秋茄低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組分析及脫落酸信號(hào)途徑基因挖掘

郭晉敏 楊升 劉星 王金旺 王文卿 陳秋夏

關(guān)鍵詞：秋茄；低溫脅迫；轉(zhuǎn)錄組；轉(zhuǎn)錄因子；脫落酸信號(hào)途徑

紅樹(shù)林是分布于熱帶亞熱帶沿海潮間帶的特有植物群落。秋茄（Kandelia obovata Sheue，H．Y．Liu&J．Yong）是最耐寒的紅樹(shù)植物。它自然分布于越南的北部，中國(guó)的海南、香港、廣東、福建、臺(tái)灣，日本的南部，人工引種最北到中國(guó)浙江省溫州市西門(mén)島一帶。低溫是限制秋茄分布的最主要因素。在全球氣候變暖的大背景下，高緯度地區(qū)冬季逐漸變暖，這使得冷敏感植物跨出之前的分布范圍向北移動(dòng)。與此同時(shí)，高緯度地區(qū)冬季不時(shí)發(fā)生的極端低溫天氣對(duì)北移的冷敏感植物生存造成極大危害，如2008年和2016年中國(guó)南方發(fā)生的多起極端寒潮事件對(duì)當(dāng)?shù)丶t樹(shù)林造成了嚴(yán)重影響，更有甚者如2016年溫州西門(mén)島一帶發(fā)生50年一遇的極端低溫寒潮（-5℃左右）對(duì)當(dāng)?shù)匾N的秋茄造成了極其嚴(yán)重的凍害。因此，秋茄的抗寒研究極其緊迫和重要。

轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物響應(yīng)低溫脅迫的關(guān)鍵部分，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)識(shí)別下游基因啟動(dòng)子上的功能元件來(lái)激活或者抑制目標(biāo)基因表達(dá)，引起植株體內(nèi)低溫相關(guān)代謝途徑產(chǎn)生變化，從而改變植物對(duì)于外界低溫脅迫刺激的適應(yīng)能力。目前，在80多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族中，只有NAC、MYB、WRKY、bZIP和ERF等少數(shù)在非生物脅迫響應(yīng)中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子家族被深入研究過(guò)。Sharma等研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫條件下，擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）中有43個(gè)家族轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，其中，WRKY、NAC、MYB、AP2/ERF和bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因在所有基因集中高度富集，調(diào)控了56%冷脅迫下常見(jiàn)的表達(dá)基因。在秋茄響應(yīng)低溫脅迫的相關(guān)研究中，F(xiàn)ei等和Su等將bHLH、MYB-related和WRKY等轉(zhuǎn)錄因子認(rèn)定為秋茄低溫應(yīng)激反應(yīng)中有價(jià)值的候選調(diào)節(jié)因子，而其他轉(zhuǎn)錄因子在秋茄抗寒的相關(guān)研究中鮮有報(bào)道。

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一類(lèi)對(duì)植物生長(zhǎng)、果實(shí)成熟和非生物脅迫響應(yīng)起至關(guān)重要作用的植物激素，自20世紀(jì)60年代首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，ABA信號(hào)通路響應(yīng)低溫脅迫的相關(guān)研究獲得了重大突破。植物遭遇低溫脅迫時(shí)，ABA與ABA受體蛋白（pyrabactin resistance/PYR-like/regulatory component of ABA receptor，PYR/PYL/RGAR）結(jié)合，形成的復(fù)合體會(huì)抑制2C型蛋白磷酸酶（type 2C protein phosphatases，PP2Cs）的活性，導(dǎo)致類(lèi)SNF-1相關(guān)蛋白激酶2（class SNF-1-relatedproteinkinase

2，SnRK2/SRK2）的激活和釋放，該蛋白直接磷酸化并積極控制ABF/AREB轉(zhuǎn)錄因子，最終調(diào)控相關(guān)抗寒基因的表達(dá)。ABA信號(hào)途徑響應(yīng)低溫脅迫已在水稻（Oryza sativaL）、蘋(píng)果（Maluspumila Mill.）、花椒（Zanthoxylumbungeanum Maxim）等多種植物中得到證實(shí)，而在秋茄抗寒的相關(guān)研究中少有報(bào)道。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)低溫脅迫下秋茄葉片進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并對(duì)ABA信號(hào)途徑中關(guān)鍵基因進(jìn)行挖掘，旨在為深入了解秋茄響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制提供了科學(xué)參考，為抗寒品種的培育提供了可能。

