外源褪黑素對(duì)鎘脅迫下棉花種子萌發(fā)、抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

馬鑫穎 宋晨 孟妍君 劉連濤 張科 張永江 孫紅春 白志英 李存東

摘要：【目的】鎘（cadmium， Cd）是嚴(yán)重的環(huán)境污染物之一，Cd脅迫影響種子萌發(fā)。褪黑素（melatonin， MT）作為1種抗氧化劑，能夠促進(jìn)種子萌發(fā)。本研究通過(guò)分析外源MT對(duì)Cd脅迫下棉花種子萌發(fā)性狀、抗氧化酶活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響，明確MT對(duì)Cd脅迫下棉花種子萌發(fā)的調(diào)控效應(yīng)。【方法】試驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉農(nóng)大棉601種子為材料，篩選出Cd脅迫濃度（100 μmol·L－1）以及MT濃度（50 μmol·L－1），設(shè)置4個(gè)處理CK（純水對(duì)照）、MT（褪黑素）、Cd（鎘脅迫）、CM（鎘脅迫＋褪黑素），研究了不同處理下棉花種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、幼苗生物量以及抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量?！窘Y(jié)果】100 μmol·L－1 Cd脅迫下棉花種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、胚根和胚芽長(zhǎng)度以及胚根生物量顯著降低，但對(duì)胚芽生物量沒(méi)有顯著影響；Cd脅迫下棉花種子中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase， POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase， CAT）活性降低，可溶性蛋白含量降低，脯氨酸、可溶性糖含量、丙二醛含量升高。施用50 μmol·L－1 MT提高了Cd脅迫下棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，提高了種子中SOD、POD、CAT活性，提高了可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量，降低了丙二醛含量，顯著提高了胚根和胚芽長(zhǎng)度以及胚根的生物量?！窘Y(jié)論】施加50 μmol·L－1 MT能夠有效緩解100 μmol·L－1 Cd脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)的抑制作用。

關(guān)鍵詞：棉花；褪黑素；鎘；萌發(fā)；抗氧化酶；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

Effects of exogenous melatonin on germination， antioxidant enzymes activity，? and osmotic adjustment substance content of cotton seed under cadmium stress

Ma Xinying1， 2， Song Chen1， 2， Meng Yanjun1， 2， Liu Liantao2， Zhang Ke2， Zhang Yongjiang2， Sun Hongchun2， Bai Zhiying1， 2*， Li Cundong2*

（1. College of Life Science， Hebei Agricultural University， Baoding， Hebei 071000， China; 2. College of Agronomy， Hebei Agricultural University/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory of Crop Growth Regulation of Hebei Province， Baoding， Hebei 071000， China）

Abstract： [Objective]? Cadmium （Cd） is one of the serious environmental pollutants， and Cd stress affects seed germination. Melatonin （MT）， as an antioxidant， and can promotes seed germination. In this study， the effects of MT on cotton seed germination， antioxidant activity， and osmotic adjustment content under Cd stress were analyzed to clarify the regulatory effect of MT on cotton seed germination under Cd stress. [Method] Seeds of the transgenic insect-resistant cotton variety Nongdamian 601 were used as material， Cd concentration and MT concentration were screened. And four treatments， CK （control， water）， MT （melatonin treatment， 50 μmol·L－1）， Cd （cadmium stress 100 μmol·L－1 treatment）， CM （cadmium + melatonin treatment） were set. The germination potential， germination rate， seedling biomass， antioxidant enzyme activity， and osmotic adjustment content of cotton seed under different treatments were studied. [Result] Cd stress of 100 μmol·L－1 significantly decreased the germination potential， the germination rate， the length of radicle and plumule， the fresh and dry mass of radicle， but had no significant effect on the fresh or dry mass of plumule. Under the stress of Cd， the activity of superoxide dismutase （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， and soluble protein content of cotton seed were decreased. The content of proline， soluble sugar and malondialdehyde （MDA） were increased. Application of MT （50 μmol·L－1） increased the germination potential and germination rate of cotton seed under Cd stress， the activity of SOD， POD and CAT， the content of soluble protein， soluble sugar and proline， while decreased the content of MDA， significantly increased the length of radicle and plumule， and significantly increased radicle biomass. [Conclusion] Exogenous MT （50 μmol·L－1） could effectively alleviate the inhibitory effeet of Cd stress （100 μmol·L－1） on cotton seed germination.

