茶葉斑病病原菌的鑒定及生長特性研究

摘要：本研究從貴州余慶茶葉產(chǎn)區(qū)的茶樹葉部病害樣品中分離純化出多個相似的分離物，觀察其菌落、分生孢子器和分生孢子等形態(tài)。測定了LSU、ITS和TUB等核酸序列，采用PAUP軟件及最大簡約法，進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析。依據(jù)柯赫氏法則，完成代表性菌株CGMCC3.20149在室內(nèi)和自然條件下的茶樹葉片致病性研究。同時，還探究了菌株CGMCC3.20149在不同培養(yǎng)基上的生長速率。結(jié)果表明，CGMCC3.20149菌株的菌落、分生孢子器和分生孢子等形態(tài)與荸薺點(diǎn)霉稈枯病菌Didymellabellidis一致；CGMCC3.20149菌株與模式菌株D.bellidisPD94/886和D.bellidisCBS714.85在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支，自舉支持率為100%；通過損傷方式接種，CGMCC3.20149菌株可引起茶樹葉片產(chǎn)生病斑；在OA培養(yǎng)基上的生長速率最快，達(dá)（0.76±0.01）cm/d，PDA培養(yǎng)基上的生長速率次之，為（0.73±0.02）cm/d，MEA培養(yǎng)基上的生長速率則最慢，為（0.62±0.01）cm/d；不同的碳素營養(yǎng)和氮素營養(yǎng)均影響菌絲的生長速率、菌素豐度、色素形成；25℃是菌株體外最適宜的生長溫度；菌株在pH6～9的范圍內(nèi)生長較好。

關(guān)鍵詞：茶葉斑病；荸薺莖點(diǎn)霉稈枯病菌；鑒定；生物學(xué)研究；致病性

中圖分類號：S432

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）04－0010－08

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.04.002

貴州在茶樹種植上具備低緯度、高海拔、寡日照、多云霧、無污染的生態(tài)優(yōu)勢。近年來，貴州大力發(fā)展茶產(chǎn)業(yè)，種茶面積位居全國第一［1］。由于茶樹為多年生作物，其種植生態(tài)氣候條件多樣，病害的發(fā)生流行途徑復(fù)雜，茶樹病害是影響茶葉生產(chǎn)的重要影響因素。據(jù)報道，全球茶樹病害多達(dá)500余種，我國記載有138種，其中真菌病害高達(dá)72種［1-4］。隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整、全球氣候的變化以及對茶樹病原鑒定技術(shù)的進(jìn)步，不斷有新的病原和病害報道。例如，新發(fā)現(xiàn)茶云紋葉枯病的病原膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichumacutatum）、茶輪斑病的病原茶假擬盤多毛孢（Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis）、新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsisclavispora）、廬山擬盤多毛孢（Pestalotiopsislushanensis）和Pestalotiopsiscamelliae，茶葉斑病的病原莖點(diǎn)霉屬（Didymellasegeticolavar.camelliae）、荸薺莖點(diǎn)霉稈枯病菌（Didymellabellidis）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodiatheobromae）、高粱附球菌（Epicoccumsorghinum）、茶褐枯病的病原菌（Colletotrichumcamelliae）［5-15］。本團(tuán)隊在貴州省余慶縣松煙鎮(zhèn)茶區(qū)進(jìn)行全年不間斷的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)茶葉斑病的發(fā)生率較高。其中，嫩葉和嫩稍處的病害發(fā)病率最高，病斑癥狀為褐色的針尖形，而后逐漸擴(kuò)大為1mm左右；隨著病斑擴(kuò)大，病斑周圍有時還伴隨出現(xiàn)黃色暈圈，直至病斑面積長至約1.5mm則不再擴(kuò)大。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，茶葉斑病的發(fā)病率較高，達(dá)74%～82%，并且嚴(yán)重度為42%～48%。因此，為了探明其病原菌，進(jìn)而提出有效的防控措施預(yù)防該區(qū)域茶葉斑病的病害發(fā)生，本文對貴州省余慶縣松煙鎮(zhèn)二龍茶區(qū)的茶葉斑病進(jìn)行了病原菌鑒定和生物學(xué)特性的初步研究。

1材料與方法

1.1樣品采集

2018年3月至11月，在貴州省余慶縣松煙鎮(zhèn)二龍村（E107°36′，N27°38′，海拔860m）12個茶園采集發(fā)生典型葉斑病病害癥狀的茶樹葉片，并記錄茶樹葉斑病病害發(fā)生特征。采集的試驗(yàn)樣品主要為樹齡5年至7年的福鼎大白茶（Camelliasinensiscv.Fuding-dabaicha）。

