鐵皮石斛分子生物學研究進展

摘要：鐵皮石斛在“九大仙草”中名列魁首，具有增強免疫力、抗衰老、抗風濕、降血糖血脂等功效，其分子生物學領(lǐng)域的研究受到了廣泛關(guān)注。開展對鐵皮石斛的研究，不僅具有重要的科學意義，還具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟價值。本文從鐵皮石斛基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、基因克隆與功能、轉(zhuǎn)基因研究等方面對鐵皮石斛的分子生物學研究進行綜述，為加快分子生物學技術(shù)在鐵皮石斛研究中的應用提供參考。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；基因組學；轉(zhuǎn)錄組學；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號：S188

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）04－0045－06

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.04.007

蘭科石斛屬鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）的干燥莖［1］，又名耳環(huán)石斛、黑節(jié)草、救命仙草等［2］。主要分布于安徽西南部（大別山）、四川、云南東南部［3］。鐵皮石斛在醫(yī)藥方面具有很高的藥用價值，既有滋陰清熱、益胃生津，又有抗癌和免疫調(diào)節(jié)等功效［4］。從現(xiàn)代藥理學角度來看，鐵皮石斛所含的多糖和芪類化合物，可以清除體內(nèi)過多的自由基以達到延緩器官衰老的作用，并且對肝癌、胃癌、宮頸癌等細胞均有抑制效應［5］。鐵皮石斛作為我國的傳統(tǒng)中藥材，兼具藥物和保健的功效，是鐵皮石斛顆粒、石斛夜光片、鐵皮石斛膠囊、鐵皮石斛浸膏、鐵皮石斛含片等成藥的主要原料［6］。由于野生鐵皮石斛遭受人為采挖、生態(tài)環(huán)境破壞等原因，導致鐵皮石斛資源稀缺。再加上鐵皮石斛種子細小，成熟果實中的種子數(shù)量極多，呈粉塵狀，在自然環(huán)境中很難萌發(fā)，需要與某些真菌共生才能萌發(fā)，其野生資源已不多見［7］。國務院在1987年發(fā)布的《野生藥材資源保護管理條例》中將鐵皮石斛列為三級保護品種；1992年在《中國植物紅皮書》中被收載為瀕危植物［8］。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，鐵皮石斛分子生物學的研究已成為目前的熱點之一。國內(nèi)外學者采用分子生物學技術(shù)對鐵皮石斛開展了相關(guān)研究，在鐵皮石斛基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學等方面取得了諸多進展，這為鐵皮石斛基因克隆、基因編輯、基因轉(zhuǎn)化、分子標記等分子生物學技術(shù)提供了研究基礎(chǔ)，也為鐵皮石斛植物的鑒別、植物生長發(fā)育及代謝調(diào)控機制等相關(guān)研究提供了新的思路和參考。但有關(guān)鐵皮石斛功能基因分析、分子鑒定等研究領(lǐng)域尚缺乏系統(tǒng)的總結(jié)，限制了對鐵皮石斛的進一步開發(fā)和利用。鑒于此，本文從鐵皮石斛基因功能、分子鑒定、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學等角度，對鐵皮石斛相關(guān)分子生物學研究成果進行綜述，并對當前的問題進行探討，以期為該植物的保護和可持續(xù)利用提供科學參考。

1基因組學研究

基因組數(shù)據(jù)可以為藥用植物提供遺傳基礎(chǔ)知識，以此來彌補植物遺傳和活性化學物之間的差距。由于鐵皮石斛基因組具有特殊的高雜合度和高重復性，使得最開始鐵皮石斛基因組測序的研究遇到了挑戰(zhàn)。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，第二代Illumina高通量測序和第三代PacBio實時單分子測序的出現(xiàn)，多個課題組對鐵皮石斛基因組做出了解析。鐵皮石斛為二倍體單子葉的植物，染色體共有38條（2n=38），Yan等［9］采用二代測序（SGS）和三代測序（TGS）兩種技術(shù)進行組裝得到了1.35Gb的鐵皮石斛全基因組序列，獲得了首個鐵皮石斛基因組草圖，觀察到存在有真菌共生、抗旱有關(guān)的基因家族有擴張的趨勢，如調(diào)節(jié)氣孔密度和分布的SDD1基因，參與熱耐受和光敏色素信號通路的PPP7基因及3MAT等基因家族的擴張可能和鐵皮石斛較強的抗旱能力有密切關(guān)聯(lián)。此外，研究者還分析了鐵皮石斛的主要藥用成分的生物合成途徑，發(fā)現(xiàn)參與多糖生成相關(guān)的SPS和SuSy基因大量重復，這為研究鐵皮石斛中石斛多糖積累的分子機制提供了思路，同時也為鐵皮石斛分子遺傳育種提供了潛在的靶標基因。