Keywords： cotton （Gossypium hirsutum L.）; melatonin; cadmium; germination; antioxidant enzyme; osmotic adjustment

鎘（cadmium， Cd）是嚴(yán)重的環(huán)境污染物之一，也是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的非必需重金屬元素，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、易于積累、不易消除等特點(diǎn)，易被植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。近年來(lái)，由于冶煉采礦以及廢水灌溉、化肥農(nóng)藥的不合理施用，造成土壤Cd污染加重[1]。棉花是1種易于富集Cd的作物，且對(duì)Cd耐受性低。種子萌發(fā)是棉花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的敏感階段，易受到Cd脅迫，進(jìn)而影響棉花的后期生長(zhǎng)[2]。6 mg·L－1 Cd處理對(duì)棉花種子萌發(fā)產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用，但30 mg·L－1 Cd處理抑制種子萌發(fā)，且增加了棉花葉片中可溶性糖、脯氨酸含量[3]。100 μmol·L－1 Cd處理下棉苗干物質(zhì)質(zhì)量、根系總根長(zhǎng)、總表面積和總體積呈下降趨勢(shì)[4]。200 μmol·L－1 Cd脅迫顯著降低棉花籽棉產(chǎn)量、鈴數(shù)以及鈴重[5]。10 μmol·L－1 Cd脅迫下，豌豆種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率升高；隨著Cd濃度的升高，種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)以及胚芽長(zhǎng)顯著降低[6]。100 mg·L－1 Cd脅迫降低了水稻胚根的鮮物質(zhì)質(zhì)量及干物質(zhì)質(zhì)量，且Cd濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制效應(yīng)愈加明顯[7]。

Cd脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）積累，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase， POD）和過(guò)氧化氫酶（catalase， CAT）活性提高以抵御Cd脅迫對(duì)植物造成的氧化損傷[8]。當(dāng)重金屬濃度較低時(shí)，植物抗氧化酶活性被激活，可減輕活性氧自由基對(duì)細(xì)胞膜的傷害；當(dāng)重金屬濃度超過(guò)植物耐受值時(shí)，活性氧自由基大量產(chǎn)生，抗氧化酶活性受到抑制，從而阻礙植物生長(zhǎng)發(fā)育[9]。在逆境脅迫下，植物會(huì)通過(guò)提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量保持細(xì)胞水勢(shì)，從而維持植物的正常代謝[10]。研究發(fā)現(xiàn)，200 mg·L－1 Cd脅迫下，辣椒種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化酶活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量則呈逐漸降低趨勢(shì)[11]。2 mg·kg－1 Cd脅迫抑制了煙草種子萌發(fā)，抗氧化酶SOD活性和CAT活性、可溶性糖含量隨Cd2＋濃度的增加呈先增后降的趨勢(shì)，脯氨酸含量則隨Cd2＋濃度的增加而增加[12]。100 μmol·L－1 Cd脅迫下，棉花幼苗葉片SOD、POD、CAT活性顯著降低[13]。Cd2＋濃度達(dá)到10 μmol·L－1時(shí)，小麥種子萌發(fā)受到抑制，CAT活性降低[14]。

褪黑素（melatonin， MT）屬于吲哚雜環(huán)類化合物，極易進(jìn)入種子內(nèi)部，具有顯著的抗氧化功能，能夠促進(jìn)逆境下種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[15-16]。100 μmol·L－1 MT促進(jìn)10 μmol·L－1 Cd脅迫下豌豆種子萌發(fā)，增加幼根、幼芽長(zhǎng)度，提高抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，降低MDA含量[6]。MT可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)，緩解Cd脅迫對(duì)油菜生長(zhǎng)的抑制[17]。MT還可通過(guò)增強(qiáng)POD活性、提高可溶性蛋白含量，降低蘿卜葉片中Cd2＋含量，緩解Cd脅迫產(chǎn)生的毒害[18]。施加100 μmol·L－1 MT可提高400 μmol·L－1 Cd脅迫下苘麻可溶性蛋白含量，維持細(xì)胞的正常水分狀態(tài)[19]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外專家對(duì)Cd脅迫下小麥[20]、水稻[21]、蔬菜[8]種子萌發(fā)進(jìn)行了研究，但有關(guān)MT對(duì)Cd脅迫下棉花種子萌發(fā)影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種農(nóng)大棉601為材料，研究外源MT對(duì)Cd脅迫下棉花種子萌發(fā)、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響，為MT的應(yīng)用以及棉花逆境栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)以轉(zhuǎn)基因抗蟲棉農(nóng)大棉601為材料，種子由河間國(guó)欣農(nóng)村技術(shù)服務(wù)總會(huì)提供。試驗(yàn)于2022―2023年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)光溫高效利用室進(jìn)行。

