從江稻田鯉胚胎發(fā)育研究

摘要：為探明從江稻田鯉（CyprinuscarpioLinnaeus）的早期發(fā)育階段特征和規(guī)律，本試驗通過設置4個不同的孵化溫度20℃、22℃、24℃、26℃，連續(xù)顯微觀察記錄分析其胚胎發(fā)育各時期的形態(tài)特征和發(fā)育特點。結果顯示：從江稻田鯉受精卵為淡黃色、卵圓形、強黏性，卵徑為1.32±0.10mm，吸水后卵徑為1.60±0.02mm。在水溫20.0±0.5℃，胚胎發(fā)育歷時75.98h，總積溫為1527.20h·℃，共記錄受精卵、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成以及出膜6個階段，共27個時期。建議從江稻田鯉的胚胎發(fā)育溫度不超過26℃，最適發(fā)育溫度應控制在22～24℃。本研究報道了從江稻田鯉在人工養(yǎng)殖條件下的胚胎發(fā)育特征，為進一步實現(xiàn)苗種規(guī)?；庇峁┗A資料和重要參考。

關鍵詞：從江稻田鯉；人工催產(chǎn)；胚胎發(fā)育；溫度控制

中圖分類號：Q132.4；S961.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）04－0063－06

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.04.010

鯉（Cyprinuscarpio）隸屬于鯉形目（Cyprinidformes）、鯉科（Cyprinidae）、鯉亞科（Cyprininae）、鯉屬（Cyprinus）、鯉亞屬［1］，是一種廣泛分布于歐亞大陸，有著幾千年的文化史和馴養(yǎng)史的淡水魚類［2］，由于地理隔離、適應性突變積累、自然和人為選擇等綜合作用，鯉發(fā)展出許多種群和品系［3］，我國南方湘黔桂接壤的苗、侗族先民稻田養(yǎng)鯉歷史悠久［4］，因長期稻田養(yǎng)殖馴化，形成了眾多適應于稻田淺水環(huán)境的鯉魚地方品系［5-8］，其中“從江稻田鯉”（C.carpio）就是其典型代表，它們具有性情溫順、抗病力強、活動力弱和不善跳躍等特點，在稻田淺水環(huán)境不易逃遁，統(tǒng)稱“呆鯉”或“田魚”，又因以稻田禾花為食而稱“禾花魚”［9-10］。

2011年，從江侗鄉(xiāng)稻魚鴨系統(tǒng)獲全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn)（GloballyImportantAgriculturalHeritageSysterms，GIAHS）授牌［11］，從江稻田鯉榮獲“全國農(nóng)產(chǎn)品地理標志”，這些極大地促進了稻田鯉的養(yǎng)殖發(fā)展。從江苗、侗族鄉(xiāng)民稻田鯉繁殖極為傳統(tǒng)［10-12］，每年清明時節(jié)雌雄鯉魚按1∶3～5的比例在稻田或河邊小水池自行配對產(chǎn)卵，選用質(zhì)地柔軟、纖細、須多，在水中易散開、不易腐爛的石松作附卵材料，稻田中淋水孵化［13-14］，因氣溫和水溫不穩(wěn)定其孵化效果不理想［14］。為此，本研究利用人工催產(chǎn)繁殖獲得受精卵，控制孵化水體條件，對從江稻田鯉胚胎發(fā)育進行連續(xù)觀察，了解其胚胎發(fā)育的規(guī)律，探討水溫對其發(fā)育的影響，為孵化管理措施的改進提供參考。

1材料與方法

1.1親魚來源

2021年4月2日，從貴州省黔東南苗族侗族自治州從江縣剛邊鄉(xiāng)平正村稻田苗種生產(chǎn)合作社（N25°38′7″，E108°40′37″），采集活力健壯的從江稻田鯉親魚2齡及以上雌親魚共27尾，體質(zhì)量864.7±112.9g，1齡雄親魚共53尾，體質(zhì)量321.2±23.0g，運輸至貴州大學動物科學學院水產(chǎn)系實驗室暫養(yǎng)待用。