與此同時，Zhang等［10］采用IIIuminaHiSeq2000測序平臺和SOAPdenovo2/Platanus組裝方式，對鐵皮石斛全基因組序列進行研究，得到鐵皮石斛全基因組序列大小為1.01Gb，并預測了28910個蛋白編碼基因，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛存在和蝴蝶蘭類似的全基因組復制事件，同時也觀察到其基因組中部分基因家族典型的擴張事件。其中比較典型的有：萜類合成相關(guān)TPS-a亞家族基因得到擴張，家族成員基因數(shù)目遠超過蝴蝶蘭，推測可能和石斛屬的種群擴張有關(guān)，畢竟石斛屬擁有蘭科植物中最龐大的種群。鐵皮石斛基因組中抗性基因R基因家族也得到顯著的擴張，達到了157個，R基因家族在植物的抗病過程中起著非常重要的作用，該基因家族的擴張可能賦予鐵皮石斛更強大的病原免疫系統(tǒng)，幫助其在嚴酷的自然生境中生存。鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）是植物中最重要的鈣離子傳感器，在信號轉(zhuǎn)導、植物生長發(fā)育和脅迫響應中起著重要作用。Yang等［11］通過對鐵皮石斛全基因組分析，在鐵皮石斛中鑒定了24個編碼的鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）基因，試驗數(shù)據(jù)顯示，CDPK9-2和CDPK20-4分別與RbohD和RbohH相互作用，并參與了水楊酸/茉莉酸處理下過氧化氫的產(chǎn)生和氣孔孔徑的調(diào)控。Liu等［12］從鐵皮石斛基因組中鑒定了9個SPX家族基因，酵母雙雜交試驗結(jié)果表明，DoSPX4可與磷酸鹽高親和反應因子（磷酸鹽高親和反應因子）相互作用，結(jié)果突出了DoSPX4基因?qū)Φ土椎捻憫饔谩Ｋ螤幍龋?3］對鐵皮石斛phytocyanin基因家族的全基因組進行分析，從鐵皮石斛全基因組中預測到包含PCLD結(jié)構(gòu)域的38個DoPCs，利用heatmap圖對DoPCs基因與美孢膠膜菌共生萌發(fā)的種子的表達分析得出，有7個基因在種子共生萌發(fā)中有著上調(diào)的表達，這為研究鐵皮石斛與微生物共生的分子機制提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

完善的鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)，為全基因組分析鑒定家族成員、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組分析、基因克隆等提供了有效資源和參考。也為研究鐵皮石斛生長發(fā)育、代謝調(diào)控、脅迫生長、闡明有關(guān)生物學路徑提供分子相關(guān)的信息支撐。

2轉(zhuǎn)錄組學研究

近年來，鐵皮石斛基因組的解析為轉(zhuǎn)錄組研究提供了很好的參考，鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)呈現(xiàn)了良好的發(fā)展勢頭。截至目前，NCBI數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)超過30項，這些研究主要集中在鐵皮石斛組織特異性基因挖掘、有效活性成分生物合成路徑的解析，抗逆信號通路挖掘以及生長發(fā)育機制、真菌共生機制等方面。目前已經(jīng)通過比較轉(zhuǎn)錄組學，挖掘出鐵皮石斛花、根、莖、葉等部位特異性表達的轉(zhuǎn)錄本2900余條，這些特異表達的基因可能在不同的器官中參與獨特的功能。研究表明，莖稈中發(fā)現(xiàn)的8個高豐度且特異表達基因可能參與碳水化合物的轉(zhuǎn)運與代謝過程，在花中發(fā)現(xiàn)的25個特異基因可能參與石斛的開花調(diào)控，這些為鐵皮石斛重要性狀的基因功能解析提供了良好的研究基礎(chǔ)。