1.2 鎘脅迫濃度的篩選

選擇飽滿健康、胚完整的農(nóng)大棉601種子，用75%（體積分?jǐn)?shù)）酒精消毒15 min，用蒸餾水沖洗干凈，加入超純水在恒溫培養(yǎng)箱中避光浸種24 h，隨后在通風(fēng)處晾干，恢復(fù)初始含水量（浸種前后種子質(zhì)量無(wú)明顯差異）。依據(jù)文獻(xiàn)[4， 6]以及前期的預(yù)試驗(yàn)，設(shè)置了6個(gè)Cd脅迫濃度，分別為0、10、50、100、150、200 μmol·L－1的CdCl2·2.5H2O溶液。將種子放于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放30粒種子，蓋上一層濾紙，用移液槍分別加入不同濃度的CdCl2·2.5H2O溶液10 mL，每個(gè)處理重復(fù)3次。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d，每天定時(shí)加入8 mL對(duì)應(yīng)濃度的Cd溶液，依據(jù)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率篩選出Cd脅迫的濃度。

1.3 褪黑素濃度的篩選

選擇飽滿健康、胚完整的棉花種子對(duì)其進(jìn)行消毒后，依據(jù)文獻(xiàn)[6]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，利用0、10、20、50、100 μmol·L－1不同濃度的MT溶液浸種24 h，隨后在通風(fēng)處晾干，恢復(fù)初始含水量（浸種前后種子質(zhì)量無(wú)明顯差異）。將種子放于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿30粒種子，分別加入上述5個(gè)濃度的MT溶液和篩選出的Cd溶液，共6個(gè)處理，其中CK為純水對(duì)照；Cd為100 μmol·L－1的Cd脅迫處理；MT1（100 μmol·L－1 Cd＋10 μmol·L－1 MT）、MT2（100 μmol·L－1 Cd＋20 μmol·L－1 MT）、MT3（100 μmol·L－1 Cd＋50 μmol·L－1 MT）、MT4（100 μmol·L－1 Cd＋100 μmol·L－1 MT），每個(gè)處理重復(fù)3次。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d，每天定時(shí)加入8 mL Cd溶液和對(duì)應(yīng)濃度的MT溶液，依據(jù)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的變化篩選出適宜的MT濃度。

1.4 試驗(yàn)處理

種子消毒處理后，晾干，以預(yù)試驗(yàn)篩選出的100 μmol·L－1 CdCl2·2.5H2O溶液為Cd脅迫濃度，50 μmol·L－1 MT濃度為緩解Cd脅迫的適宜濃度，設(shè)置4個(gè)處理（每個(gè)重復(fù)30粒種子）：CK，蒸餾水浸種，培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充水分；MT，50 μmol·L－1 MT浸種，培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充MT溶液；Cd，蒸餾水浸種，培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充100 μmol·L－1 CdCl2·2.5H2O溶液；CM，50 μmol·L－1 MT浸種，培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充100 μmol·L－1 CdCl2·2.5H2O和50 μmol·L－1 MT混合溶液。每個(gè)處理重復(fù)3次。不同處理的棉花種子在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d，每天定時(shí)補(bǔ)充8 mL對(duì)應(yīng)的溶液。

1.5 發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)測(cè)定

以胚根突破種皮、達(dá)到棉花種子長(zhǎng)度一半時(shí)視為發(fā)芽[22]。在種子萌發(fā)第3 天測(cè)定棉花種子的發(fā)芽勢(shì)（germination potential），第7天測(cè)定棉花種子的發(fā)芽率（germination rate），另外計(jì)算發(fā)芽指數(shù)（germination index， GI）和活力指數(shù)（vigor index）。發(fā)芽勢(shì)＝第3天總發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；發(fā)芽率＝第7天總發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)＝Σ（Gt/Dt），其中，Gt為第t天時(shí)的總發(fā)芽粒數(shù)，Dt為相應(yīng)發(fā)芽時(shí)間（d）；活力指數(shù)＝發(fā)芽指數(shù)×第7 天的平均根長(zhǎng)。