1.2親魚催產(chǎn)、人工授精及孵化

親魚暫養(yǎng)于室內(nèi)養(yǎng)殖桶（內(nèi)直徑91cm，高100cm，容積約650L）中，每個桶放養(yǎng)親魚5000g，用充氧機充氣保持水體5mg/L以上溶解氧水平，每天按養(yǎng)殖桶水體積的1/3換水1次，按魚體重5%的比例投喂粗蛋白為32%的鯉魚商品飼料，每天早中晚各1次。經(jīng)過一個多月強化培育后，選擇性腺發(fā)育良好的親魚用于人工催產(chǎn)試驗，按每千克體質(zhì)量配制催產(chǎn)藥物，雌魚藥物按每千克體質(zhì)量注射促黃體生成素釋放激素類似物（LRH—A2）5μg+絨毛膜促性腺激素（HCG）500I.U+馬來酸地歐酮（DOM）2mg的配比，雄魚劑量減半，按體重每尾魚注射1～2mL［16］。采用胸鰭基部一次性注射法，注射完成后雌雄魚分別放入不同的催產(chǎn)池，池水提前升溫至23℃并保持連續(xù)充氧，用沖水刺激雌魚排卵，同時在催產(chǎn)池中懸掛聚乙烯網(wǎng)片持續(xù)觀察雌魚產(chǎn)卵情況，并記錄各個時段雌魚的發(fā)情數(shù)量。翌日早上八點，觀察到雌魚有發(fā)情現(xiàn)象，隨即進行人工干法授精。

附卵的網(wǎng)片清洗干凈后放入80目聚乙烯篩絹網(wǎng)箱中孵化。網(wǎng)箱規(guī)格60cm×40cm×110cm，使用前消毒清洗干凈懸掛固定在圓形養(yǎng)殖桶中，養(yǎng)殖桶內(nèi)徑91cm，高100cm，裝水容積約650L。孵化用水為自來水，使用前經(jīng)兩天以上曝氣。利用ProODO溶氧儀（精度為0.01mg/L）（美國，YSI）記錄孵化水體溶解氧（每天4次），使水體溶解氧保持在7mg/L及以上。孵化水溫設置20℃（自然水溫）、22℃、24℃和26℃4個梯度，使用恒溫加熱棒進行控溫，每個溫度設置3個平行，試驗重復2次，胚胎發(fā)育期間統(tǒng)計各個孵化溫度的受精率、孵化率和原腸期發(fā)育時間。每個孵化網(wǎng)箱中放置附卵的魚巢2片，每天早晚2次更換孵化用水，每次換水約1/3，及時清除壞卵死卵。

1.3胚胎發(fā)育觀察

為便于觀察，用Solarbio胰蛋白酶水解液對部分受精卵進行去膜處理［15］。每次隨機取樣15粒卵以上，受精卵至囊胚期前每10min取樣觀察1次，囊胚期后至原腸晚期之前每15min觀察1次，原腸晚期后每60min取樣觀察1次。使用NexcopeNSZ818體式解剖鏡和OlympusCX21光學顯微鏡對胚胎發(fā)育過程進行連續(xù)活體觀察，并利用NexcameraT20顯微鏡成像系統(tǒng)和imageview3.7.1顯微鏡圖像程序?qū)Ω靼l(fā)育時期胚胎進行成像和采集。以50％胚胎進入某個發(fā)育階段為該發(fā)育階段的起始時間，自前一個發(fā)育階段至下一個發(fā)育階段的時間間隔為該階段的持續(xù)發(fā)育時長［16］。

1.4數(shù)據(jù)采集及處理

試驗期間記錄催產(chǎn)率、受精率（以到原腸胚期后開始統(tǒng)計受精率［17］）和孵化率，計算公式如下［18］：

催產(chǎn)率=（繁殖親本數(shù)/總催產(chǎn)親本數(shù)）×100%；

受精率=（受精卵數(shù)/投入總卵數(shù)）×100%；

孵化率=（孵化仔魚數(shù)/總受精卵數(shù)）×100%。

胚胎發(fā)育各階段積溫的計算方法［19］為：

胚胎發(fā)育各階段的積溫（h·℃）=胚胎發(fā)育到該階段時間（h）×水溫（℃）。

受精卵卵徑等相關指標使用數(shù)顯游標卡尺（精度0.01mm）和顯微鏡目鏡測微尺（精度每格25μm）測量，親魚、受精卵質(zhì)量等數(shù)據(jù)采用FA1004型電子天平（精度0.0001g）稱取。所測數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel2016進行整理和統(tǒng)計分析，結果以“平均值±標準差”（X-±SD）表示。試驗觀察拍攝獲得的照片通過AdobePhotoshopCS6軟件處理后，作為從江稻田鯉胚胎各發(fā)育階段的典型特征模板照片。

