馬尾松次生維管組織的變化特征

楊超 范付華 徐剛

關(guān)鍵詞：馬尾松；次生維管組織；結(jié)構(gòu)變化；組織化學(xué)分析

植物的生長和形態(tài)具備很強的可塑性，在其生長過程中會形成新的組織，以應(yīng)對季節(jié)和環(huán)境的變化。次生維管束是多年生木本植物周期性活動的產(chǎn)物，由維管形成層不斷分裂分化形成，其活性隨季節(jié)更替而變化。次生維管組織承擔(dān)了樹木體內(nèi)物質(zhì)長距離輸導(dǎo)的功能，內(nèi)含2條主要的長距離輸導(dǎo)路徑：第一條為木質(zhì)部，將根系吸收的水分和養(yǎng)分輸送到葉片，用于維持蒸騰和光合作用；第二條為韌皮部，將呼吸和生長所需的信號分子和光合產(chǎn)物輸送到發(fā)育組織和貯藏組織。

溫帶樹木的維管組織在春季復(fù)蘇，冬季休眠。維管組織在不同時期的形態(tài)及生理特性不同。白楊（Populus tomenosa Carr.）活躍期的維管形成層細(xì)胞壁中含有較高的甲酯化果膠和較低的酸性果膠，休眠期的維管形成層細(xì)胞壁具有較高的酸性果膠，形成層活躍期與休眠期的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)也存在很大差異。新生管胞從維管形成層產(chǎn)生后經(jīng)體積增大，細(xì)胞壁加厚，最終發(fā)育為成熟管胞。受維管形成層形態(tài)和季節(jié)的影響，不同時期形成的成熟管胞形態(tài)特征如直徑、長度及細(xì)胞壁厚度等存在明顯差異。管胞形態(tài)的差異直接影響了管胞的輸導(dǎo)能力，如冷杉（Abies fabri（Mast.）Craib）的早材輸導(dǎo)率約為晚材的11倍，超過90%的輸導(dǎo)量來自于早材。同時，樹木韌皮部與木質(zhì)部的內(nèi)含物及組成成分，如韌皮部的內(nèi)含多糖顆粒數(shù)量、木質(zhì)部纖維素、木質(zhì)素、脂類提取物和碳水化合物等，其分布與含量在不同組織和活動期也有顯著差異。如云杉（Picea asperata Mast.）的心材比邊材含有更多的木質(zhì)素和更少的纖維素，晚材的半乳糖、葡聚糖和甘露聚糖含量明顯高于早材，晚材的果膠含量與親脂性萃取物較早材更少。輻射松（Pir7US radiataD．Don）心材內(nèi)晚材比早材含有更多的提取物，樹脂酸含量也更高。杉木（Cunninghamia lanceolata （Lamb.） Hook.）代謝產(chǎn)物在復(fù)蘇前后不同，丙酮酸和抗壞血酸含量在復(fù)蘇后增加，并且杉木的早材與晚材的果膠多糖、木聚糖、纖維素和木質(zhì)素含量差異明顯。

馬尾松（P．massoniana Lamb.）是一種喜光、不耐蔭的速生樹種，廣泛分布于我國南方，是南方面積最大、儲量最多的針葉樹種之一。目前，有關(guān)于馬尾松維管組織的發(fā)育研究鮮有報道，細(xì)胞發(fā)育觀察也多為馬尾松產(chǎn)脂結(jié)構(gòu)的發(fā)育研究，而馬尾松次生維管束發(fā)育、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分變化仍有待研究。次生維管組織是樹木的主體，承擔(dān)了物質(zhì)的遠距離輸導(dǎo)與機械支撐功能。研究維管組織有利于深入揭示樹木的次生發(fā)育過程。本文通過組織化學(xué)分析和細(xì)胞離析等手段，研究馬尾松縱向輸導(dǎo)組織在不同組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及成分變化，旨在揭示維管組織發(fā)育過程中細(xì)胞的變化特征，為其他樹種的維管組織細(xì)胞發(fā)育研究提供借鑒與參考。

