杜仲種子內(nèi)生微生物群落組成及生態(tài)功能分析

張青青 董醇波 邵秋雨 陸瑩霞 董旋 梁宗琦 韓燕峰

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序；可培養(yǎng)法；多樣性；生態(tài)功能

植物內(nèi)生菌（Endophytes）是指某一階段或所有階段生活在健康植物的組織或器官中，與植物建立特殊的相互關(guān)系，并不會(huì)對(duì)宿主引起明顯病害的一類微生物。據(jù)報(bào)道，植物內(nèi)生菌作為一種新興微生物資源，對(duì)植物的生長(zhǎng)和健康至關(guān)重要，且在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。

種子是植物的重要繁殖器官，是遺傳信息的保存和傳遞者，其內(nèi)攜帶豐富多樣的微生物。種子內(nèi)生菌主要包括多種真菌和細(xì)菌，能從不同環(huán)境（如空氣、水、昆蟲）通過水平傳播獲得，同時(shí)也能從母株通過垂直傳播獲得，并代代相傳。種子中常見真菌屬有鏈格孢屬（Alternaria）、枝孢霉屬、青霉屬等，常見細(xì)菌屬有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、泛菌屬（Pantoea）等；而種子內(nèi)生菌的群落組成和多樣性常受多種生物與非生物因素的影響，如植物品種、基因型、種子成熟過程、地理位置及病原體入侵等。研究表明，種子作為微生物的載體會(huì)因自身及特殊的生存環(huán)境在內(nèi)部形成獨(dú)特的微生物群落，這些特殊類群可為宿主植物提供保護(hù)功能。當(dāng)種子內(nèi)生菌作為益生微生物資源，能通過直接（如固氮、溶磷和產(chǎn)生植物激素）或間接作用（對(duì)抗植物病害、提高植物抗逆性和生物與非生物的耐受性）促進(jìn)種子的萌發(fā)和幼苗的建立

除此之外，種子相關(guān)內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主次級(jí)代謝成分相同或者相似的化合物，它們能調(diào)控宿主植物的次級(jí)代謝，促進(jìn)有效成分的合成與積累。陳海敏等發(fā)現(xiàn)，種子中的草莖點(diǎn)霉（Phoma herbarum）D603可以有效促進(jìn)丹參根部丹參酮類成分，尤其是丹參酮IIA的合成與積累。然而，并非所有的微生物都是有益的，種子攜帶的一些病原菌會(huì)降低種子活力、抑制種子萌發(fā)和引起植物病害，進(jìn)而對(duì)糧食作物和林木安全生產(chǎn)造成威脅。因此，了解種子相關(guān)的微生物群落組成和功能可以幫助我們了解種子健康，防止有害微生物的影響，并充分利用與種子相關(guān)的有益微生物。

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）是我國(guó)特有的藥用和經(jīng)濟(jì)樹種，作為藥材，具有降壓、增強(qiáng)免疫力、降血糖等藥理作用；杜仲果、葉、皮中均含有豐富的杜仲橡膠，且杜仲果實(shí)富含油脂，是開發(fā)保健品、功能食品、高檔食用油的優(yōu)質(zhì)原料。前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲的不同組織中都伴有豐富的內(nèi)生微生物，并且這些微生物與宿主健康、生產(chǎn)力和藥用成分的合成和積累有關(guān)。楊娟等研究表明，杜仲樹皮中的某些真菌類群與樹皮的藥理活性成分成正相關(guān)。Dong等通過探究杜仲樹皮中細(xì)菌群落組成和核心微生物群的功能，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌群中的大部分核心菌群與樹皮的藥理活性成分相關(guān)。然而，迄今為止，大多數(shù)相關(guān)研究通常集中在根際、莖、葉，對(duì)于杜仲種子相關(guān)微生物的組成結(jié)構(gòu)以及生態(tài)功能的了解仍然知之甚少。因此，本研究結(jié)合分離培養(yǎng)法和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)杜仲種子內(nèi)生真菌和細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行探究。同時(shí)，利用FUNGuild和FAPROTAX平臺(tái)進(jìn)行功能注釋。高通量測(cè)序技術(shù)能更加全面的揭示杜仲種子內(nèi)生菌群落組成和多樣性，可培養(yǎng)法可以分離獲得實(shí)體菌株，這2種方法的結(jié)合能全面認(rèn)識(shí)杜仲種子微生物，豐富杜仲相關(guān)微生物資源，并為今后杜仲種子內(nèi)生菌的功能研究以及杜仲的高效栽培提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1種子處理