1.6 胚根和胚芽的長(zhǎng)度測(cè)定及質(zhì)量測(cè)定

種子萌發(fā)第7天，每個(gè)處理選取30粒棉花種子，用游標(biāo)卡尺測(cè)量棉花胚根和胚芽長(zhǎng)度。然后，用吸水紙將表面水分吸干，用分析天平測(cè)定棉花種子的胚根和胚芽鮮物質(zhì)質(zhì)量。最后105 ℃殺青15 min、80 ℃烘干至質(zhì)量恒定，用分析天平測(cè)定胚根和胚芽的干物質(zhì)質(zhì)量。

1.7 抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及MDA含量測(cè)定

分別在萌發(fā)的第1、3、5、7天取整粒種子，用錫紙包好在液氮中速凍，之后放置于－80 ℃冰箱中保存，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)約0.2 g。用購(gòu)自南京建成生物公司的試劑盒測(cè)定抗氧化酶SOD、POD、CAT活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸）含量和MDA含量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 27.0.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行單因素方差分析，用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，采用GraphPad Prism 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫濃度的篩選

由圖1可知，Cd脅迫影響棉花種子萌發(fā)。無(wú)Cd脅迫（0 μmol·L－1 Cd）時(shí)，棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為52.80%和75.37%；當(dāng)Cd濃度為10 μmol·L－1時(shí)，棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為53.34%和75.53%，與0 μmol·L－1 Cd處理相比略高，但無(wú)顯著差異；當(dāng)Cd濃度達(dá)到50 μmol·L－1時(shí)，棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為42.66%和72.68%，與0 μmol·L－1 Cd處理無(wú)顯著差異，表明低濃度Cd溶液對(duì)棉花種子萌發(fā)無(wú)顯著抑制效應(yīng)。當(dāng)Cd濃度達(dá)到100 μmol·L－1時(shí)，棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為36.43%和49.50%，與0 μmol·L－1Cd處理相比分別顯著降低16.37和25.87百分點(diǎn)；當(dāng)Cd濃度為150～200 μmol·L－1時(shí)，棉花種子的發(fā)芽勢(shì)顯著降低為17.78%～28.89%、發(fā)芽率顯著降低為37.04%～45.43%，表明高濃度Cd溶液顯著抑制棉花種子萌發(fā)。根據(jù)棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，篩選出Cd脅迫適宜濃度為100 μmol·L－1。

2.2 褪黑素濃度的篩選

Cd脅迫下，施加不同濃度的褪黑素對(duì)棉花種子萌發(fā)產(chǎn)生了不同影響（圖2）。Cd脅迫下棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為33.03%和42.22%，與CK相比分別顯著降低17.51和34.27百分點(diǎn)。施加MT能提高棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，MT1（10 μmol·L－1 MT）處理下棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率與Cd脅迫下相比雖略有升高，但無(wú)顯著差異；MT2（20 μmol·L－1 MT）處理下棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為40.81%和52.71%，與Cd脅迫相比分別顯著提高7.78和10.49百分點(diǎn)；MT3（50 μmol·L－1 MT）處理下棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為46.76%和75.37%，與Cd脅迫相比顯著提高13.73和33.15百分點(diǎn)，與CK（無(wú)Cd脅迫）無(wú)顯著差異；MT4（100 μmol·L－1 MT）處理下棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為39.60%和58.97%，與CK和MT3處理相比顯著降低。因此，選擇50 μmol·L－1 MT作為緩解Cd脅迫的最適濃度處理。

2.3 褪黑素處理對(duì)鎘脅迫下棉花種子萌發(fā)性狀的影響

由圖3A和3B可知，MT處理棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為57.13%和78.62%；Cd處理下種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為36.67%和48.15%，與CK相比分別顯著降低15.55和28.97百分點(diǎn)，表明Cd脅迫抑制種子萌發(fā)；CM（Cd脅迫下施加MT）處理后棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率分別為48.89%和71.11%，與Cd處理相比分別顯著提高12.22和22.96百分點(diǎn)，發(fā)芽勢(shì)與CK無(wú)顯著差異。

分析發(fā)芽指數(shù)（圖3C）和活力指數(shù)（圖3D）可知，MT處理下棉花種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別為42.26和404.73，均顯著高于CK；Cd處理下棉花種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別為32.62和141.23，與CK相比分別顯著降低22.28%和59.91%；CM處理下棉花種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別為39.86和261.21，分別比Cd處理顯著提高22.19%和84.95%。以上結(jié)果表明MT能促進(jìn)正常條件下棉花種子的萌發(fā)，并緩解Cd脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)的抑制作用。