1材料與方法

1.1材料采集

采集地位于貴州省花溪區(qū)（106°39'N，26°26' E），為20世紀(jì)80年代飛播造林形成的馬尾松林。該區(qū)為亞熱帶高原季風(fēng)濕潤氣候，溫潤多雨，年均氣溫15.3℃，土壤以石灰土為主，為喀斯特地貌區(qū)。在林內(nèi)選取5顆胸徑30cm以上，健康的馬尾松成年樹，于2022年6月，用鑿子于馬尾松莖干1.2～1.5m處取馬尾松木質(zhì)部與韌皮部材料，取樣大小為2cm×2cm×1cm，將其裁成0.5cm×2cm×1cm后放入FAA固定保存，固定時間在3d以上，用于韌皮部與木質(zhì)部的細(xì)胞離析。用生長錐于莖干1.2～1.5m處鉆取木芯，要求韌皮部、形成層與木質(zhì)部連接完整，隨后放人FAA固定保存，固定時間在3d以上，用于木質(zhì)部細(xì)胞離析。

1.2石蠟切片觀察

將所采集木芯樣本分2組，各5個樣本，第一組將修樣后長度保留0.5～1cm，要求包含完整維管形成層及木質(zhì)部；第二組修樣后保留2021年與2022年完整木質(zhì)部。將修樣后的試驗材料經(jīng)軟化，70%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸蠟，包埋后于石蠟切片機（Leica RM2235）切片，切片厚度12um，經(jīng)展片，粘片后放人烘箱中40℃烘干備用。切片以番紅固綠染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，LASX成像系統(tǒng)拍照。第二組樣本中每個樣本各選取3列包含完整2021年管胞的細(xì)胞列，以ImageJ統(tǒng)計2021年的馬尾松木質(zhì)部管胞的弦向壁厚度、徑向壁厚度、弦向腔徑（弦向細(xì)胞腔直徑）、徑向腔徑（徑向細(xì)胞腔直徑）、弦向胞徑（弦向細(xì)胞直徑）和徑向胞徑（徑向細(xì)胞直徑）。同一樣本中不同細(xì)胞列的細(xì)胞層數(shù)會存在較小差異，導(dǎo)致不同重復(fù)的數(shù)據(jù)量不同。為便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以細(xì)胞層數(shù)最少的細(xì)胞列為標(biāo)準(zhǔn)，將長細(xì)胞列多余數(shù)據(jù)分別在早晚材細(xì)胞列的中值周圍隨機剔除，并求取均值。

1.3細(xì)胞離析觀察

將裁好的韌皮部材料從固定液中取出，切除周皮。切片觀察結(jié)果顯示，不具輸導(dǎo)功能韌皮部約與木質(zhì)部相距400～500um，因此，在距木質(zhì)部約500um的厚度處將韌皮部切成2塊，以富蘭克林離析法分別對2塊材料進行離析，分別得到2個區(qū)域的篩胞。根據(jù)木質(zhì)部的年輪，將木質(zhì)部的早材和晚材分開，將早晚材轉(zhuǎn)換期管胞刮除干凈，每個樣本分別切取一部分進行混合離析，得到混合樣本的早材管胞和晚材管胞。顯微鏡觀察，DS-Fil成像系統(tǒng)拍照，從離析的早材和晚材管胞中隨機選取25個管胞以Image J分別統(tǒng)計管胞上具緣紋孔的紋孔口直徑與紋孔緣直徑。

1.4組織化學(xué)分析

2組切片經(jīng)二甲苯脫蠟，無水乙醇浸泡3min， 95%乙醇浸泡3min后，放人間苯三酚染液中浸染3min，將濃鹽酸滴于切片上，可見木質(zhì)素的顯色反應(yīng)，同時依據(jù)酚類物質(zhì)的自發(fā)熒光現(xiàn)象，結(jié)合熒光顯微鏡（LEICA DM3000）觀察，DS-Fil成像系統(tǒng)拍照。纖維素檢測選用鈣熒光白（CFW）熒光染色試劑盒（GENMED GMS 16034.1），吸取5UL GENMED染色液至離心管中，加入95UL蒸鎦水將其稀釋20倍后得到制備的染色液。將包含早晚材與維管形成層的切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇逐級復(fù)水后直接將染色液于暗環(huán)境下滴于切片上，室溫下靜置5min后以移液槍將染色液吸出，隨后吸取GENMED清理液（Reagent A）滴于切片上，用移液槍反復(fù)吸取混勻，5min后吸出，重復(fù)2次。最后直接置于熒光顯微鏡（LEICA DM3000）下觀察。以DS-Fil成像系統(tǒng)拍照，ImageJ量化第二組5張切片在早晚材相接處木質(zhì)素與纖維素的組織化學(xué)顯色和熒光面積。