1.2菌株的分離和純化

將采集到的自然發(fā)病茶樹病葉帶回實(shí)驗(yàn)室，采用組織法分離茶樹病害葉片樣本病原菌［10，13］。將從同一茶樹葉片分離得到的30余個純化的菌株接種至裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextroseagar，PDA）的保種管，待菌株生長良好，添加滅菌的石蠟覆蓋菌株，保存于病害樣本儲存室的4℃冰箱中。同時，代表性菌株GZYQYQX1A已送至中國普通微生物菌種保藏管理中心進(jìn)行保存，菌株保藏號為CGMCC3.20149。

1.3形態(tài)學(xué)觀察

選取菌株CGMCC3.20149接種到PDA上培養(yǎng)活化，并將菌餅接種至PDA、麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基（MaltExtractAgar，MEA）和燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OatmealAgar，OA）。在溫度25℃，光照為黑暗條件下培養(yǎng)7d。每天觀察并記錄菌株P(guān)DA、MEA和OA培養(yǎng)基上的菌落生長情況、形態(tài)特征、菌絲豐富度及色素分泌特征，并計算菌落生長速率。同時，將滅菌的松針置于PDA培養(yǎng)基誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)孢，觀察菌株的產(chǎn)孢特征。待產(chǎn)孢后，采用奧林巴斯顯微鏡（Olympus，BX43和FVMPE-RS）觀察并記錄菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)特征［11，16-17］。

1.4致病性試驗(yàn)

根據(jù)趙曉珍等［10］和任亞峰等［13］的試驗(yàn)方法，將分離獲得的菌株接種至茶樹葉片進(jìn)行致病性測定。致病性試驗(yàn)包括室內(nèi)致病性試驗(yàn)和田間致病性試驗(yàn)，試驗(yàn)品種為‘福鼎大白茶’，‘福鼎大白茶’種植于本實(shí)驗(yàn)室大棚溫室，茶樹樹齡約5年，接種葉為第2葉和第3葉。田間致病性試驗(yàn)在貴州省惠水縣七里沖茶場（106°61′E，26°08′N，海拔966m）完成，茶樹樹齡約30年，選取至少30d內(nèi)未施用農(nóng)藥的茶園區(qū)域進(jìn)行試驗(yàn)。接種病原為菌碟和分生孢子液。菌碟使用直徑6mm的打孔器打取，從分生孢子器中獲取分生孢子液，濃度調(diào)整為106個/mL，接種量為20～30μL。接種葉片為第3葉或第4葉，每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)在15棵茶樹上完成。

1.5病原菌的分子生物學(xué)鑒定

DNA提取根據(jù)Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒及使用說明進(jìn)行。使用LR0R/LR7、V9G/ITS4、TUB2Fd/TUB4Rd引物，分別擴(kuò)增內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Theinternaltranscribedspacer，ITS）、28S大亞單位rDNA（thepartial28SlargesubunitrDNA，LSU）、β-微管蛋白基因（beta-tubulin，TUB）的基因或核酸片段［18-21］。選用HS-Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

采用EZNA凝膠提取試劑盒（OMEGABio-tek，Madison，WI，USA）將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。PCR純化產(chǎn)物采用T4-DNA連接酶試劑（pGEM-TEasy載體系統(tǒng)，美國Promega）連接至pGEM-T載體，并轉(zhuǎn)到Trans1-T1PhageResistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）中，然后挑取單克隆菌落。采用M13F/M13R引物挑選陽性克隆，并采用質(zhì)粒測序。代表性菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列提交至Genbank。通過BLAST比對，選擇參比序列。采用PAUPv4.0b10（Swofford2003）及最大簡約法（MaximumParsimony，MP）進(jìn)行聚類分析及進(jìn)化樹構(gòu)建，系統(tǒng)發(fā)育樹參數(shù)為：Consistencyindex（CI）=0.7715，Homoplasyindex（HI）=0.2285，Retentionindex（RI）=0.6141，Rescaledconsistencyindex（RC）=0.4738，樹長為407。LSU、ITS和TUB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析方法選擇Bootstrap，對LSU（1-860）、ITS（861-1358）和TUB（1359-1695）進(jìn)行串聯(lián)加合，總長為1695，162個變異位點(diǎn)（variablecharacters，VC）是簡約信息位點(diǎn)（parsimony-uninformative），信息位點(diǎn)數(shù)（parsimony-informativecharacters）為102個，重復(fù)次數(shù)為1000，最大的樹數(shù)目（Maxtree）設(shè)置為10000。