2結果與分析

2.1從江稻田鯉胚胎發(fā)育分期及特性

從江稻田鯉為盤狀卵裂，其受精卵為端黃卵，成熟卵子呈卵圓形，卵徑為1.32±0.10mm，淡黃色，具有較強黏性，吸水膨脹后卵徑為1.60±0.02mm。從江稻田鯉胚胎發(fā)育與其他鯉科魚類相似，歷經(jīng)受精、卵裂、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、器官形成及孵化出膜6個階段，每個發(fā)育階段又經(jīng)歷若干個發(fā)育時期。在水溫20.24±0.03℃、溶解氧＞7mg/L的條件下，整個胚胎發(fā)育過程歷經(jīng)75.98h，胚胎發(fā)育總積溫為1527.20h·℃。

1）受精卵階段。受精后0.37h，胚盤隆起，水溫20.4℃，本階段持續(xù)1.67h，積溫7.55h·℃，如圖1-1、1-2。

2）卵裂階段。受精后2.04h、2.24h、2.39h、2.52h、2.64h、2.77h和2.90h，分別進入2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、32細胞期、64細胞期以及多細胞期，水溫分別為20.20℃、20.30℃、20.30℃、20.30℃、20.30℃、20.30℃、20.30℃，本階段2.04～3.37h，歷時1.33h，積溫58.87h·℃，見圖1-3至圖1-9。

3）囊胚階段。受精后3.37h、4.62h和5.42h，分別進入囊胚早期、囊胚中期以及囊胚晚期，水溫分別為20.30℃、20.30℃、20.30℃，本階段3.37～6.15h，歷時2.78h，積溫110.03h·℃，見圖1-10至圖1-12。

4）原腸胚階段。受精后6.15h、7.95h和12.27h，分別進入原腸早期、原腸中期以及原腸晚期，水溫分別為20.00℃、20.30℃和20.00℃，本階段6.15～13.09h，歷時6.94h，積溫245.40h·℃，見圖1-13至圖1-15。

5）神經(jīng)胚階段。受精后13.09h、15.81h，分別進入神經(jīng)胚期以及胚孔封閉期，水溫分別為20.50℃、20.40℃，本階段13.09～19.34h，歷時6.25h，積溫322.52h·℃，見圖1-16至圖1-17。

6）器官形成階段。受精后19.34h，肌節(jié)出現(xiàn)，20.62h、23.25h、25.08h，眼囊、尾芽以及尾鰭分別出現(xiàn)，28.10h，發(fā)育到晶體出現(xiàn)期，29.42h，進入肌肉效應期，33.48h，心臟原基形成，40.01h，進入心臟搏動期，水溫分別為20.30℃、20.40℃、20.20℃、20.20℃、20.20℃、20.20℃、20.10℃、20.00℃，本階段19.34～57.23h，歷時37.89h，積溫800.20h·℃，見圖1-18至圖1-25。

7）出膜階段。受精后57.23h、75.98h，分別進入出膜前期及出膜期，水溫分別為20.10℃、20.10℃，本階段57.23～75.98h，歷時18.72h，積溫1527.20h·℃，見圖1-26至圖1-27。

注：1.受精卵；2.胚盤隆起；3.2細胞期；4.4細胞期；5.8細胞期；6.16細胞期；7.32細胞期；8.64細胞期；9.多細胞期；10.囊胚早期；11.囊胚中期；12.囊胚晚期；13.原腸早期；14.原腸中期；15.原腸晚期；16.神經(jīng)胚期；17.胚孔封閉期；18.肌節(jié)出現(xiàn)期；19.眼囊形成期；20.尾芽形成期；21.尾鰭形成期；22.眼晶體形成期；23.肌肉效應期；24.心臟原基形成期；25.心臟跳動期；26.出膜前期；27.出膜期。

2.2不同水溫下胚胎發(fā)育的比較

由表2可見，隨著水溫的升高，從江稻田鯉的胚胎達到原腸期時間和孵化時間均明顯縮短，原腸期時間由20℃的13.09h降低到26℃的8.09h，孵化時間則由20℃的75.98h縮短至26℃的44.00h，同時，受精率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而孵化率則表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。