2.4 褪黑素對(duì)鎘脅迫下棉花種子胚根和胚芽長(zhǎng)度及生物量的影響

由圖4A可知，MT處理棉花種子的胚根長(zhǎng)度最長(zhǎng)，顯著高于其他處理。Cd脅迫下棉花種子胚根和胚芽長(zhǎng)度最短，分別為4.35 cm和5.65 cm，與CK相比分別顯著降低47.90%和29.20%，表明Cd脅迫抑制棉花幼苗伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。CM處理下棉花幼苗的胚根和胚芽長(zhǎng)度分別為6.50 cm和6.70 cm，與Cd脅迫相比分別顯著提高49.43%和18.58%。表明施用MT不僅能促進(jìn)正常條件下棉花種子胚根的伸長(zhǎng)，而且能促進(jìn)Cd脅迫下胚根與胚芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

分析棉花種子鮮物質(zhì)質(zhì)量（圖4B）可知，CK處理下種子胚根和胚芽的鮮物質(zhì)質(zhì)量分別為0.58 g和3.06 g；MT處理下胚根和胚芽的鮮物質(zhì)質(zhì)量與CK處理無(wú)顯著差異；Cd脅迫下種子胚根和胚芽的鮮物質(zhì)質(zhì)量分別為0.48 g和2.99 g，與CK處理相比，Cd脅迫顯著降低了胚根鮮物質(zhì)質(zhì)量，但對(duì)胚芽鮮物質(zhì)質(zhì)量無(wú)顯著影響。與Cd處理相比，CM處理下胚根鮮物質(zhì)質(zhì)量顯著增加，而胚芽鮮物質(zhì)質(zhì)量無(wú)顯著差異。Cd脅迫下胚根鮮物質(zhì)質(zhì)量和干物質(zhì)質(zhì)量顯著低于其他處理，而4個(gè)處理的胚芽鮮物質(zhì)質(zhì)量和干物質(zhì)質(zhì)量均無(wú)顯著差異（圖4B和4C），表明MT的應(yīng)用顯著促進(jìn)了Cd脅迫下棉花胚根的生長(zhǎng)。

2.5 褪黑素對(duì)鎘脅迫下棉花種子抗氧化酶和MDA的影響

由圖5A可知，種子萌發(fā)過(guò)程中SOD活性呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)，各處理的SOD活性均在種子萌發(fā)第3天時(shí)較高。與CK相比，棉花種子萌發(fā)過(guò)程中MT處理下SOD活性提高了3.41%～20.82%，且在萌發(fā)的第1、5、7 天差異顯著。與CK相比，Cd脅迫顯著降低了種子萌發(fā)過(guò)程中SOD活性，在第1、3、5、7天時(shí)，分別顯著降低15.20%、31.47%、19.30%、13.28%。與Cd脅迫相比，CM處理下種子SOD活性顯著提高12.96%～22.87%。表明Cd脅迫抑制了種子SOD活性，施加MT增強(qiáng)了正常條件下及Cd脅迫下種子SOD活性。

由圖5B可知，種子萌發(fā)過(guò)程中POD活性呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)。MT處理下POD活性與CK處理無(wú)顯著差異。Cd處理顯著降低了棉花種子萌發(fā)過(guò)程中POD活性，在第1、3、5、7 天時(shí)，POD活性分別降低了34.17%、41.70%、18.20%、14.74%。與Cd處理相比，CM處理下種子萌發(fā)過(guò)程中POD活性顯著提高20.33%～70.84%，且與CK無(wú)顯著差異。由此表明，Cd脅迫顯著抑制種子萌發(fā)過(guò)程中POD活性，施加MT能顯著提高Cd脅迫下種子萌發(fā)過(guò)程中POD活性。

由圖5C可知，種子萌發(fā)過(guò)程中CAT活性呈逐漸降低趨勢(shì)。與CK相比，MT處理下種子萌發(fā)過(guò)程中CAT活性顯著提高6.35%～30.62%。與CK相比，Cd脅迫下顯著降低種子萌發(fā)過(guò)程中CAT活性，在種子萌發(fā)第1、3、5、7 天分別降低32.92%、42.49%、39.95%、38.25%。與Cd處理相比，CM處理下種子萌發(fā)過(guò)程中CAT活性顯著提高32.57%～70.44%。表明Cd脅迫顯著抑制種子CAT活性，施加MT能顯著提高正常條件及Cd脅迫下種子的CAT活性。