1.5數(shù)據(jù)處理

使用excel、SPSS和Origin 2022進行數(shù)據(jù)處理。依據(jù)數(shù)據(jù)的分布圖像，判斷管胞層與管胞各系數(shù)間為非線性關(guān)系，選用非線性模型進行擬合。通過對比origin非線性擬合函數(shù)，最后選取了擬合效果較好的Gaussmod函數(shù)對不同管胞層的細(xì)胞壁厚度、細(xì)胞直徑與細(xì)胞腔徑進行擬合。GaussMod函數(shù)：

2結(jié)果與分析

2.1馬尾松次生韌皮部的變化特征

馬尾松次生韌皮部主要由篩胞、韌皮薄壁細(xì)胞和韌皮射線組成（圖1a）。次生韌皮部在發(fā)育過程中薄壁組織增大，篩胞會被擠壓變形，失去輸導(dǎo)功能（圖1a）。木質(zhì)素組織化學(xué)和自發(fā)熒光觀察結(jié)果顯示，不具輸導(dǎo)功能韌皮部出現(xiàn)明顯的顯色反應(yīng)（圖1b），具輸導(dǎo)功能韌皮部與不具輸導(dǎo)功能韌皮部出現(xiàn)明顯的自發(fā)熒光差異（圖1c），說明篩胞由具輸導(dǎo)功能韌皮部向不具輸導(dǎo)功能韌皮部發(fā)育的過程中細(xì)胞壁發(fā)生了木質(zhì)素沉積。為觀察篩胞的結(jié)構(gòu)及不具輸導(dǎo)功能韌皮部內(nèi)篩胞的形變情況，分別離析得到具輸導(dǎo)功能韌皮部和不具輸導(dǎo)功能韌皮部的完整篩胞，發(fā)現(xiàn)馬尾松篩胞壁上具篩域，篩域內(nèi)具篩孔，篩胞由中間向兩端漸細(xì)（圖1d），不具輸導(dǎo)功能韌皮部內(nèi)的篩胞形變嚴(yán)重，胞腔變小，長度低于未形變的篩胞（圖1e）。

2.2木質(zhì)部管胞的形態(tài)變化

依據(jù)細(xì)胞形態(tài)將木質(zhì)部劃分為早材和晚材，早材和晚材間會出現(xiàn)一段管胞壁逐漸增厚，胞腔逐漸縮小的轉(zhuǎn)換期（圖2a），不同樣本的管胞壁厚測量結(jié)果表明，早材的弦向壁厚及縱向壁厚大部分小于4um，而與早材相鄰的晚材管胞壁厚大部分大于4um，因此，以4um為標(biāo)準(zhǔn)劃分早材和晚材。

不同樣本的管胞壁厚度、細(xì)胞層數(shù)和早晚材細(xì)胞比例均有差異。管胞弦向壁厚和徑向壁厚隨管胞層數(shù)增加均表現(xiàn)為先增加后降低的變化規(guī)律（圖2b）。早材管胞的弦向壁厚度與徑向壁厚度相近，管胞徑向壁在早晚材轉(zhuǎn)換期的曲線斜率與峰值相較于弦向壁更高；到發(fā)育后期，弦向壁厚度會逐漸回落至略高于早材的壁厚水平，徑向壁厚雖有下降，但仍保持在遠高于早材管胞壁厚的水平。

不同樣本整合散點圖（圖2c）表明：馬尾松早材主要分布于25層管胞之前，早材管胞壁厚度主要分布于1.5～3um，晚材的管胞層數(shù)總體明顯高于早材管胞層數(shù)，說明成熟林1a內(nèi)的晚材管胞形成量高于早材管胞形成量。

