木轉錄組數(shù)據(jù)，利用MISA軟件及GATK軟件，對搜索出來的SSR、SNP、InDel位點信息進行特征分析，為進一步深入研究楠屬物種的遺傳多樣性、親緣關系與進一步開發(fā)楠木分子標記位點提供基礎數(shù)據(jù)。

1數(shù)據(jù)來源與分析方法

1.1數(shù)據(jù)來源

以本實驗室楠木轉錄組數(shù)據(jù)（NCBI登錄號：RJNA778346）為基礎數(shù)據(jù)［12］。

1.2分析方法

1.2.1SSR位點分析

參照徐志文［13］篩選轉錄組SSR位點的方法，使用MISA軟件對楠木轉錄組SSR位點進行篩選，其參數(shù)設置為單堿基核苷酸重復次數(shù)≥10，二堿基核苷酸重復次數(shù)≥6，三、四、五、六堿基核苷酸重復次數(shù)≥5。

1.2.2SNP和InDel位點分析

參照王藝儒等［14］的方法利用GATK軟件對轉錄組數(shù)據(jù)的SNP位點和InDel位點進行搜索，其篩選條件設置為：（1）映射質量過濾器等于PASS；（2）QD（QualityDepth）gt;2；（3）MQ（MappingQuality）gt;40；（4）QUALgt;30；此外，如果覆蓋范圍小于10，在5bp之內SNP有2個，InDel附近的SNP在5bp以內，則進一步篩選變異。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用Excel數(shù)據(jù)處理軟件對搜索到的SSR位點的長度、核苷酸類型、各類型的重復次數(shù)及各類型優(yōu)勢重復的基礎數(shù)據(jù)信息進行統(tǒng)計分析，并依據(jù)已有的信息設計SSR引物。同時對得到的SNP及InDel位點的信息做基本的統(tǒng)計及闡述。

2結果與分析

2.1楠木轉錄組SSR位點長度統(tǒng)計分析

使用MISA軟件在60250條unigenes中搜索，在12916條unigenes中發(fā)現(xiàn)SSR位點18793個，發(fā)生頻率為21.44%，其中包含一個以上SSR的序列有3959條，復合型的SSR位點有2659個。SSR長度之間也有差異，楠木轉錄組SSR序列長度分布在10～675bp之間，發(fā)現(xiàn)隨著序列長度的增加序列之中的SSR位點逐漸減小。其中10～20bp之間有較多的SSR位點，共計10354個，約占總數(shù)的64.18%，SSR隨著序列長度的增加而逐漸減少，分布在21～30bp、31～40bp、41～50bp、gt;50bp的分別有2575、879、459、1867個SSR位點，約占總數(shù)的15.96%、5.45%、2.85%、11.56%（圖1）。

2.2楠木轉錄組SSR位點核苷酸類型分析

對楠木轉錄組的SSR位點的不同核苷酸類型進行分析，發(fā)現(xiàn)楠木轉錄組數(shù)據(jù)中單核苷酸重復序列共出現(xiàn)9154次（48.71%），是在所有核苷酸重復序列中出現(xiàn)最多的。其次是二堿基核苷酸重復與三堿基核苷酸重復序列，分別出現(xiàn)5777次（30.74%）和3555次（18.92%）。五核苷酸重復及六核苷酸重復序列占總數(shù)的比例較低為0.27%（圖2）。

2.3楠木轉錄組SSR位點各類型重復次數(shù)分析

由圖3可知，SSR位點數(shù)量隨著重復次數(shù)的增加逐漸減少，其中單核苷酸比其他類型核苷酸的下降速度快，其余核苷酸SSR數(shù)量隨著重復次數(shù)的增加也呈現(xiàn)下降的趨勢，但其下降速度較為平緩。且單核苷酸的重復次數(shù)主要集中于10～11之間，二核苷酸的重復次數(shù)集中于6～8之間，三核苷酸的重復次數(shù)集中于5～6之間，四、五、六核苷酸的重復次數(shù)主要集中在5次。

2.4楠木轉錄組SSR位點各類型優(yōu)勢重復分析

對搜索得到的SSR位點進行分析發(fā)現(xiàn)，SSR位點的堿基重復基元同樣存在差異。SSR位點堿基重復基元有93種，其中單堿基核苷酸重復基元2種、二堿基核苷酸重復基元4種、三堿基核苷酸重復基元10種、四堿基核苷酸重復基元23種、五堿基核苷酸重復基元21種和六堿基核苷酸重復基元33種。單堿基重復基元為優(yōu)勢重復類型共有9154個（48.71%），出現(xiàn)頻率最多的重復類型是A/T（98.97%）。二堿基重復類型共有5777個，出現(xiàn)頻率為30.74%，優(yōu)勢重復類型為AG/CT（77.39%）。三堿基重復類型共有3555個，出現(xiàn)頻率為18.92%，優(yōu)勢重復類型為AAG/CTT（43.66%）。四堿基重復類型共有205個，出現(xiàn)頻率為1.09%，優(yōu)勢重復類型為AAAG/CTTT（29.27%）。五堿基重復類型共有51個，出現(xiàn)頻率為0.27%，優(yōu)勢重復類型為AAGAG/CTCTT（23.52%）。六堿基重復類型有51，出現(xiàn)頻率為0.27%，優(yōu)勢重復類型為AAGGAG/CTTCT（11.76%）和AGAGGG/CCCTCT（11.76%）（表1）。