3結論與討論

本研究在人工繁育條件下觀察并記錄了從江稻田鯉胚胎發(fā)育的27個時期的形態(tài)特征變化，發(fā)現(xiàn)從江稻田鯉與大多數(shù)硬骨魚類的卵裂方式相同，均屬盤狀分裂［20］；但由于物種生存環(huán)境的特異性，從江稻田鯉的胚胎發(fā)育具有自身特點。分別將從江稻田鯉與俄羅斯鯉（Cyprinuscarpio）［21］、甌江彩鯉（Cyprinuscarpiovar.color）［22］、黃河鯉（Cyprinuscarpio）［23］、紅白錦鯉（Kohakoukoi）［24］以及鯉（CyprinuscarpioLinne）［25］等5種魚類的早期發(fā)育特點進行比較（表3），其中從江稻田鯉的受精卵為淡黃色、強黏性、沉性卵，在自然條件下，其受精卵常常黏附在稻田中的水草、枯枝上進行孵化，這說明從江稻田鯉與其產(chǎn)卵環(huán)境的適應性較好［26］。有研究指出，魚卵的卵徑越大，胚胎發(fā)育速度越慢［27］，從江稻田鯉與其他幾種鯉種魚類受精卵卵徑不同，俄羅斯鯉和鯉的卵徑較從江稻田鯉?。ū?），同時胚胎發(fā)育歷時也較從江稻田鯉短，但從江稻田鯉的卵徑小于紅白錦鯉，其孵化出膜的時間卻遠大于紅白錦鯉。這表明在胚胎發(fā)育溫度相近的情況下，魚卵的孵化出膜時間并非與卵徑直接相關，可能受種類、水質(zhì)以及環(huán)境等因素的影響，有待后續(xù)研究。與上述5種鯉不同，從江稻田鯉出膜時所處的發(fā)育階段為胸鰭原基出現(xiàn)期，初孵仔魚的發(fā)育更為完善。這可能是由于從江稻田鯉主要生活在山區(qū)的稻田淺水水體，繁殖時間在四月中下旬，此時水溫逐漸升高，水體餌料生物較為豐富，出膜仔魚完善的發(fā)育器官更有利于早日開口攝食，躲避天然敵害［28］，同時能有效提高仔魚時期的存活率。

魚類卵子的受精率與孵化率不僅與精、卵子的質(zhì)量有關，還與受精卵的孵化溫度有關，而在最適溫度范圍內(nèi)，不僅可獲得最高的受精率和孵化率，還能獲得最低的出膜仔魚畸形率，從而獲得最佳繁殖效果［29］。在一定溫度范圍內(nèi)，水溫升高可以加快胚胎的發(fā)育速度，相反，水溫降低會減緩胚胎發(fā)育速度，超過溫度范圍可能引起胚胎發(fā)育停滯、畸形或死亡［30-31］。本研究中將從江稻田鯉受精卵分別設置在水溫20℃（自然水溫）、22℃、24℃、26℃，溶解氧為7mg/L的條件下進行孵化，隨著溫度的升高，發(fā)現(xiàn)其孵化時長分別為75.98h、58.91h、55.58h、44.00h，各組的孵化時間都有了不同程度的縮短，孵化率也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在26℃時試驗組達到最低值，這與陳媛媛等［32］、常劍波等［33］的研究結果相似。同時，通過觀察各組仔魚游泳情況我們還發(fā)現(xiàn)，26℃試驗組仔魚在水中用玻璃棒刺激，反應遲鈍或多次驅(qū)趕后方才游動，而其他溫度處理組的仔魚用同樣方法檢驗，均反應迅速、游向四周；相較于其他試驗組仔魚，26℃試驗組仔魚整體活力較差，這可能是由于孵化時間的大幅縮短而導致胚胎發(fā)育不完善，且仔魚游泳能力等明顯不足［34-36］。

綜上所述，建議從江稻田鯉人工繁殖生產(chǎn)的最適水溫應控制在22～24℃，縮短孵化時間，降低孵化風險和管理成本，以促成科學標準的生產(chǎn)管理措施。

（責任編輯：胡吉鳳）

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