生物堿是在鐵皮石斛中最早發(fā)現(xiàn)的活性成分，存在于鐵皮石斛的根、莖、葉、花等多個組織部位，其中原球莖含量最高，通過不同組織轉(zhuǎn)錄組差異分析，獲得了一些可能參與調(diào)控鐵皮石斛生物堿合成的基因。如Wang［14］通過分析原球莖和葉片的轉(zhuǎn)錄組差異，獲得了41個顯著差異基因，其中包含參與生物堿生物合成途徑中的異胡豆苷-β-葡萄糖苷酶、縫籽木榛合成酶（Geissoschizinesynthase，GS）和Vinorine合成酶的候選基因，這有助于在今后的研究中分析鐵皮石斛生物堿的合成機制。鐵皮石斛中的多糖是各種組織中最豐富的活性化合物，而成熟莖中的含量最高，通過對不同組織的比較轉(zhuǎn)錄組分析，挖掘了鐵皮石斛果糖和甘露糖生物合成的代謝途徑，并推測8個纖維素酶合酶（CSLA）基因家族成員在莖中的特異表達模式與莖中高甘露糖含量性狀密切相關(guān)。此外，使用PacBio測序技術(shù)，檢測到鐵皮石斛中2個糖基轉(zhuǎn)移酶和4個纖維素合成酶基因存在可變剪切，而且2個編碼蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的基因在莖中的表達高于在葉中的表達，這些研究為進一步研究鐵皮石斛富含多糖的分子機制提供了線索［15］。

此外，轉(zhuǎn)錄組被應用于研究激素處理對鐵皮石斛藥效活性成分積累的影響。Niu等［16］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中水楊酸的存在可以增加鐵皮石斛幼苗中生物堿、多糖和類黃酮等生物活性成分的積累，轉(zhuǎn)錄組差異分析發(fā)現(xiàn)多達107個參與這些活性成分生物合成的基因在激素處理組被上調(diào)，這些研究為進一步推測基因的功能提供信息，也為鐵皮石斛活性化合物含量的品種選育提供借鑒。

轉(zhuǎn)錄組學也被用于研究鐵皮石斛的其他生理過程。在自然界中，由于自交不親和性，鐵皮石斛通常很少形成種子。Chen等［17］通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得41個可能參與自交不親和的基因，包括6個鈣離子信號基因和11個S位點受體激酶相關(guān)基因，這為鐵皮石斛的遺傳機制和種群保護提供了有益的見解。此外，鐵皮石斛種子細小，胚胎發(fā)育不全，自然界中鐵皮石斛種子的萌發(fā)往往依賴與菌根真菌的共生關(guān)系。轉(zhuǎn)錄組研究表明內(nèi)源激素在鐵皮石斛種子共生萌發(fā)中起著至關(guān)重要的作用，接種菌根真菌后，種子與赤霉素（GA）生物合成相關(guān)的基因上調(diào)，因此推測GA3可能是鐵皮石斛種子萌發(fā)的關(guān)鍵信號分子［18］。這些結(jié)果為蘭科真菌共生和種子萌發(fā)提供了有價值的參考。

3基因克隆與功能研究

對鐵皮石斛功能基因的研究，可以揭示鐵皮石斛分子鑒定、生長發(fā)育、代謝調(diào)控機制等。目前，對鐵皮石斛功能基因的研究主要集中在生長發(fā)育調(diào)控基因、抗逆基因等。

3.1參與脅迫響應的基因

在大自然中的植物，一般生長在干旱、鹽漬、高低溫度等環(huán)境中，這些環(huán)境對植物的生長發(fā)育起到一定的制約作用［19］。隨著植物在大自然的進化，植物為了抵抗和適應環(huán)境的脅迫，形成了一系列較為獨特的防御機制來降低環(huán)境對植物本身的損害［20］。多梳類（PcG）蛋白通過表達沉默同源異型基因來調(diào)控體節(jié)發(fā)育，PcG蛋白由兩個復合體構(gòu)成，分別是PRC1、PRC2，PRC2是負責標記的沉默基因。仇漢林等［21］為了探討PRC2復合體對鐵皮石斛的生長發(fā)育和脅迫響應的影響，通過熒光定量PCR檢測該基因?qū)Ψ巧锩{迫和病毒脅迫的響應，發(fā)現(xiàn)PRC2復合體中的成員DoCLF在低溫、高溫和脫水等各種環(huán)境脅迫誘導。植物中類受體激酶（RLK）在響應生物、非生物脅迫因子中發(fā)揮極大的作用。高靜等［22］對鐵皮石斛RLK基因進行克隆與分析，通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)DoRLK基因的轉(zhuǎn)錄本在鐵皮石斛根中表達較高，可以說明該基因參與植物組織的生長發(fā)育，可能影響根的形成，這進一步揭示RLK基因在鐵皮石斛與環(huán)境互作中的功能關(guān)系。植物中的晚期胚胎富集蛋白（LEA）就是一種與植物抗逆性密切有關(guān)的蛋白，凌鴻等［23］以鐵皮石斛種子為材料，克隆DoLEA2基因并對其進行分析，得出其參與鐵皮石斛的生長發(fā)育，且在高鹽脅迫的條件下通過表達積累來響應環(huán)境脅迫，從而降低脅迫引起的對自身的損害。