杜仲果實(shí)采自陜西省漢中市寧強(qiáng)縣大安鎮(zhèn)。樣品編號(hào)后封存在自封袋中，放人4℃冰箱保存?zhèn)溆?。將杜仲果?shí)剝?nèi)ス?，稱取5g種子置于燒杯中，依次用無菌蒸餾水對(duì)杜仲種子進(jìn)行沖洗，75%的酒精消毒30s，5%的次氯酸鈉進(jìn)行消毒3～5min，75%酒精消毒30s，最后使用無菌蒸餾水沖洗5～6遍，在無菌條件下晾干，以備用。將最后一次沖洗種子的無菌水涂布到PDA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基上作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以保證表面滅菌徹底。

1.2分離培養(yǎng)

1.2.1內(nèi)生真菌的分離純化真菌的分離培養(yǎng)基分別使用PDA培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基。分離方法采用（1）組織塊分離法：將一部分表面滅菌好的種子放人研缽中碾碎，直接放在PDA培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基中；另一部分使用無菌刀劃開幾個(gè)小口，將其接種到PDA培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基，并保證切口直接接觸培養(yǎng)基，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)；（2）稀釋涂布平板法：取表面滅菌后的種子樣品5g，放在加有5mL的無菌蒸餾水的無菌研缽中充分研磨，裝入離心管中充分搖勻，并稀釋成10-1、10-2、10-3懸液，分別吸取100、200、300UL稀釋液涂布于PDA培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，置于25～28℃下培養(yǎng)5～7d。待菌絲長(zhǎng)出，用接菌針從邊緣挑取菌絲移至PDA平板，采用菌絲頂端純化法對(duì)分離出的菌種逐步進(jìn)行純化。

1.2.2內(nèi)生細(xì)菌的分離純化細(xì)菌的分離培養(yǎng)基使用LB、NA、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。分離方法采用稀釋涂布平板法：取表面滅菌后的樣品5g，放在加有5mL的無菌蒸餾水的無菌研缽中充分研磨，裝入離心管中充分搖勻，將其稀釋成10-1、10-2、10-3懸液，并分別吸取100、200、300μL稀釋液涂布于LB、NA、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于25～28℃下培養(yǎng)4～5d。根據(jù)菌落形態(tài)（大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度等），隨機(jī)挑取具有差異的代表性菌株進(jìn)行平板劃線法逐步純化。

1.3分子鑒定

1.3.1DNA的提取、PCR擴(kuò)增反應(yīng)參考真菌基因組DNA提取試劑盒（北京白泰克生物技術(shù)有限公司）和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行真菌和細(xì)菌的DNA提取。細(xì)菌16SrDNA引物：27F（5-AGAGTTTGATGCTGGCTGAG-3）和1 492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3），真菌ITS引物：ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 7）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）.PCR反應(yīng)體系（ 25 pL）：引物ITS1和ITS4均為1 UL，2×Taq PCR Master-mix為12.5UL， ddH20 8.5pL，細(xì)菌／真菌DNA 2 pL。細(xì)菌PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，92℃變性30s，50℃退火30s，68℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)，78℃延伸8min。真菌PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變陛5min，1個(gè)循環(huán)，94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。分別取擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.2序列數(shù)據(jù)分析將獲得的待鑒定的ITS和16SrDNA擴(kuò)增序列，經(jīng)手工校對(duì)后登陸NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行blast比對(duì)，得到相似度最高的序列，進(jìn)行種屬鑒定。