不同樣本的管胞直徑數(shù)值存在較大差異，但總體變化趨勢相似。管胞腔徑與胞徑的擬合曲線一致（圖3）表明：腔徑（d）與胞徑（D）隨管胞的發(fā)育總體呈逐漸降低的趨勢；在管胞的發(fā)育初期，腔徑與胞徑的長度表現(xiàn)為D徑>D弦，d輕>d弦，胞徑和腔徑變化的擬合曲線斜率相對平穩(wěn)；當(dāng)木質(zhì)部發(fā)育進入早晚材的轉(zhuǎn)換期，胞徑與腔徑擬合曲線斜率降低，其中，kD弦>kD徑，kD弦>kd弦，kd弦>kd徑，徑向胞徑和徑向腔徑在轉(zhuǎn)換期間逐漸低于弦向胞徑和弦向腔徑；當(dāng)木質(zhì)部發(fā)育進入晚材期，擬合曲線的斜率再次回升至較平穩(wěn)的狀態(tài)，腔徑與胞徑的長度表現(xiàn)為D弦>D徑，d弦>d輕。木質(zhì)部1a內(nèi)早晚材的弦向胞徑變化較小，變化曲線的斜率相對平穩(wěn)；而早晚材的弦向腔徑、徑向胞徑和徑向腔徑的變化較大。

2.3早晚材的紋孔變化

木質(zhì)部細(xì)胞離析觀察到馬尾松管胞有交叉紋孔場與具緣紋孔（圖4a、b）。在管胞的端部（圖4a）和近端部（圖4b）有大量具緣紋孔，紋孔數(shù)量從管胞兩端至管胞中段逐漸減少，管胞中段幾乎見不到具緣紋孔分布（圖4c）。

對木質(zhì)部的早材和晚材分別進行了細(xì)胞離析，分別得到早材和晚材的管胞（圖4d～1）。通過對比觀察可知，早材管胞壁上附著的具緣紋孔數(shù)量明顯多于晚材部分，早材和晚材的紋孔大小也不同。比較分析（圖4m）可知：早材紋孔口與早材紋孔緣的直徑顯著大于晚材部分，表明木質(zhì)部由早材發(fā)育至晚材的過程中，管胞紋孔數(shù)量減少，紋孔口直徑和紋孔緣直徑也降低。

2.4木質(zhì)素和纖維素的組織化學(xué)定位

以間苯三酚對發(fā)育期的木質(zhì)部進行木質(zhì)素組織化學(xué)定位，可將木質(zhì)部發(fā)育期的管胞劃分為3個時期，分別為徑向伸展期、次生壁增厚期和成熟期（圖5a）。管胞由維管形成層分化產(chǎn)生后進人徑向伸展期，初生壁發(fā)育，胞徑和胞腔持續(xù)增大。當(dāng)徑向伸展期結(jié)束后初生壁停止發(fā)育，隨后管胞進人次生壁增厚期，管胞次生壁持續(xù)增厚，次生壁沉積的木質(zhì)素增多；此后，管胞次生壁停止發(fā)育，進入成熟期，發(fā)育為成熟管胞。早晚材的木質(zhì)素組織化學(xué)定位顯示（圖5b），晚材管胞的次生壁厚明顯高于早材，而晚材管胞的直徑明顯小于早材，晚材木質(zhì)素的分布明顯多于早材。

鈣熒光白染色后的熒光結(jié)果（圖5c、d）顯示：維管形成層的熒光強度低于新生韌皮部與新生木質(zhì)部，這表明維管形成層產(chǎn)生新生細(xì)胞后經(jīng)纖維素的富集形成新的管胞與篩胞。木質(zhì)部的熒光主要集中在新生管胞，韌皮部的熒光主要集中在具輸導(dǎo)功能區(qū)域，這是由于管胞與篩胞發(fā)生木質(zhì)素沉積后使纖維素的成分占比下降，導(dǎo)致熒光強度降低。早晚材交界處的鈣熒光白顯色結(jié)果（圖5e）表明：早材熒光顯色較晚材更明顯；Image J量化分析結(jié)果（圖5f～h）表明：晚材木質(zhì)素顯色面積占比和單位細(xì)胞顯色面積均顯著高于早材，表明晚材木質(zhì)素沉積程度高于早材，而早材纖維素的單位細(xì)胞熒光面積和纖維素?zé)晒饷娣e與管胞壁面積的比值極顯著高于晚材，表明早材纖維素含量占比高于晚材。

3討論

樹木維管組織的季節(jié)性發(fā)育伴隨著輸導(dǎo)功能與機械功能的強弱變化。在韌皮部的研究中，常以篩胞形態(tài)變化劃分具輸導(dǎo)功能韌皮部和不具輸導(dǎo)功能韌皮部。本文除觀察篩胞形變特征外，還發(fā)現(xiàn)馬尾松篩胞發(fā)育過程中會發(fā)生木質(zhì)素沉積，纖維素占比下降。木質(zhì)素沉積可增強細(xì)胞壁的機械強度，篩胞失去輸導(dǎo)能力后機械強度增加，有利于保護韌皮薄壁組織，增加不具輸導(dǎo)功能韌皮部的穩(wěn)定性。