1.6菌株生長特性的測定

1.6.1不同培養(yǎng)基的影響

采用包興濤等［22］和王雪等［23］的試驗(yàn)方法，研究菌株CGMCC3.20149在PDA、OA和MEA培養(yǎng)基上的生長速率、菌落形態(tài)和菌絲色素，以及在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PotatoDextroseBroth，PDB）中的生長情況。菌株生長于25℃和黑暗條件。接種菌碟至100mLPDB中，置于25℃、180r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)。每12h采用中速濾紙對1組樣品進(jìn)行菌絲過濾，然后置于60℃烘箱中烘干至恒重并稱重［16］。每個處理重復(fù)5次，并獨(dú)立重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.6.2不同pH的影響

采用包興濤等［22］和王雪等［23］的試驗(yàn)方法，pH從5增加至11，配制7個不同pH值的PDA培養(yǎng)基。研究培養(yǎng)基的pH值對菌株生長的影響。每個處理設(shè)5個重復(fù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3不同溫度的影響

將菌株CGMCC3.20149接種至PDA培養(yǎng)基上并在不同溫度下培養(yǎng)，溫度條件在19～34℃內(nèi)共設(shè)置6種處理，待其中生長速率最快的處理接近長滿平板后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落的生長速率［22］。每種處理設(shè)5次重復(fù)，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6.4不同氮源或碳源的影響

以察氏培養(yǎng)基（Czapek-DoxMedium）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用葡萄糖、D-果糖、淀粉、山梨糖、乳糖、甘油等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖，作為不同碳源培養(yǎng)基；分別用甘氨酸、組氨酸、硫氨酸、尿素、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋白胨、甲硫氨酸等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鉀，作為不同氮源培養(yǎng)基；將活化的菌株CGMCC3.20149接種至不同處理的培養(yǎng)基，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄菌落生長情況、形態(tài)特征及培養(yǎng)基變化情況，并記錄菌落直徑［16］。每個處理重復(fù)5次，并獨(dú)立重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用方差分析（ANOVA），以最小顯著法（Least-significantdifference，LSD）分析不同處理組間的差異顯著性。以不同小寫字母標(biāo)識差異是否顯著。

2結(jié)果與分析

2.1茶葉斑病的田間癥狀

茶葉斑病一般發(fā)于葉片邊緣。茶葉葉片發(fā)生病害初期的顏色為淡褐色，然后逐漸擴(kuò)大為1～2mm的圓形病斑。病斑周圍為淡黃色的暈圈，中部則為淺黃色。

病斑好發(fā)于嫩芽、嫩梢。隨著葉齡的增長，面積也逐漸擴(kuò)大，直徑增至2mm左右，面積不再發(fā)生變化。同時相鄰的病斑經(jīng)過發(fā)展可能融合為較大的病斑，這種現(xiàn)象尤其在嫩梢上較為突顯，因此導(dǎo)致發(fā)生病害的茶樹樹勢衰弱，降低新的芽葉抽發(fā)，嚴(yán)重?fù)p害茶葉產(chǎn)量（圖1）。

2.2菌株分離純化

采用組織分離法，從采集的樣本中分離出18個菌株。其中包括：Pseudopestalotiopsistheae、鏈格孢屬病原（Alternariaspp.）、亞隔孢殼屬（Didymellasp.）、莖點(diǎn)霉屬（Phomasp.）等菌株，并且Pseudopestalotiopsistheae菌株的分離率達(dá)79.4%。

2.3茶樹葉斑病病原菌鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)特征

在25℃的黑暗條件下，接種菌株至3種培養(yǎng)基上22d，可見有分生孢子器產(chǎn)生。分生孢子器呈球形或不規(guī)則形，黑色，分散和成簇半浸沒在培養(yǎng)基上（圖2-a、b）。分生孢子器大小約50～290μm，由2至3層細(xì)胞構(gòu)成，含有1～2個孔口，乳突不明顯（圖2-a、b）。分生孢子為單細(xì)胞，淡藍(lán)色，橢圓形或卵圓形，兩端較圓，大?。?.12±1.11）μm×（2.93±0.56）μm（n=50），含有0～2個油球（圖2-c）。