由圖5D可知，棉花種子萌發(fā)過(guò)程中MDA含量呈逐漸降低趨勢(shì)。與CK相比，種子萌發(fā)過(guò)程中MT處理的MDA含量降低但差異不顯著，降低1.89%～24.90%。與CK相比，Cd處理下MDA含量顯著升高，在種子萌發(fā)第1、3、5、7 天，MDA含量分別提高了5.37%、13.51%、37.51%、15.04%，表明Cd脅迫導(dǎo)致種子膜脂過(guò)氧化程度顯著提高。與Cd脅迫相比，CM處理下MDA含量顯著降低21.46%～28.22%，表明施加MT顯著降低Cd脅迫下種子萌發(fā)過(guò)程中MDA含量，緩解Cd脅迫導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化損害。

2.6 褪黑素對(duì)鎘脅迫下棉花種子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖6A可知，在種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)逐漸降低的變化趨勢(shì)。與CK相比，MT處理下種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性蛋白含量提高5.75%～21.48%。與CK相比，Cd處理下種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性蛋白含量顯著降低，在萌發(fā)第1、3、5、7 天分別降低23.70%、41.80%、31.03%、30.23%，表明Cd脅迫抑制種子萌發(fā)中可溶性蛋白積累。與Cd處理相比，CM處理下種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性蛋白含量顯著提高36.67%～46.48%。由此表明，施加MT顯著提高Cd脅迫下種子萌發(fā)過(guò)程中的可溶性蛋白含量。

由圖6B可知，與CK相比，MT處理下種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖含量，提高了0.76%～27.24%。與CK相比，除萌發(fā)第1 天外，Cd處理下種子萌發(fā)中可溶性糖含量顯著提高，在萌發(fā)第1、3、5、7 天分別提高4.68%、58.14%、30.04%、63.04%，表明Cd脅迫促進(jìn)了萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖的積累。與Cd處理相比，CM處理下種子中可溶性糖含量提高了1.45%～18.97%，表明施加MT提高了Cd脅迫下種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖含量。

由圖6C可知，種子萌發(fā)過(guò)程中脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)，在種子萌發(fā)第3天含量最高。萌發(fā)第1天，各處理的脯氨酸含量無(wú)顯著差異。在萌發(fā)第3～7 天，與CK相比，MT處理下種子萌發(fā)過(guò)程中脯氨酸含量降低0.25%～27.67%。與CK相比，Cd處理下種子萌發(fā)過(guò)程中脯氨酸含量顯著升高，在萌發(fā)第3～7 天分別提高13.51%、37.51%、15.04%，表明Cd脅迫促進(jìn)種子萌發(fā)中脯氨酸的積累。與Cd處理相比，CM處理下種子萌發(fā)過(guò)程中脯氨酸含量提高17.73%～31.43%，表明Cd脅迫下，施加MT能顯著提高種子萌發(fā)3～7 d的脯氨酸含量。

3 討論

3.1 褪黑素對(duì)鎘脅迫下棉花種子萌發(fā)的調(diào)控效應(yīng)

Cd是1種重金屬元素，嚴(yán)重污染環(huán)境。據(jù)報(bào)道，中國(guó)土壤中重金屬點(diǎn)位的超標(biāo)率已達(dá)16.1%，而Cd以7.0%的點(diǎn)位超標(biāo)率位居第一[23]。種子萌發(fā)階段受重金屬影響較大，重金屬在植物體內(nèi)累積會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[6]。研究表明，低濃度（50 μmol·L－1和75 μmol·L－1）Cd處理能促進(jìn)草地早熟禾的種子萌發(fā)，高濃度（100 μmol·L－1）Cd處理則抑制種子萌發(fā)[24]。在Cd脅迫下，小麥種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)顯著降低，且Cd濃度越高抑制作用越強(qiáng)[14]。低濃度Cd能促進(jìn)豌豆種子萌發(fā)，高濃度Cd顯著降低種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，而施加適宜濃度的MT則能提高Cd脅迫下豌豆種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率[6]。本研究結(jié)果表明，10 μmol·L－1、50 μmol·L－1的Cd脅迫下，棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率與對(duì)照無(wú)顯著差異；當(dāng)Cd濃度達(dá)到100 μmol·L－1時(shí)，棉花種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率顯著降低，且隨Cd濃度增加，種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率持續(xù)降低。這與前人的研究結(jié)果較為一致，低濃度Cd會(huì)提高種子胚的生理活性，而高濃度Cd則會(huì)抑制種子的代謝過(guò)程，對(duì)種子胚、芽等產(chǎn)生毒害作用[25]。MT易進(jìn)入種子內(nèi)部，具有顯著的抗氧化能力，因此施加MT后促進(jìn)了Cd脅迫下棉花種子萌發(fā)。