1材料與方法

1.1材料

以浙江省亞熱帶作物研究所選育的耐寒紅樹(shù)植物‘龍港秋茄1年生容器苗為植物材料，挑選生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)勢(shì)一致，無(wú)病害植株作為供試材料（圖1）。試驗(yàn)于2020年12月在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所內(nèi)進(jìn)行，將供試材料置于人工氣候室（型號(hào)：SAFE-DG-ZJNKY-6）中，光照時(shí)間為11h.d-1，15℃處理12h為對(duì)照組（CK），-5℃處理12h為低溫組（LT），各處理設(shè)置4次生物學(xué)重復(fù)。各處理結(jié)束后采集完全展開(kāi)的功能葉片用錫箔紙包裹并編號(hào)（CK組編號(hào)為：CK-1、CK-2、CK-3和CK-4；LT組編號(hào)為：LT-1、LT-2、LT-3和LT-4），將包裹好的葉片迅速置于液氮中速凍，最后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)?份樣品（CK-1、CK-2、CK-3、CK-4、LT-1、LT-2、LT-3和LT-4）委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行樣品RNA的提取、質(zhì)控、建庫(kù)及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，用llluminaNovaseq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2數(shù)據(jù)分析將測(cè)序所獲得的clean reads與秋茄參考基因組（https：//bigd.big.ac.cn/gwh/Ass-embly/990/show）進(jìn)行比對(duì)并統(tǒng)計(jì)比對(duì)率，比對(duì)分析軟件為HISAT。

FPKM（fragments per kilobase million）即每100萬(wàn)條序列中，每個(gè)基因以1000個(gè)堿基為單位，比對(duì)上的reads。以FPKM值計(jì)算基因表達(dá)量，計(jì)算軟件為RSEM。

基于表達(dá)量定量結(jié)果進(jìn)行組間差異基因分析，獲得2組間發(fā)生差異表達(dá)的基因，差異分析軟件為DESeq2，篩選閾值為llog2FCI≥1和padjust<0.05。同時(shí)利用美吉生物云平臺(tái)（https：//cloud.majorbio.com）對(duì)篩選得到的DEGs進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析。

1.2.3qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性，本研究選擇了6個(gè)KoHB-others和5個(gè)ABA信號(hào)途徑DEGs進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR）驗(yàn)證。利用primer 5.0軟件對(duì)所挑選基因進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，內(nèi)參基因?yàn)橐锛皟?nèi)參序列見(jiàn)表1，以法計(jì)算DEGs的相對(duì)表達(dá)水平。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

對(duì)秋茄葉片樣品進(jìn)行RNA提取后，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得樣品原始數(shù)據(jù)。通過(guò)排除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和序列拼接，獲得了48669538～61694828的Cleanreads（即質(zhì)控后測(cè)序數(shù)據(jù)的總條目數(shù)），錯(cuò)誤率僅為0.02%左右，Q20均高于98.14%，Q30均高于94.41%，GC含量在45.11%～45.60%（表2）。同日寸，樣品主成分分析結(jié)果（圖2）表明：CK組與LT組各處理分別聚為一類(lèi)，說(shuō)明樣品間的生物學(xué)重復(fù)性較好。因此，本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較理想，后續(xù)的分析較可信。

2.2與參考基因組對(duì)比

本研究參考基因?yàn)镵andelia obovata（https：//bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/990/show）．所參考基因組版本為k001。通過(guò)將質(zhì)控后的cleandata與參考基因組進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的測(cè)序序列的比對(duì)率均高于96%（表3），包括總比對(duì)（能定位到基因組上的clean reads數(shù)目）、多方比對(duì)（在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的cleanreads數(shù)目）和唯一比對(duì)（在參考序列上有唯一比對(duì)位置的Clean reads數(shù)目）。

2.3轉(zhuǎn)錄因子分析

本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共鑒定到148個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分屬于25個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，其中，ERF、NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP、HB-other和MYB-related等轉(zhuǎn)錄因子家族所包含的基因數(shù)目較多，分別占11.49%、9.46%、8.11%、8.11%、6.76%、6.08%、4.05%和4.05%（表4）。其中，HB-other家族轉(zhuǎn)錄因子包含6個(gè)DEGs，KoHB-otherl（Maker00002036）、KoHB-other2（Maker00003789）和KoHB-other3（Maker00008096）下調(diào)表達(dá)，KoHB-other4（Maker00014773）、KoHB-other5（Maker00016058）和KoHB-other6（Maker00017922）上調(diào)表達(dá)（圖3）。