3.2參與生長發(fā)育調(diào)控的基因

劉楚琪等［24］對鐵皮石斛氨基酸通透酶基因DoAAP2進行克隆與分析，并通過實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，該基因在莖和葉中的表達量較高，推測該蛋白參與了植物的光合作用，并且對鐵皮石斛成熟種子處于培養(yǎng)過程中的7個時期進行試驗分析，分別是：種胚活化期（P1）、原球莖形成期（P2）、原分生組織形成期（P3）、頂端分生組織形成期（P4）、橢球型原球莖期（P5）、葉原基維管系統(tǒng)形成期（P6）、根端分生組織形成期（P7），得出在P3、P4、P7時期的表達量較高，表明DoAAP2基因在鐵皮石斛的根、莖發(fā)育中起著重要的作用。在生物體中，要想實現(xiàn)對細胞周期、細胞凋亡及信號轉(zhuǎn)導等的調(diào)控，其中依賴泛素或類泛素翻譯后的蛋白修飾起到重要的作用［25］，而泛素結(jié)合酶（UBC9）是唯一作用參與泛素化過程和類泛素化過程的泛素結(jié)合酶［26］。馬凌暉等［27］對鐵皮石斛UBC9進行克隆與分析，發(fā)現(xiàn)其在愈傷組織中表達量最高，在P1時期具有最高的表達量，可能促進植物細胞的快速分裂、生長，并在鐵皮石斛的愈傷組織和種子活化期高度表達。李依民等［28］通過對鐵皮石斛ABC轉(zhuǎn)運蛋白F家族基因克隆及分析，從鐵皮石斛中分離到2個F家族ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因與F家族ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的相似性高達80%以上，均在葉中高度表達，暗示可能在鐵皮石斛生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。

在蛋白質(zhì)可逆磷酸化調(diào)控中蛋白磷酸酶是主要調(diào)控酶，屬于PP2Cs家族［29］，在植物中PP2Cs家族是調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶、脫落酸或受體激酶等信號的通路［30］。李依民等［31］對鐵皮石斛蛋白磷酸酶基因DoPP2C2進行克隆與分析，獲得了基因全長及分子特征，為鐵皮石斛在生長發(fā)育中的分子作用奠定基礎(chǔ)，同時為道地藥材形成機制的研究、良種培育提供了科學依據(jù)。劉亮亮等［32］克隆鐵皮石斛蛋白磷酸酶2A基因，其所在家族在調(diào)控植物生理代謝過程與基因分子的表達特征有著密切的關(guān)系，為揭示其在鐵皮石斛生長發(fā)育中的分子作用奠定基礎(chǔ)。

3.3參與次生代謝相關(guān)的基因

鐵皮石斛的主要化學成分以多糖、生物堿、黃酮、萜類為主，其中多糖是鐵皮石斛較為主要的活性成分之一。鐵皮石斛中的多糖類可通過增強吞噬細胞的作用來清除人體內(nèi)的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，達到抗氧化的作用［33-35］。張春柳等［36］從鐵皮石斛原球莖中克隆了2個糖基轉(zhuǎn)移酶基因，分別是DoGAUT1、DoPGSIP6，發(fā)現(xiàn)T1表達合成多糖，符合次生代謝的積累規(guī)律，P6大量合成胞外多糖。在植物次生代謝中，查爾酮合成酶（CHS）是黃酮類化合物合成的第一關(guān)鍵酶［37］；孟衡玲等［38］對鐵皮石斛中的CHS基因進行克隆與分析，發(fā)現(xiàn)該基因在鐵皮石斛的早期參與激素運輸和植物器官形態(tài)的形成，在后期主要參與類黃酮物質(zhì)的形成；林艷君等［39］采用同源克隆的方法克隆得到鐵皮石斛Do-HDR基因，用滅活的尖孢鐮刀菌菌液作為誘導子，設置不同的濃度梯度，發(fā)現(xiàn)當誘導子為200mg/L時，總生物堿的含量達到最大，可以推測該基因與鐵皮石斛中生物堿的合成、積累有關(guān)。