1.4高通量測(cè)序

1.4.1總DNA提取、PGR擴(kuò)增及l(fā)lluminaMiSeq測(cè)序選取顆粒大小一致的飽滿種子，經(jīng)表面滅菌后（同上1.1），分別用液氮進(jìn)行充分研磨，并裝入無菌離心管中，樣本共設(shè)置3個(gè)重復(fù)。處理后的所有樣本均置于-80℃冰箱保存，用于總DNA提取和高通量測(cè)序?？侱NA的提取按總DNA提取試劑盒（FastDNA⑩SPIN Kit for Soil）的說明書操作程序進(jìn)行。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。PCR擴(kuò)增分別選用ITS1區(qū)真菌引物（ITSIF，5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3和ITS2R，5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）和細(xì)菌引物（799F，5-AACMGGATTAGATACCCKG-3和1193R， 5'-ACGTCATCCCCACCTTCC-3）。采用20mL的PCR反應(yīng)體系：5×Buffer4UL，2.5mmoI.L-1 dNTPs 2UL，每個(gè)正向和反向引物（5mol-1）0.8UL，rTaq多聚酶0.4pL，BSA 0.2UL，模板DNA10ng，而后補(bǔ)ddH20至20UL。真菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：95℃3min；95℃30s，退火溫度55℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，10℃直至用戶停止。細(xì)菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)條仵：95℃3min；95℃15s，退火溫度55℃30s，72℃45s，13個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃保存。PCR儀：ABI GeneAmp9700型。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司（www.majorbio.com）lllumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4.2原始數(shù)據(jù)處理使用Qiime2軟件中的DADA2插件對(duì)所有樣品的全部原始序列進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接及去嵌合體處理，形成OTU（operational taxonomic unit）。選取OTU的代表性序列于Unite（Release7.0，http：//unite.ut.ee/index.php）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得每個(gè)OTU的物種注釋信息?；谖锓N注釋信息，去除注釋為葉綠體、線粒體和不能注釋到界（kingdom）水平的OTU及其包含的序列，最終形成數(shù)據(jù)均一化的OTU及其他分類水平物種豐度譜。

1.5多樣性分析

使用Qiime2和Excel軟件計(jì)算各樣本Alpha多樣性指數(shù)，包括香農(nóng)．維納指數(shù)（Shannondiversity index）、辛普森指數(shù)（Simpson diversityindex）．chaol指數(shù)、ACE指數(shù)等。

1.6生態(tài)功能注釋

真菌功能類群分析：采用FUNGuild（http：//fungu．ld.org）數(shù)據(jù)庫對(duì)真菌群落進(jìn)行功能注釋，置信度選擇可能（probable）和很可能（highlyprobable）。

細(xì)菌功能類群分析：采用FAPROTAX數(shù)據(jù)庫（http：//www.ehbio.com/lmageGP/index.php/Ho-me/lndex/FAPROTAX.html）對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行功臺(tái)旨注釋。

2結(jié)果與分析

2.1杜仲種子微生物群落組成

傳統(tǒng)培養(yǎng)法獲得的杜仲種子微生物群落組成（表1）表明：采用分離培養(yǎng)法共獲得真菌40株，初步鑒定為3門、5綱、8目、10科、11屬、18種。在門水平，杜仲種子中可培養(yǎng)真菌歸為3個(gè)門：子囊菌門（Ascomycota）（87.50%）、擔(dān)子菌門（10%）、毛霉門（Mucoromycota）（2.50%），其中，子囊菌門（Ascomycota）為主要優(yōu)勢(shì)菌門，其次為擔(dān)子菌門。在綱水平，散囊菌綱（Eurotiomycetes）為主要優(yōu)勢(shì)菌綱，占比52.50%；其決為座囊菌綱（Dothideomycetes）（22.50%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）（12.50%）、傘菌綱（Agaricomycetes）（10%）以及占比為2.50%的毛霉綱（Mucoromycetes）。在屬水平，以曲霉屬（Aspergillus）（30%）、鏈格孢屬（Alternaria）（12.50%）為主要優(yōu)勢(shì)屬，隨后是占比均為10%的青霉屬（Penicillium）、籃狀菌屬（Talaromyces）、煙管菌屬（Bjerkandera），枝孢霉屬（Cladosporium）（7.50%）和節(jié)菱孢菌屬

（Arthrinium）（7.50%）較為常見。在種水平上，煙曲霉（Aspergillus fumigatus）（12.50%）、交鏈格孢（Alternaria alternata）（10%）、艾米斯托克藍(lán)狀菌（Talaromyces amestolkiae）（10%）占據(jù)一定優(yōu)勢(shì)。