2.4差異表達(dá)基因鑒定

以P<0.05、上下調(diào)差異倍數(shù)FC>2或者FC<0.5為篩選條件，進(jìn)一步對(duì)DEGs數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明，LT組和CK組的DEGs共有1330個(gè)，其中，698個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)（52.48%），632個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)（47.52%）（圖4）。

2.5差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

從基因數(shù)量上看，DEGs主要富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成、植物與病原體互作、淀粉與蔗糖代謝、MAPK信號(hào)通路．植物、半乳糖代謝、光合作用·天線蛋白和a一亞麻酸代謝等通路中（表5）。以P值作為參考，DEGs則顯著富集在苯丙素的生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用·天線蛋白、半乳糖代謝、角質(zhì)、亞伯堿和蠟的生物合成和a-亞麻酸代謝等通路中（表6）。綜合基因數(shù)量和P值看，低溫脅迫下秋茄葉片DEGs顯著富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成、半乳糖代謝、光合作用．天線蛋白和a-亞麻酸代謝這5條KEGG通路上，其中，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中富集到的DEGs數(shù)量最多，且差異顯著性最高。

2.6脫落酸信號(hào)途徑相關(guān)基因挖掘

ABA信號(hào)途徑是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一條重要激素途徑，對(duì)該途徑中的DEGs進(jìn)行深入挖掘發(fā)現(xiàn)，KoPYL1（Maker00013579）、KoABF1（Maker00005324）和KoABF2 （Maker00011633）基因上調(diào)表達(dá)，KoPP2C1（Maker00008505）和（Maker00004855）基因下調(diào)表達(dá)（圖5）。

2.7qRT-PCR驗(yàn)證

對(duì)重點(diǎn)關(guān)注的6個(gè)KoHB-others和5個(gè)脫落酸信號(hào)途徑DEGs進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明這11個(gè)基因的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致（圖6），表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

3討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)對(duì)基因挖掘具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏性，被廣泛用于擬南芥、油菜（Brassica rapa L）、新疆野蘋(píng)果（Malussieversii （Ledeb.） Roem.）等多種植物耐寒基因的研究中，使植物抗寒分子機(jī)制被不斷地深入發(fā)掘。本研究中，各樣品Q(chēng)20堿基百分比均大于98%，且Q30堿基百分比均大于94%，GC含量介于45%～46%，測(cè)序序列與參考基因組的比對(duì)率均高于96%。此外，qRT-PCR結(jié)果顯示，所挑選DEGs的變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致。因此，本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果良好，可滿(mǎn)足后續(xù)分析需求。

轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子中的特定順式作用元件結(jié)合，成為植物抗非生物脅迫的主要中介因子，從而使植物能夠抵御不利的環(huán)境條件。ERF、NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP和MYB-related等家族轉(zhuǎn)錄因子參與了多種植物的非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程，在對(duì)擬南芥、沙冬青（Ammopiptanthus Mongolicus （Maxim. exKom.） Cheng f.）、煙草（Nicotiana tabacumL．）、山荊子、玉米和水稻等的研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)家族轉(zhuǎn)錄因子均能一定程度上提升植株的耐寒性，有些甚至是適應(yīng)冷脅迫所必須的。值得關(guān)注的是，HB-other轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)非生物脅迫的研究較少，僅在臍橙（Citrus sinensis Osbeck）和地梢瓜（Cynanchumthesioides（Freyn）K．Schum）的干旱脅迫響應(yīng)中被鑒定到，而在低溫脅迫的相關(guān)研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，共鑒定到148個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分屬于25個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，其中，ERF．NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP、HB-other和MYB-related等轉(zhuǎn)錄因子家族所包含的基因數(shù)目較多。這些轉(zhuǎn)錄因子中除HB-other在抗寒相關(guān)的研究中未被鑒定到外，其余均被鑒定到并被證明是與抗寒相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子家族，特別是bHLH、MYB-related和WRKY在前期秋茄抗寒相關(guān)的研究中被認(rèn)定為低溫應(yīng)激反應(yīng)中有價(jià)值的候選調(diào)節(jié)因子在本次秋茄低溫脅迫中首次鑒定出HB-other轉(zhuǎn)錄因子，并且KoHB-others的表達(dá)情況與qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果一致，推測(cè)其可能對(duì)秋茄響應(yīng)低溫脅迫起重要調(diào)控作用，在后期的研究中還有待被證實(shí)。