2.3.2病原菌的致病性

室內(nèi)致病性試驗(yàn)表明，茶樹葉片接種菌碟2d后便形成明顯的4～6mm病斑（圖3-a）；接種5d后，病斑面積持續(xù)擴(kuò)大（圖3-b）。分生孢子懸浮液接種茶樹葉片5d后，接種位置形成較小的病斑，病斑直徑約3～5mm（圖3-c）。比較兩種接種方式，發(fā)現(xiàn)接種菌碟產(chǎn)生的癥狀重于接種分生孢子所產(chǎn)生的癥狀。田間致病性試驗(yàn)表明，在接種菌碟2d后，茶樹葉片產(chǎn)生較大的病斑（圖3-d）。接種分生孢子懸浮液5d后，其病斑的大小顯著小于菌碟接種處理的病斑，接種點(diǎn)葉片顏色褪綠，呈淡黃色（圖3-e）。對照處理沒有產(chǎn)生病斑（圖3-f）。綜合比較室內(nèi)致病和田間致病的癥狀，發(fā)現(xiàn)接種葉片的葉齡越低，產(chǎn)生癥狀的時間越早，葉片的癥狀也越重。

2.3.3病原菌的分子生物學(xué)鑒定

向Genbank提交菌株的基因或核酸的序列，序列登錄號分別為GZYQYQX1A：MN274966/LSU、MN274963/ITS、MN274969/TUB，GZYQYQX2B：MN274967/LSU、MN274964/ITS、MN274970/TUB，GZYQYQX3C：MN274968/LSU、MN274965/ITS、MN274971/TUB。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，CGMCC3.20149菌株為荸薺莖點(diǎn)霉稈枯病菌D.bellidisPD94/886和D.bellidisCBS714.85，自舉支持率為100%（圖4）。外群為PleosporabetaeCBS523.66。

2.4病原菌生長特性

2.4.1pH對菌株生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CGMCC3.20149菌株最適生長的pH條件為9，其菌落生長速率最快，菌絲豐度最大。當(dāng)pHlt;6或pHgt;9時，菌落的生長變緩（圖5）。但在不同pH條件下，菌落所分泌的色素沒有明顯差異，邊緣的菌絲均為白色或乳白色，菌落中央為淡黃色的菌絲。

2.4.2不同培養(yǎng)基上的生長特性

菌株CGMCC3.20149可在PDA、OA和MEA上生長。接種菌株至PDA，4d后的菌落正面呈灰白色，反面中央呈黃色（圖6-a、b）；7d后的菌落逐漸變?yōu)榛野咨▓D6-c、d）；接種菌株22d后，菌落正面顏色逐漸加深，反面培養(yǎng)基基部有黑色色素分泌（圖6-e、f）。菌絲呈氣生狀，菌絲量較為豐富（圖6-c）。

接種菌株至MEA，4d后的菌落正面呈白色，反面外周呈黃色，中央顏色較深（圖6-g、h）；7d后，逐漸變?yōu)榛野咨?，反面呈黃色，培養(yǎng)基基部有色素分泌（圖6-i、j）；接種22d后，正面顏色逐漸加深，中央顏色變深（圖6-k、l）。

接種菌株至OA，4d后的菌落正面和反面均呈灰色，菌絲量不豐富（圖6-m、n）；7d后的菌落顏色逐漸變深（圖6-o、p）；22d后的正面和反面顏色變深褐色（圖6-q、r）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，致病菌株在OA培養(yǎng)基上生長速率最快，為（0.76±0.01）cm/d；在PDA培養(yǎng)基上的生長速率次之，為（0.73±0.02）cm/d。OA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上的生長速率差異不顯著。在MEA培養(yǎng)基上生長最慢，生長速率為（0.62±0.01）cm/d（圖7）。

菌絲在PDB中的生長試驗(yàn)表明，菌株在60～96h的時間范圍內(nèi)，菌絲生長量最快。96h之后，菌絲生長量不再增加，推測與培養(yǎng)基的消耗、菌絲量的增加、代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、pH值的變化等因素有關(guān)（圖8）。

2.4.3不同溫度條件下的生長特性

不同溫度的試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株在22～25℃范圍內(nèi)的生長速率較快。當(dāng)溫度上升至28℃，菌株生長速率減緩。當(dāng)溫度上升至34℃，菌株的生長停滯（圖9）。