杜仲種子中分離到內(nèi)生細(xì)菌共142株，隸屬于1門（厚壁菌門（Firmicutes））1綱（芽孢桿菌綱（Bacilli））1目（芽孢桿菌目（Bacillales））5科6屬（含1個(gè)未定屬）11種（含2個(gè)未定種）。6個(gè)屬中，土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus）以47.18%的相對(duì)多度占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，其次為類芽孢桿菌科（ Paenibacillaceae）中一未定屬

（21.83%）、Peribacillus（12.67%）和Cytobacillus（11.27%）。在種水平，森林土壤芽孢桿菌（Solibacillus silvestris）（37.32%）在整個(gè)細(xì)菌菌群中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，類芽孢桿菌科（Paenibacillaceae）中一未定屬（21.83%）、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Cytobacillus firmus）（9.86%）和一種土壤芽孢桿菌（Solibacillus sp.）（9.86%）

次之。此外，Peribacillushuizhouensis（7.04%）和Peribacillussimplex（5.63%）也占據(jù)較高比例。

高通量測(cè)序獲得的杜仲種子微生物群落組成：對(duì)杜仲種子內(nèi)生真菌和細(xì)菌測(cè)序獲得平均有效序列分別為64 368條、40121條，平均長(zhǎng)度為234、376bp。杜仲種子內(nèi)生真菌歸為141個(gè)OTUs，包括6門、15綱、38目、76科、101屬。在門水平，內(nèi)生真菌肅屬于子囊菌門（ Ascomycota）、擔(dān)子菌門、鞭毛菌門（Mortierellomycota） 、羅茲菌門（Rozellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）和未分類真菌6大類，其中，子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為主要優(yōu)勢(shì)門，分別占比47.56%和46.91%；在屬水平，主要包括Apiotrichum、德巴利氏酵母屬15個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，其中Apiotrichum（31.28%）和德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）（26.07%）占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，為主要優(yōu)勢(shì)屬（圖1a）。其余優(yōu)勢(shì)屬如Leucosporidium、Kernia、青霉屬（Penicillium）等總占比為30.04%。常見屬如鏈格孢屬（Alternaria）（0.87%）也占據(jù)較高比例。

杜仲種子內(nèi)生細(xì)菌歸為442個(gè)OTUs，包括24門、46綱、117目、193科、313屬。在門水平，內(nèi)生細(xì)菌隸屬于變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）．放線菌門（Actinobacteriota）和藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）等24大類，其中，優(yōu)勢(shì)門主要為變形菌門（ Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），分別占比52.49%和17.22%；隨后為擬桿菌門（Bacteroidota）（10.72%）、放線菌門（Actinobacteriota）（10.55%）；在綱水平，以Y-變形菌綱（Gammaproteobacteria）（33.68%），（18.81%）為優(yōu)勢(shì)綱；在屬水平，所有類群主要?dú)w為假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、固氮弧菌屬（Azoarcus）等13個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，主要優(yōu)勢(shì)類群為假單胞菌屬（Pseudomonas）（16.66%），其次為乳桿菌屬（Lactobacillus）（9.68%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）（8.22%）（圖1b）。

綜上表明，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，高通量測(cè)序技術(shù)能獲得更多種類和數(shù)量的杜仲種子內(nèi)生真菌和細(xì)菌。

從門水平上分析，2種方法獲得的優(yōu)勢(shì)真菌都主要集中在子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota），但其占比不同；高通量測(cè)序獲得的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要集中在變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），而可培養(yǎng)法主要分離到厚壁菌門（Firmicutes）的細(xì)菌。而從屬水平上分析發(fā)現(xiàn)，高通量獲得的菌株，如優(yōu)勢(shì)真菌青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、枝孢霉屬（Cladosporium）可通過可培養(yǎng)法獲得，并同樣占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位（表1和圖1）。另外，以上結(jié)果還可看出，高通量測(cè)序法獲得的大部分菌株都屬于未被培養(yǎng)的菌株。因此，2種方法的結(jié)合能更加全面的揭示杜仲相關(guān)內(nèi)生菌的組成和結(jié)構(gòu)。

2.2杜仲種子微生物多樣性

在a多樣性指數(shù)中，Margalef指數(shù)、Chao1和ACE指數(shù)表示微生物群落的豐富度，值越大，豐富度越高。Shannon和Simpson指數(shù)表示微生物群落的多樣性程度，Shannon指數(shù)值越大，多樣性越高，而Simpson指數(shù)值越小，多樣性越大。在97%相似性下，分析杜仲種子內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)（表2）。a多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，高通量測(cè)序技術(shù)得到的多樣性指數(shù)Shannon、高通量測(cè)序技術(shù)能更完整的展現(xiàn)出杜仲種子中微生物群落的豐富度和多樣性。