3.4參與休眠解除和菌根互作相關(guān)的基因

鐵皮石斛是一種獨特的菌根植物，在生長過程中，真菌會侵染其根皮層，為鐵皮石斛的生長提供一定的營養(yǎng)支撐，從而促進幼苗的萌發(fā)、植株生長、增強植株的抗性，是提高鐵皮石斛的生長速率和成活率的關(guān)鍵因素［40］。鐵皮石斛在生長過程中幾乎都是與真菌共生的，這種共生關(guān)系伴隨著鐵皮石斛的整個生活史。楊前宇［41］從11種蘭屬植物分離獲得1450株菌根真菌、從41種石斛屬植物分離獲得1434株菌根真菌，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛的種子與酶胞膠膜菌中CaM和CML所在的基因家族參與生物學調(diào)控。趙明明等［42］首次從鐵皮石斛種子中分離得到一個鈣依賴蛋白激酶（CDPK），數(shù)據(jù)分析顯示DoCDPK1、DoCDPK32-like基因在種子中接菌共生萌發(fā)、非共生萌發(fā)中均有上調(diào)表達，可以暗示該基因在種子萌發(fā)、真菌共生等信號傳導中起著調(diào)控的作用。張崗等［43］利用小菇真菌來浸染鐵皮石斛根部克隆得到一個促分裂原活化蛋白激酶基因（DoMPK1），結(jié)果表明：該基因可能參與小菇-鐵皮石斛菌根共生互作。

4轉(zhuǎn)基因研究

1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物，到目前對轉(zhuǎn)基因植物的研究已經(jīng)取得了突破性的飛躍。目前報道的對遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究多采用農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、農(nóng)桿菌子房注射法等，其中農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法在水稻、小麥、玉米等植物得到廣泛的應用。利用一些分子技術(shù)將外源目的基因插入到受體植物中，通過篩選和培養(yǎng)來獲得具有抗性的植株，且轉(zhuǎn)化后的植株具有較穩(wěn)定的遺傳表達［44］。龔延鋒等［45］對鐵皮石斛阿拉伯吡喃糖變位酶（DoUAM）進行克隆與分析，將目的基因通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)到擬南芥中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)DoUAM基因與對照組相比生長緩慢、葉片較瘦小，以此分析基因可能與植物的發(fā)育有關(guān)。崔波等［46］以鐵皮石斛的原球莖為受體，在摁壓條件下，原球莖在濃度為200μmol/L的乙酰丁香酮菌液中浸染30min，培養(yǎng)48h后，轉(zhuǎn)入美羅培南、草甘膦篩選的培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化的效率最高，這為研究農(nóng)桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了幫助。楊雪飛等［47］利用基因槍轟擊類原球莖法，將大麥中的抗旱耐鹽堿的基因lea3導入鐵皮石斛中，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物耐鹽等脅迫的能力提高，這為鐵皮石斛新品種的選育邁進了一步。陳璐等［48］通過農(nóng)桿菌介導法將核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）基因?qū)霟o菌鐵皮石斛原球莖中，Rubisco基因在植物光合作用的葉綠體中存在，由此發(fā)現(xiàn)該基因?qū)μ岣咧参锏墓夂献饔闷鹬匾饔?。研究發(fā)現(xiàn)，當OD600=0.9，浸染時間為30min，特美?。═MT）的濃度為50mg/L，潮霉素（Hyg）濃度為55mg/L時遺傳轉(zhuǎn)化率最高。武榮花等［49］利用農(nóng)桿菌介導1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）的反義基因?qū)﹁F皮石斛原球莖進行遺傳轉(zhuǎn)化，得出用刀切法來處理原球莖，在乙酰丁香酮（AS）濃度為100μmol/L、農(nóng)桿菌菌液OD600=0.8條件下，浸染時間為30min，共培養(yǎng)的時間為60h，最后接種到含有30mg/LMer和3.0mg/L草甘膦（PPT）的培養(yǎng)基中，遺傳轉(zhuǎn)化的效率最高。