細(xì)胞次生壁不僅能增強植物體機械強度，在植物生長、胞間通訊、水分運輸和機體防御等方面也發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，管胞弦向壁與徑向壁厚度隨管胞層數(shù)增加表現(xiàn)為先大幅上升，后小幅下降的變化趨勢，表明早材向晚材變化過程中木質(zhì)部的機械強度上升。同時，管胞過度加固會降低彈性模量，使水力輸導(dǎo)效率下降。管胞徑向壁厚度在晚材階段顯著大于弦向壁，而弦向壁厚度在晚材末期會降低至近似于早材的水平。由于相鄰管胞的紋孔成對存在，相對而生，共同構(gòu)成紋孔對，晚材末期形成管胞的弦向壁厚度可能會盡量與早材相近，以形成相近的紋孔結(jié)構(gòu)。裸子植物管胞直徑與腔徑?jīng)Q定了管胞的輸導(dǎo)能力。管胞的胞徑隨管胞層數(shù)變化遞減，導(dǎo)致胞腔逐漸減小，表明管胞的胞內(nèi)輸導(dǎo)能力逐漸降低。

具緣紋孔是管胞間物質(zhì)輸導(dǎo)的通道，具緣紋孔直徑越大，紋孔導(dǎo)度越大。本文發(fā)現(xiàn)，早材的紋孔數(shù)量明顯多于晚材，早材紋孔緣和紋孔口直徑也顯著大于晚材部分，表明早材的胞間輸導(dǎo)能力顯著高于晚材。

木質(zhì)部的徑向伸展期、次生壁增厚期和成熟期是木質(zhì)部研究中常用的劃分方式。本文發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)部的徑向伸展期發(fā)生纖維素富集，隨后在次生壁增厚期逐漸沉積木質(zhì)素，并且纖維素占比下降。同時，組織染色表明，晚材木質(zhì)素沉積程度顯著高于早材，纖維素的成分占比下降。Guo對油松木質(zhì)部內(nèi)木質(zhì)素含量變化的監(jiān)測結(jié)果也表明，由形成早材的活躍期向晚材為主的休眠期轉(zhuǎn)變的過程中，木質(zhì)素含量持續(xù)升高。木質(zhì)素含量提高還可增強樹體的抗逆性，表明管胞由早材向晚材的發(fā)育過程是次生木質(zhì)部為了適應(yīng)季節(jié)變化，抗逆性增強的體現(xiàn)。

為了揭示馬尾松次生維管組織的變化特征，本課題組繪制了馬尾松次生維管組織的變化示意圖（圖6）。維管形成層分化形成新生韌皮部和木質(zhì)部時會逐漸富集纖維素。木質(zhì)部管胞發(fā)育主要表現(xiàn)為以下幾個特征：（1）紋孔直徑降低和紋孔數(shù)量下降；（2）次生壁木質(zhì)素含量增加；（3）管胞面積下降，主要通過降低細(xì)胞徑向直徑實現(xiàn)；（4）纖維素含量占比下降；（5）弦向壁和徑向壁增厚，但在晚材末期為適應(yīng)來年早材的紋孔結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁厚度會降低至早材水平。韌皮部的發(fā)育特征則表現(xiàn)為：（1）篩胞形變；（2）篩胞木質(zhì)化；（3）纖維素含量占比下降。

4結(jié)論

馬尾松維管組織在其發(fā)育過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)、成分和功能均會發(fā)生規(guī)律性變化。維管形成層分化形成新生韌皮部和木質(zhì)部時會逐漸富集纖維素。木質(zhì)部管胞由早材向晚材發(fā)育的過程中，其紋孔直徑降低，紋孔數(shù)量下降，次生壁木質(zhì)化程度增加，胞腔面積下降，纖維素含量占比下降，弦向壁及徑向壁增厚，表明其胞間及胞內(nèi)的輸導(dǎo)能力逐漸下降，機械強度上升，但在晚材的末期為適應(yīng)來年早材的紋孔結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁厚度會降低至早材水平。韌皮部的發(fā)育則表現(xiàn)為篩胞的形變、木質(zhì)化與纖維素含量占比下降，表明其輸導(dǎo)功能喪失和機械強度上升。