2.3杜仲種子微生物群功能分析

使用FUNGuilds平臺(tái)對(duì)杜仲種子內(nèi)真菌類群的營(yíng)養(yǎng)型和生態(tài)功能類群進(jìn)行分析，其中，110個(gè)OTUs被成功注釋，營(yíng)養(yǎng)型包括腐生型（Saprotroph）（950TUs，82.97%）、致病-腐生-共生型（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）（18 0TUs，6.10%）、致病型（Pathotroph）（12 0TUs，2.41%）、致?。停≒athotroph-Saprotroph）（7 0TUs，6.60%）、腐生-共生型（Saprotroph-Symbiotroph）（6 0TUs，0.63%）、共生型（Symbiotroph）（4 0TUs，0.34%）、致病-共生型（Pathotroph-Symbiotroph）（3 0TUs，0.83%）、致病-腐生-共生型（Pathogen-Saprotroph-Symbiotroph）（1 0TU，0.11%）8大類。除未定類群（unknow），所有真菌類群主要涉及到未定義腐生茵（Undefined Saprotroph）（48 0TUs，33.83%）、植物病原菌（PlantPathogen）（5 0TUs，0.49%）、動(dòng)物病原菌（Animal Pathogen）（5 0TUs，1.28%）、木質(zhì)腐生菌（Wood Saprotroph）（4 0TUs，

0.45%）、真菌寄生菌（Fungal Parasite）（20TUs，0.27%）、糞生真菌（Dung Saprotroph） （2 0TUs，0.21%）、叢枝菌根（Arbuscular Mycorrhizal fungi）（2OTUs，0.06%）、土壤腐生菌（Soil Saprotroph）（1 0TU，31.28%）、地衣（Lichenized fungi）（1 0TU，0.16%）、外生菌根（Ectomycorrhizalfungi）（1 0TU，0.07%）10類生態(tài)功能類群。此外，還包括多種混合功能類群如真菌寄生．未定義腐生菌（Fungal Parasite-UndefinedSaprotroph）（4 0TUs，1.51%）、內(nèi)生菌-地衣腐生菌-土壤腐生菌-未定義腐生菌（ Endophyte-Litter Saprotroph-Soil Saprotroph-UndefinedSaprotroph）（4 0TUs．0.48%）、內(nèi)生菌-植物病原菌（Endophyte-Plant Pathogen）（2 0TUs，0.21%）等21類。31個(gè)OTUs在FUNGuilds數(shù)據(jù)庫中未能注釋到對(duì)應(yīng)功能。整體來看，在OTU水平上杜仲種子內(nèi)的真菌功能群主要集中于未定義腐生菌（48 0TUs）、植物病原菌（5 0TUs）、動(dòng)物病原菌（5 0TUs）（圖2a）。在屬水平，物種豐度占比最高的Apiotrichum（31.28%）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）（26.07%）分別屬于腐生型中的土壤腐生菌和未定義腐生菌。此外，一些常見屬在生態(tài)系統(tǒng)中扮演多重角色，如枝孢霉屬（Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria），既屬于動(dòng)物病原菌，又屬于內(nèi)生菌、植物病原菌、腐生菌。

使用FAPROTAX平臺(tái)對(duì)細(xì)菌功能分類注釋（圖2b），選取總豐度前50的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杜仲種子中的細(xì)菌群落生態(tài)功能歸為化能異氧（chemoheterotrophy）、有氧化能異養(yǎng)（aerobicchemoheterotrophy）、