5基因編輯

植物基因功能鑒定和新品種的選育很大程度上離不開植物突變體的獲得，通過自然突變、化學、物理誘導等方法，出現(xiàn)突變效率低、突變位點隨機，很難得到確定的突變基因［50］。通過CRISPR/CAS9編輯技術(shù)可以實現(xiàn)精準的基因編輯作用。在單子葉植物和雙子葉植物抗病性基因改良中，采用CRISPR技術(shù)可以切除入侵病毒和外源DNA，從而達到保護自身免受侵害的作用［51］。研究表明鐵皮石斛中的多糖和纖維素含量呈負相關(guān)，胡淞等［52］為了減少鐵皮石斛中的纖維含量，利用CRISPR/CAS9編輯技術(shù)構(gòu)建敲除載體，獲得Csl4基因突變體，發(fā)現(xiàn)突變體植株能降低鐵皮石斛莖中的纖維素合成。SEP3基因在鐵皮石斛花器官的形成和發(fā)育中起著重要作用，黃鑫等［53］利用CRISPR/CAS9編輯技術(shù)構(gòu)建基因敲除載體，并使用農(nóng)桿菌介導法進行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得陽性原球莖，這為SEP3基因在鐵皮石斛基因表達的研究提供了幫助。Kui等［54］基于先前開發(fā)的農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，鑒定了幾種外源性基因表達的高效啟動子，并成功應用于CRISPR/CAS9編輯基因組中的內(nèi)源基因。

6結(jié)語與展望

隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代高通量測序技術(shù)的開發(fā)在鐵皮石斛的分子生物學研究中起著很大的推動作用。然而，由于鐵皮石斛自身的特征和地理分布，加上其分子生物學研究的團隊力量薄弱、資金投入不足等原因，導致分子生物技術(shù)在鐵皮石斛的應用方面存在很多難點。目前利用轉(zhuǎn)錄組學、基因克隆等技術(shù)對鐵皮石斛的功能基因的研究取得了一定的進展，但主要集中在對鐵皮石斛生長發(fā)育、次生代謝、脅迫相關(guān)的基因方面，對其他相關(guān)基因研究甚少。在未來對功能基因的研究中，可以充分利用CRISPR/Cas9等編輯技術(shù)，通過基因編輯關(guān)鍵功能基因來提高功能基因的表達，雖然CRISPR/Cas9等編輯技術(shù)存在脫靶等問題，但相信隨著對編輯技術(shù)的不斷研究深入，脫靶等問題將會逐漸完善并得到解決，從而為鐵皮石斛功能基因組的研究提供新的思路。

（責任編輯：胡吉鳳）

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005.

［2］中國科學院《中國植物志》編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學出版社，2004.

［3］丁立起.中華食療本草［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2018.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學工業(yè)出版社，1995.

［5］孫恒，胡強，金航，等.鐵皮石斛化學成分及藥理活性研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2017，23（11）：225-234.

［6］胡秦佳寶，朱亞雄.鐵皮石斛加工制品研究現(xiàn)狀［J］.保鮮與加工，2019，19（1）：159-164.

［7］周俊輝，鐘雪鋒，蔡丁穩(wěn).鐵皮石斛的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究［J］.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學院學報，2005（1）：23-26.

［8］張?zhí)熘?觀賞藥用植物栽培技術(shù)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2017.

［9］YanL，WangX，LiuH，etal.ThegenomeofDendrobiumofficinaleilluminatesthebiologyoftheimportanttraditionalChineseorchidherb［J］.MolecularPlant，2015，8（6）：922-934.

［10］ZhangGQ，XuQ，BianC，etal.TheDendrobiumcatenatumLindl.genomesequenceprovidesinsightsintopolysaccharidesynthase，floraldevelopmentandadaptiveevolution［J］.ScientificReports，2016，6（1）：1-10.

［11］YangX，ChenZ，YinX，etal.Genome-widesurveyindicatesdiversephysiologicalrolesofDendrobiumofficinalecalcium-dependentproteinkinasegenes［J］.InternationalJournalofMolecularSciences，2022，23（3）：1298.

［12］LiuL，XiangH，SongJ，etal.Genome-wideanalysisofDoSPXgenesandthefunctionofDoSPX4inlowphosphorusresponseinDendrobiumofficinale［J］.FrontiersinPlantScience，2022：13.