2.5楠木轉錄組SSR引物設計

由于SSR在基因組中的位置不同，但其兩端的序列大多是保守的單拷貝序列，所以SSR引物的設計可以根據(jù)SSR兩端的互補序列進行［15］。使用軟件Primer3進行SSR引物設計［16］。去除有多處比對的引物，共得到引物9742條。依照單堿基重復的SSR位點設計得到的引物有4181條占所有引物的42.92%，其次是二堿基重復（2328條，23.90%）與三堿基重復（1998條，20.51%）。所得到的引物Tm值及GC含量均符合試驗要求［17］，為后續(xù)的試驗提供便利。部分引物結果如表2所示。為驗證引物的通用性，使用楠木cDNA擴增，部分結果如圖4所示。

2.6楠木轉錄組SNP和InDel位點特征分析

利用GATK軟件對楠木轉錄組數(shù)據(jù)庫SNP位點搜索分析發(fā)現(xiàn)，60250個unigene中存在有1566350個SNP位點，平均每28bp就有SNP位點的出現(xiàn)。在已得到的SNP位點中存在轉換（transitions）位點有990457個，顛換（transversions）位點有575893個。其中6種單核苷酸發(fā)生變化的主要以C∶Ggt;T∶A為主，共有504697個，發(fā)生頻率為32.22%。其次為T∶Agt;C∶G共有485760個，發(fā)生頻率為31.01%（表3）。由表4可以看出SNP位點主要以轉換為主。

使用GATK軟件對InDel位點進行搜索，在楠木轉錄組數(shù)據(jù)中共篩選到178227個InDel位點，平均每249bp有一個InDel位點存在，同時與SNP位點相比InDel位點變異較少。將外顯子區(qū)和所有范圍的InDel長度進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（圖5），外顯子和所有范圍內的InDel位點長度在-1與1的范圍內的數(shù)量是最多的。

3結論與討論

近年來，由于分子標記技術不斷發(fā)展，基于轉錄組測序技術分析篩選SSR、SNP、InDel等分子標記位點在杜仲［18］、擬南芥［19］、茶［20］等植物中被廣泛應用，主要應用于物種的親緣關系鑒定、種群關系分析等方面。

楠木的轉錄組具有豐富的SSR位點，對于楠屬親緣關系的鑒定及物種的遺傳多樣性研究具有重要的作用。本研究基于楠木轉錄組數(shù)據(jù)，在60250條unigene上共篩選出18793個SSR位點，發(fā)生頻率為21.44%，平均每2.4kb出現(xiàn)一個SSR位點，與時小東［11］對于轉錄組序列的楠木SSR分子標記開發(fā)的結果較一致。SSR位點以單堿基核苷酸、二堿基核苷酸和三堿基核苷酸為優(yōu)勢重復類型，其SSR位點數(shù)量為9154（48.71%）、5777（30.74%）、3555（18.92%），其優(yōu)勢重復基元分別為A/T、AG/CT和AAG/CTT。同時還發(fā)現(xiàn)了在其他高等植物中較少出現(xiàn)的CG/CG（875次重復）重復基元。

研究發(fā)現(xiàn)，SSR中重復單元的數(shù)量存在較大的變異，表現(xiàn)為SSR數(shù)量的整數(shù)變異，或者重復單元序列中的序列可能不完全相同，從而導致多個位點的多態(tài)性［21］。如能揭示這些變異，我們可以發(fā)現(xiàn)不同個體間SSR的多態(tài)性，從而進一步了解種間進化的過程［22］。多態(tài)性是SSR的一個重要衡量標準［23］。SSR重復基元的重復次數(shù)與序列長度是影響SSR位點多態(tài)性的重要因素［24］。本研究中楠木的SSR位點長度主要分布在10～20bp，共有10354個（64.18%），其中單堿基和二堿基核苷酸重復次數(shù)占比較多?！?0bp的SSR位點有5780個，占比35.82%，此類SSR位點存在較多的多態(tài)性，對于后續(xù)楠木相關研究具有較大的作用。

本研究利用GATK軟件共搜索到SNP位點1566350個，平均而言，每28bp就有一個SNP位點，其中轉換位點990457個，顛換位點有575893，二者的比值為1.7，與理論值0.5相比稍大，此類現(xiàn)象被稱為轉換偏差，這與堿基組成和進化過程中的選擇機制有關，說明堿基的轉換突變可能不是隨機產(chǎn)生的［25］。同時還檢測到InDel位點78227個，平均每249bp就存在一個InDel位點，與SNP位點相比InDel位點變異相對較少。

綜上所述，實驗室構建的楠木轉錄組中含有較多SSR、SNP、InDel位點，具有較高的多態(tài)性，為后續(xù)對貴州楠木資源遺傳多樣性、遺傳育種、種間親緣關系的鑒定等方面的研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

（責任編輯：段麗麗）

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