發(fā)酵（fermentation）、硝酸還原（nitrate reduction）、亞硝酸呼吸（nitrate respiration）、尿素分解（ureolysis）、動(dòng)物寄生生物或共生體（animal parasites orsymbionts）、芳香族化合物降解（aromaticcompound degradation）、固氮作用（nitrogenfixation）、人類病原菌（human pathogens）、植物病原菌（plant pathogen）等44個(gè)功能類群，其中，細(xì)菌功能主要集中于化能異氧（31.96%）、有氧化能異養(yǎng)（23%）、發(fā)酵（8.79%）。部分集中于硝酸還原（4.50%）、亞硝酸呼吸（3.06%）、氮呼吸（3.06%）、尿素分解（2.63%）、動(dòng)物寄生生物或共生體（2.51%）、芳香族化合物降解（1.88%）、固氮作用（1.61%）、人類病原菌（1.38%）、植物病原菌（1.03%）9類。少部分屬于暗氫氧化（dark hydrogen oxidation）（0.95%）、亞硝酸鹽氨化（0.92%）等32個(gè)功能類群，總占比為14.60%。

3討論

種子微生物是定殖于種子和幼苗的第一個(gè)微生物群，這類微生物的組成和垂直傳播對(duì)種子質(zhì)量、植物生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的合成至關(guān)重要。本研究通過對(duì)杜仲種子內(nèi)生真菌和細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，最終獲得真菌共40株，鑒定為3門11屬，主要優(yōu)勢(shì)屬為曲霉屬（30%）、鏈格孢屬（12．50%）；內(nèi)生細(xì)菌共142株，鑒定為1門6屬，以土壤芽孢桿菌屬（47.18%）為主要優(yōu)勢(shì)屬。該結(jié)果與早前研究報(bào)道有相似之處，如鏈格孢屬被證實(shí)是植物種子中最常見的真菌屬。其次，與本課題組前期在杜仲樹皮中分離到的內(nèi)生菌相比，種子中的內(nèi)生菌種類和數(shù)量明顯降低，說明內(nèi)生菌在同種植物不同器官中的分布存在差異。這可能是由于種子是受植物高度保護(hù)的封閉性器官，導(dǎo)致其內(nèi)生菌的種類和數(shù)量比其他器官要少。由于自然環(huán)境中絕大多數(shù)微生物是不能被傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所培養(yǎng)，常規(guī)分離培養(yǎng)方法和較單一培養(yǎng)基分離到的微生物并不能完整地反映杜仲種子中微生物的群落結(jié)構(gòu)，而高通量測(cè)序結(jié)果分析能更全面的展現(xiàn)杜仲種子中微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。因此，本文以高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)杜仲種子內(nèi)生微生物多樣性和功能進(jìn)行補(bǔ)充分析。

功能預(yù)測(cè)注釋到多種有益功能菌群。目前，報(bào)道指出，植物種子的內(nèi)生細(xì)菌主要集中在變形菌門、厚壁菌門和放線菌門；而本研究也發(fā)現(xiàn)，變形菌門和厚壁菌門為杜仲種子中細(xì)菌的主要優(yōu)勢(shì)門。在屬水平，細(xì)菌主要包括假單胞菌屬、乳桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、固氮弧菌屬等13個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，其中，假單胞菌屬（16.66%），乳桿菌屬（9.68%）和鞘氨醇單胞菌屬（8.22%）在整個(gè)細(xì)菌群落中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。相關(guān)研究表明，假單胞菌和鞘氨醇單胞菌作為有益內(nèi)生菌廣泛存在水稻、煙草、丹參等植物種子中，它們可以通過提高植物的固氮能力或啟動(dòng)植物免疫系統(tǒng)、分泌抗生素以及抑制病原菌（與病原體競(jìng)爭(zhēng)資源）來改善植物生產(chǎn)力和健康。如Pham等發(fā)現(xiàn)，固氮菌（Pseudomonasstutzeri）A15在溫室條件下能顯著促進(jìn)水稻幼苗的生長(zhǎng)，且該菌株的固氮效果優(yōu)于普通化學(xué)氮肥。綠蚜假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）和Pseudomonas aurantiaca可以通過產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長(zhǎng)。沈興亮等證實(shí)，Pseudomonasfluorescens能顯著提高茶樹的生長(zhǎng)生理水平。Sphingomonas sp. cra20也被證明在干旱脅迫下能促進(jìn)擬南芥根系的發(fā)育，并改變根際微生物群落結(jié)構(gòu)。同時(shí)，Matsumoto等研究發(fā)現(xiàn)，Sphingomonasmelonis能在抗病水稻種子中積累、代代相傳，并通過產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸（anthran．lic acid）使高感病品種產(chǎn)生抗病性。李曉君等報(bào)道，來自丹參根中的Pseudomonas sp.具有抗氧化和抗菌活性的作用。此外，生態(tài)功能注釋結(jié)果也顯示杜仲種子中的細(xì)菌功能大多集于潛在化能異氧、有氧化能異養(yǎng)、硝酸還原、氮呼吸、固氮作用?？傊?，杜仲種子中存在的多種潛在有益細(xì)菌在調(diào)節(jié)氮循環(huán)和對(duì)抗病原體中可能發(fā)揮一定的重要性作用。