［13］宋爭，李潞濱，梁立雄，等.鐵皮石斛phytocyanin基因家族全基因組分析［J］.林業(yè)科學研究，2018，31（2）：98-106.

［14］WangYH.Traditionaluses，chemicalconstituents，pharmacologicalactivities，andtoxicologicaleffectsofDendrobiumleaves：areview［J］.JournalofEthnopharmacology，2021，270：113851.

［15］HeC，ZhangJ，LiuX，etal.IdentificationofgenesinvolvedinbiosynthesisofmannanpolysaccharidesinDendrobiumofficinalebyRNA-seqanalysis［J］.PlantMolecularBiology，2015，88（3）：219-231.

［16］NiuZ，ZhuF，F(xiàn)anY，etal.Thechromosome-levelreferencegenomeassemblyforDendrobiumofficinaleanditsutilityoffunctionalgenomicsresearchandmolecularbreedingstudy［J］.ActaPharmaceuticaSinicaB，2021，11（7）：2080-2092.

［17］ChenY，HuB，ZhangF，etal.Cytologicalobservationandtranscriptomecomparativeanalysisofself-pollinationandcross-pollinationinDendrobiumofficinale［J］.Genes，2021，12（3）：432.

［18］ChenJ，YanB，TangY，etal.SymbioticandasymbioticgerminationofDendrobiumofficinale（Orchidaceae）responddifferentlytoexogenousgibberellins［J］.InternationalJournalofMolecularSciences，2020，21（17）：6104.

［19］SenguptaS，MajumderAL.Insightintothesalttolerancefactorsofawildhalophyticrice，Porteresiacoarctata：aphysiologicalandproteomicapproach［J］.Planta，2009，229（4）：911-929.

［20］MunnsR，TesterM.Mechanismsofsalinitytolerance［J］.AnnualReviewofPlantBiology，2008，59：651-681.

［21］仇漢林，屈東海，陳東紅，等.鐵皮石斛PRC2復合體成員的鑒定及對脅迫響應的表達分析［J］.核農(nóng)學報，2020，34（3）：497-505.

［22］高靜，王楠，劉阿萍，等.鐵皮石斛類受體激酶DoRLK的基因克隆和分子特征［J］.中草藥，2019，50（21）：5307-5312.

［23］凌鴻，曾旭，郭順星.鐵皮石斛DoLEA2基因的克隆、表達及功能分析［J］.藥學學報，2017，52（8）：1337-1344.

［24］劉楚琪，胡睿，王萬軍.鐵皮石斛氨基酸通透酶基因（DoAAP2）的克隆及表達分析［J］.生物學雜志，2019，36（6）：6-11.

［25］HershkoA，CiechanoverA.Theubiquitinsystem［J］.AnnualReviewofBiochemistry，1998，67（1）：425-479.

［26］YuF，WangH，WangL，etal.Orthoreovirusouter-fiberproteinsaresubstratesforSUMO-conjugatingenzymeUbc9［J］.Oncotarget，2016，7（48）：79814-79827.

［27］馬凌暉，歐景丹，劉榮榮，等.鐵皮石斛泛素結(jié)合酶DoUBC9的克隆鑒定與表達分析［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2019，19（13）：2407-2413.

［28］李依民，雷根平，顏永剛，等.鐵皮石斛2個F家族ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆和表達研究［J］.中草藥，2017，48（15）：3153-3159.

［29］FuchsS，GrillE，MeskieneI，etal.Type2Cproteinphosphatasesinplants［J］.TheFEBSJournal，2013，280（2）：681-693.

［30］SchweighoferA，HirtH，MeskieneI.PlantPP2Cphosphatases：emergingfunctionsinstresssignaling［J］.TrendsinPlantScience，2004，9（5）：236-243.

［31］李依民，李元敏，梁小燕，等.一個A亞族鐵皮石斛蛋白磷酸酶2C基因的分子特征研究［J］.中國藥學雜志，2020，55（14）：1195-1200.

［32］劉亮亮，張娜，黑小斌，等.鐵皮石斛蛋白磷酸酶2A基因的分子克隆研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2018，52（9）：61-64，68.

［33］NgTB，LiuJ，WongJH，etal.ReviewofresearchonDendrobium，aprizedfolkmedicine［J］.AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2012，93（5）：1795-1803.