京都基因和基因組百科全書(shū)（KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）是用于分析代謝途徑、生物系統(tǒng)和基因功能的信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)。許多KEGG通路與植物響應(yīng)低溫脅迫有關(guān)，如橄欖（Canarium album （Lour.）Rauesch.）在低溫脅迫下的DEGs富集到了a-亞麻酸代謝、類(lèi)胡蘿卜素生物合成、光合．天線蛋白和晝夜節(jié)律相關(guān)等通路上，文冠果（Xanthocerassorbifolium Bunge）在低溫脅迫下DEGs顯著富集在淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝和氨基酸代謝等通路上。本研究中，秋茄葉片DEGs顯著富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成、半乳糖代謝、光合作用-天線蛋白和a-亞麻酸代謝等多條KEGG通路上，且這些通路已經(jīng)被大量研究證實(shí)與抗寒相關(guān)，其中，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、a-亞麻酸代謝和苯丙酸生物合成等通路在前期秋茄抗寒相關(guān)的研究中已經(jīng)得到證明。因此，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成、半乳糖代謝、光合作用．天線蛋白和a-亞麻酸代謝等是秋茄響應(yīng)低溫脅迫的重要KEGG通路。

植物激素是一種小的內(nèi)源性信號(hào)分子，如ABA、茉莉酸和生長(zhǎng)素等，在響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。ABA是植物適應(yīng)低溫脅迫的重要信號(hào)分子，并且其響應(yīng)低溫脅迫的“PYR／PYL／RCAR—IPP2Csl-SnRK2-ABF／AREB-靶基因”途徑已經(jīng)研究的較為清晰。ABA信號(hào)途徑基因已在許多植物中被鑒定和研究。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥過(guò)表達(dá)的尺CAAR12或RCAR13可以通過(guò)誘導(dǎo)低溫響應(yīng)基因CBFs的表達(dá)來(lái)耐受低溫脅迫。Ren等在葡萄愈傷組織和擬南芥中過(guò)表達(dá)VaPYL4基因可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因株系的耐寒性。大量研究表明，PP2Cs負(fù)向調(diào)控ABA信號(hào)途徑；但Hu等在煙草中過(guò)表達(dá)玉米根部的ZmPP2C2基因增強(qiáng)了煙草對(duì)低溫脅迫的耐受性，表明ZmPP2C2基因可能是玉米抗寒性的正向調(diào)控基因，這與大部分抗寒相關(guān)的研究結(jié)論相反，這可能是ZmPP2Cs的調(diào)控方式具有特殊性，具體原因還有待進(jìn)一步的研究。高山離子芥（Chorisporabungeana Fisch. et Mey.）的CbABF1在煙草中表達(dá)提高了植株對(duì)冷脅迫的耐受性，且轉(zhuǎn)基因植株的存活率高于野生型。在本研究中，KoPYL1（Maker00013579）．KoABF1（Maker00005324）和KoABF2（Maker00011633）上調(diào)表達(dá)，KoPP2C1（Maker00008505）和KoABF3（Maker00004855）下調(diào)表達(dá)，這和其他植物的相關(guān)研究結(jié)果一致，且這些基因的表達(dá)情況與qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果一致。因此，KoPYL1、KoPP2C1、KoABF1、KoABF2和KoABF3基因可作為后期研究秋茄響應(yīng)低溫脅迫的重要候選基因。

4結(jié)論

ERF、NAC、WRKY、bHLH、MYB、bZIP、HB-other和MYB-related等家族轉(zhuǎn)錄因子對(duì)秋茄響應(yīng)低溫脅迫起重要調(diào)控作用；植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成、半乳糖代謝、光合作用．天線蛋白和a-亞麻酸代謝等是秋茄響應(yīng)低溫脅迫的重要KEGG通路；ABA信號(hào)途徑中的KoPYL1、KoPP2C1、KoABF1、KoABF2和KoABF3等基因可作為后期研究秋茄響應(yīng)低溫脅迫的重要候選基因。