在真菌中子囊菌門和擔(dān)子菌門為主要優(yōu)勢(shì)門，其中，Apiotrichum（31.28%）和德巴利氏酵母屬（26.07%）為主要優(yōu)勢(shì)屬。近期研究發(fā)現(xiàn)，Apiotrichum中的某些物種被認(rèn)為能產(chǎn)生油脂類的次級(jí)代謝物，這可能與杜仲種子中富含大量的油脂類物質(zhì)相關(guān)。如Apiotrichum porosum DSM27194被證實(shí)不僅能同化乙酸、丙酸、丁酸及其不同混合物以積累微生物油脂，還具有將木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的多種碳源轉(zhuǎn)化為微生物油脂的能力。而德巴利氏酵母屬對(duì)灰霉病、炭疽病具有明顯的抑制作用。此外，生態(tài)功能注釋結(jié)果表明，在杜仲種子中多數(shù)真菌都屬于腐生型真菌（95 0TUs，82.97%），這些真菌被認(rèn)為具有降解木質(zhì)素、纖維素的能力，其可能參與凋落物的分解，幫助宿主吸收有機(jī)物和礦物質(zhì)元素。凋落物的分解是森林生態(tài)系統(tǒng)化學(xué)循環(huán)的主要環(huán)節(jié)之一，對(duì)群落組成及分布具有重要作用。另外，部分真菌還被注釋為內(nèi)生真菌、外生菌根真菌和叢枝菌根真菌，這些類群有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，可促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)、土壤養(yǎng)分吸收與利用、改善土壤環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)。如球囊菌門作為一類的重要的真菌門類，其成員包括一些分布廣泛、具有重要生態(tài)意義的真菌群一叢枝菌根真菌（AMF）。該類真菌不僅能改善磷營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)非生物和生物脅迫的耐受性，還能通過菌絲網(wǎng)絡(luò)和產(chǎn)生如球囊霉素等土壤顆粒結(jié)合物質(zhì)并維持土壤的物理性質(zhì)，在土壤聚集中發(fā)揮重要作用。因此，該類微生物可為種子在自然環(huán)境中的萌發(fā)提供各種有利條件。然而，除了注釋到的大量有益功能菌群，還有相當(dāng)部分OTU被檢測(cè)為植物病原菌。如鏈格孢屬是多種植物病原菌，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱這類真菌是引起小麥黑斑病、刺梨葉斑病的重要致病菌。因此，揭示種子相關(guān)微生物組成和功能是了解種子健康以及后續(xù)人為調(diào)整微生物菌群增強(qiáng)植物健康、提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量的先決條件。

4結(jié)論

本研究結(jié)果證實(shí)了杜仲種子中存在多種內(nèi)生細(xì)菌和真菌，且功能注釋表明杜仲種子中攜帶多種有益功能菌和潛在致病菌。本研究不僅分離到節(jié)菱孢菌屬（引起大麥立枯?。?、鏈格孢屬和黑團(tuán)孢屬（引起刺梨葉斑病）等多種已被報(bào)道的植物病原菌，同時(shí)還獲得多株可能對(duì)植物生長(zhǎng)及生防具有潛在作用的內(nèi)生菌（如青霉屬、曲霉屬、枝孢霉屬和芽孢桿菌屬）。但這類微生物是否對(duì)杜仲植物生長(zhǎng)及藥理活性成分的合成產(chǎn)生積極影響，還有待進(jìn)一步研究。此外，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)還可以幫助我們通過確定優(yōu)勢(shì)目標(biāo)菌株，然后針對(duì)目標(biāo)菌株的特性選擇更為合適的培養(yǎng)基，從而最大限度地獲取更多的內(nèi)生菌。因此，本研究結(jié)果將為今后杜仲種子內(nèi)生菌的功能研究、杜仲的高效栽培以及生物防治提供參考信息。