胚根和胚芽的長(zhǎng)度和生物量是評(píng)價(jià)植物抗逆能力的關(guān)鍵指標(biāo)。研究表明，100 μmol·L－1 Cd脅迫顯著降低早熟禾種子的胚根和胚芽長(zhǎng)度[24]。Cd脅迫下，水稻芽和根的生長(zhǎng)受到明顯限制，施加10 μmol·L－1的MT能顯著提高水稻根長(zhǎng)[26]。Cd脅迫下，豌豆芽和根的鮮物質(zhì)質(zhì)量降低，適宜濃度MT處理能提高Cd脅迫下豌豆的芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、芽鮮物質(zhì)質(zhì)量和根鮮物質(zhì)質(zhì)量[6]。本研究結(jié)果表明，Cd脅迫顯著降低棉花種子胚根和胚芽的長(zhǎng)度、胚根的鮮物質(zhì)質(zhì)量和干物質(zhì)質(zhì)量。對(duì)胚根的抑制作用大于胚芽，這可能是由于根系直接吸收了大量Cd2＋，抑制了根尖細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，使根系生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致生物量減少；而且胚根是最早接受Cd毒害的部位，所以受到的影響更大[8， 27]。Cd脅迫下，施加MT能顯著提高棉花種子胚根和胚芽長(zhǎng)度、胚根的鮮物質(zhì)質(zhì)量和干物質(zhì)質(zhì)量，緩解了Cd脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)的抑制作用，這與前人的研究結(jié)果較為一致。

3.2 褪黑素對(duì)鎘脅迫下棉花種子抗氧化能力的調(diào)控效應(yīng)

Cd可抑制植物的抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致ROS積累；或通過(guò)增加Fenton金屬含量直接產(chǎn)生ROS，Cd2＋可與Fe2＋相互作用，從而導(dǎo)致植物膜脂過(guò)氧化程度加重、MDA含量增加[28]。植物在抵抗Cd脅迫過(guò)程中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)SOD、POD、CAT活性來(lái)抵御傷害[8]。MT能夠提高植物抗氧化酶活性，增強(qiáng)植物抵抗逆境脅迫的能力[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MT處理顯著提高了Cd脅迫下燕麥幼苗SOD、POD和CAT活性，降低了MDA的含量[29]。蘇海蘭等[30]研究發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)過(guò)程中SOD、POD活性呈逐漸升高的趨勢(shì)，而CAT活性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明，Cd脅迫顯著降低了棉花種子中抗氧化酶活性，這可能是由于100 μmol·L－1 Cd脅迫超過(guò)了棉花種子的耐脅迫能力，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，ROS的產(chǎn)生與清除系統(tǒng)失去平衡，抗氧化酶活性受到抑制[28]。MT具有親脂性與親水性，能夠協(xié)助增強(qiáng)抗氧化酶對(duì)活性氧的清除作用[16]。棉花種子萌發(fā)過(guò)程中SOD活性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，POD活性呈逐漸升高的趨勢(shì)，CAT活性呈逐漸降低的趨勢(shì)，這可能是由于種子萌發(fā)需要較高的SOD活性，因此，SOD在萌發(fā)前期最先被激活。POD活性在種子萌發(fā)后期顯著提高，說(shuō)明較高的POD活性可以促進(jìn)種子出苗。MDA含量反映植物膜脂過(guò)氧化程度，MDA含量越高其膜脂過(guò)氧化程度則越高[31]。黃承玲等[32]發(fā)現(xiàn)迷人杜鵑種子萌發(fā)過(guò)程中MDA含量逐漸降低，本研究結(jié)果與此一致，這可能是由于種子在萌發(fā)初期MDA含量較高，當(dāng)種子吸脹萌動(dòng)后，激活了抗氧化酶活性，從而使膜脂過(guò)氧化程度降低。