［34］MengLZ，LvGP，HuDJ，etal.EffectsofpolysaccharidesfromdifferentspeciesofDendrobium（Shihu）onmacrophagefunction［J］.Molecules，2013，18（5）：5779-5791.

［35］FanY，HeXJ，ZhouS，etal.CompositionanalysisandantioxidantactivityofpolysaccharidefromDendrobiumdenneanum［J］.InternationalJournalofBiologicalMacromolecules，2009，45（2）：169-173.

［36］張春柳，賴鐘雄.鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因的克隆及其在不同晝夜溫差下的表達分析［J］.熱帶作物學報，2015，36（3）：456-465.

［37］康亞蘭，裴瑾，劉薇，等.紅花查爾酮合成酶基因的克隆、生物信息學分析及表達［J］.中草藥，2014，45（16）：2385-2389.

［38］孟衡玲，張薇，盧丙越，等.鐵皮石斛查爾酮合酶基因克隆與表達分析［J］.南方農(nóng)業(yè)學報，2016，47（12）：2015-2019.

［39］林艷君，賴鐘雄.鐵皮石斛HDR基因克隆及真菌誘導子對其表達和生物堿含量的影響［J］.熱帶作物學報，2015，36（4）：680-686.

［40］韓潔，杜琳霖，趙杰宏.石斛屬藥用植物內(nèi)生菌研究進展［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學報，2020，39（3）：41-45.

［41］楊前宇.蘭科菌根真菌多樣性研究及其對蘭科植物的影響［D］.北京：中國林業(yè)科學研究院，2018.

［42］趙明明，張崗，張大為，等.鐵皮石斛S-腺苷酸脫羧酶基因DoSAMDC1的克隆及特征分析［J］.藥學學報，2013，48（6）：946-952.

［43］張崗，趙明明，宋超，等.鐵皮石斛促分裂原活化蛋白激酶基因DoMPK1的克隆及特征分析［J］.藥學學報，2012，47（12）：1703-1709.

［44］張文惠，曾碧玉，劉福平.蝴蝶蘭基因工程研究進展［J］.江西農(nóng)業(yè)學報，2010，22（12）：37-40，43.

［45］龔廷鋒，文國松，趙明富.鐵皮石斛DoUAM基因克隆及轉(zhuǎn)化擬南芥［J］.分子植物育種，2019，17（23）：7733-7743.

［46］崔波，劉佳，王潔瓊，等.農(nóng)桿菌介導的鐵皮石斛遺傳轉(zhuǎn)化體系研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學學報，2015，49（2）：208-212.

［47］楊雪飛，王瑛，羅建平.鐵皮石斛外源lea3基因的轉(zhuǎn)化及耐鹽性分析［J］.應用與環(huán)境生物學報，2010，16（5）：622-626.

［48］陳璐，陶明翠，劉丹，等.Rubisco基因遺傳轉(zhuǎn)化鐵皮石斛的條件篩選與優(yōu)化［J］.分子植物育種，2021，19（23）：7845-7850.

［49］武榮花，康瑩瑩，王潔瓊，等.農(nóng)桿菌介導的ACO反義基因?qū)﹁F皮石斛的遺傳轉(zhuǎn)化［J］.華北農(nóng)學報，2015，30（2）：17-21.

［50］劉耀光，李構(gòu)思，張雅玲，等.CRISPR/Cas植物基因組編輯技術(shù)研究進展［J］.華南農(nóng)業(yè)大學學報，2019，40（5）：38-49.

［51］羅麗婷，蔣君梅，李向陽，等.CRISPR技術(shù)在改良植物抗病性中的應用［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學報，2021，40（4）：46-57.

［52］胡淞，田英男，馮壘，等.利用CRISPR/cas9技術(shù)研究鐵皮石斛Csl4基因的功能［J］.分子植物育種，2021，19（8）：2596-2602.

［53］黃鑫，師凱輝，胡淞，等.鐵皮石斛SEP3基因的生物信息學分析及敲除載體的構(gòu)建［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2021，48（4）：555-559.

［54］KuiL，ChenH，ZhangW，etal.Buildingageneticmanipulationtoolboxfororchidbiology：identificationofconstitutivepromotersandapplicationofCRISPR/Cas9intheorchid，Dendrobiumofficinale［J］.FrontiersinPlantScience，2017，7：2036.