2.4.4不同碳源和氮源對菌株生長的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在不同碳源培養(yǎng)基上菌株的生長速度具有差異。其中，生長速度最快的為含淀粉的培養(yǎng)條件（圖10-c；表1），在含山梨糖的培養(yǎng)條件下生長速度明顯較慢（圖10-e；表1）。菌絲豐度結(jié)果顯示，在含有葡萄糖、D-果糖、淀粉、蔗糖或乳糖等培養(yǎng)基上的菌絲豐度最高（圖10-a、b、c、d、f；表1），在含有山梨糖或甘油的培養(yǎng)基上的菌絲豐度較低（圖10-e、g）。在缺乏含碳培養(yǎng)基的條件下，菌絲發(fā)育稀疏，豐度最低（圖10-h；表1）。

菌株在含有蛋白胨、異亮氨酸或甘氨酸等培養(yǎng)基上的生長速度較快（圖11-a、e、h；表2）；在含有硫酸氨或賴氨酸的培養(yǎng)基上的生長速度相對較緩慢（圖11-c、f；表2）。菌株在不同氮源的培養(yǎng)基上可產(chǎn)生白色、乳白色、黃白色、灰白色、灰色或黑褐色的菌絲。此外，菌株在含有甘氨酸、組氨酸、尿素、異亮氨酸、賴氨酸、蛋白胨或硝酸鉀的培養(yǎng)基上菌絲豐度最高（圖11-a、b、d、e、f、g、h、圖10-d；表2），在含有硫酸銨、亮氨酸或甲硫氨酸的培養(yǎng)基上菌絲豐度較低（圖11-c、g、i；表2）。在缺乏含氮培養(yǎng)基的條件下，菌絲發(fā)育稀疏，豐度最低（圖11-j、表2）。

3結(jié)論與討論

本研究根據(jù)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、多基因系統(tǒng)發(fā)育樹和致病性試驗(yàn)的方法，從貴州省余慶縣二龍茶區(qū)發(fā)生茶樹葉斑病的葉片中發(fā)現(xiàn)致病菌D.bellidis。基于多基因系統(tǒng)發(fā)育樹的方法，Wang等［11］構(gòu)建Didymellaceae的系統(tǒng)發(fā)育樹，將D.bellidis歸到Didymella中。本研究將D.bellidis鑒定為D.bellidisPD94/886和D.bellidisCBS714.85。同時，發(fā)育樹顯示，D.bellidis與Didymellasegeticola在發(fā)育樹上處于鄰近的位置［23］。研究表明，D.bellidisCBS714.85在芬蘭的雛菊（Bellisperennis）上發(fā)現(xiàn)，可引起雛菊產(chǎn)生葉斑?。?4］。后來，陸續(xù)有研究表明，D.bellidis可引起荸薺（Eleocharisdulcis）、白芷（Angelicadahurica）、除蟲菊（Tanacetumcinerariifolium）、杭菊（Chrysanthemummorifolium）、獼猴桃（Actinidiachinensis）和茶樹（Camelliasinensis）等產(chǎn)生葉斑?。?5-30］。此外，擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsissp.）也會引起植物葉斑?。?1］。發(fā)生植物病害會嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)［32］，因此對致病菌的篩選以及病害機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

研究表明，茶葉斑病的病原菌種類較多，且病害的發(fā)生流行機(jī)制尚不明確。茶樹發(fā)生葉斑病的規(guī)律可能存在多種類型。（1）病原菌種類：一種病原菌引起的病害；由多種致病菌協(xié)同引起的病害；由致病菌和非致病菌（例如，內(nèi)生菌）協(xié)同引起的病害。（2）侵入途徑：機(jī)械損傷導(dǎo)致病原的侵入；害蟲取食后對葉片的損傷，繼發(fā)真菌的侵染和繁殖。在茶葉斑病的病原菌鑒定上，本團(tuán)隊已經(jīng)從貴州省多個發(fā)生葉斑病病害的茶區(qū)分離出不同種類的病原菌，如：D.segeticolavar.camelliae［10］、茶擬盤多毛孢菌（P.theae）［33］、長柄鏈格孢菌（Alternarialongipes）［34］、杜仲黑斑病菌（Pestalotiopsistrachicarpicola）［35］和高粱附球菌（E.sorghinum）［36］等，以及部分內(nèi)生菌、弱致病菌。綜合比較前期的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)上述病原菌可產(chǎn)生葉斑的癥狀，但在癥狀產(chǎn)生時間、癥狀輕重程度、癥狀表現(xiàn)等方面存在差異。可能與病原菌的致病力、寄主對病原菌的抗性、致病菌與茶樹微生物種群等因素有關(guān)，本研究可為荸薺莖點(diǎn)霉稈枯病菌所致茶葉斑病的致病機(jī)制研究及田間防治提供重要的參考依據(jù)。

（責(zé)任編輯：嚴(yán)秀芳）

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