3.3 褪黑素對(duì)鎘脅迫下棉花種子萌發(fā)中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)，這三者協(xié)調(diào)作用維持細(xì)胞的含水量和膨壓勢(shì)，從而使植物維持正常生長(zhǎng)[33]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重金屬濃度較低時(shí)，植物會(huì)通過(guò)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡，抑制重金屬進(jìn)入細(xì)胞；當(dāng)重金屬濃度較高時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致滲透物質(zhì)含量降低[34]。Cd脅迫下，燕麥幼苗可溶性蛋白含量降低，脯氨酸含量升高，施加MT后可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量提高[29]。Cd脅迫下，側(cè)柏幼苗可溶性蛋白含量、可溶性糖含量降低，脯氨酸含量升高[35]。本研究中Cd脅迫下棉花種子中可溶性蛋白含量降低、脯氨酸含量升高，這與前人的研究結(jié)果較為一致，這是由于植物細(xì)胞中可溶性蛋白能與Cd2＋絡(luò)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與氧自由基反應(yīng)從而導(dǎo)致氨基酸結(jié)構(gòu)改變、多肽鏈斷裂、蛋白質(zhì)水解，最終造成可溶性蛋白含量降低[36-37]。Cd脅迫下，棉花種子可能通過(guò)增加脯氨酸含量來(lái)維持細(xì)胞的正常水勢(shì)，脯氨酸還可與Cd形成絡(luò)合物，以降低細(xì)胞中Cd含量。逆境條件下，可溶性糖可調(diào)節(jié)細(xì)胞水勢(shì)和細(xì)胞吸水能力[38]。本研究結(jié)果表明，Cd脅迫下棉花種子中可溶性糖含量升高，這與前人的研究結(jié)果并不一致，這可能是因?yàn)樵贑d脅迫初期，碳水化合物積累，促進(jìn)淀粉水解，導(dǎo)致可溶性糖含量增加，從而維持細(xì)胞的滲透平衡[39]。MT易于透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并且其吸附在細(xì)胞膜上有利于維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[16]。因此，施加MT能夠提高棉花種子中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，提高棉花抗逆性，緩解Cd脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)的抑制作用。

3.4 褪黑素在鎘污染超標(biāo)棉田中的應(yīng)用前景分析

棉花能夠富集Cd，是鎘污染農(nóng)田的修復(fù)作物[2， 40]。Cd污染達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制棉花種子萌發(fā)和根系的生長(zhǎng)[4]，降低棉花單株鈴數(shù)、鈴重，顯著降低籽棉產(chǎn)量和皮棉產(chǎn)量[41]。本研究結(jié)果表明，施加50 μmol·L－1 MT能提高棉花種子抗氧化酶活性，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，降低MDA含量，有效緩解Cd脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)的抑制作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，施加100 μmol·L－1 MT能提高Cd脅迫下豌豆種子中抗氧化酶活性，降低Cd積累量，促進(jìn)種子萌發(fā)[6]；施加MT能提高Cd脅迫下水稻幼苗根系活力，增強(qiáng)抗氧化酶活性，促進(jìn)水稻種子萌發(fā)[26]。施加適宜濃度的MT均能促進(jìn)Cd脅迫下多種植物種子的萌發(fā)，提高植物抗性。因此，對(duì)于棉花等易于富集Cd的作物來(lái)說(shuō)，在萌發(fā)前期進(jìn)行一定濃度的MT處理有利于種子萌發(fā)，促進(jìn)壯苗。由此推測(cè)，在Cd污染超標(biāo)棉田中，通過(guò)MT浸種能降低植株Cd積累量，促進(jìn)棉花生長(zhǎng)、提高棉花產(chǎn)量。上述推證有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，低濃度（10 μmol·L－1、50 μmol·L－1） Cd脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)無(wú)顯著抑制作用，100 μmol·L－1及更高濃度的Cd脅迫顯著抑制種子萌發(fā)，且Cd濃度越高抑制作用越強(qiáng)。Cd脅迫下，施加50 μmol·L－1 MT促進(jìn)種子萌發(fā)效果最好。Cd脅迫抑制棉花種子胚根、胚芽生長(zhǎng)，降低抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量，增加可溶性糖、脯氨酸和MDA含量；Cd脅迫下施加MT能提高種子抗氧化酶活性，顯著增加滲透物質(zhì)含量，降低MDA含量，從而緩解Cd脅迫對(duì)棉花種子萌發(fā)的抑制作用，增強(qiáng)棉花抵御逆境的能力。

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