跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)db/db小鼠心肌PPARα信號(hào)通路的影響研究

孫 易 ，張 怡 ，丁樹(shù)哲 *

糖尿病是目前世界上最常見(jiàn)的慢性疾病之一。糖尿病心血管并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因，且其發(fā)病機(jī)理在于代謝失調(diào)和胰島素抵抗的共同作用（楊宗璐 等，2021；Young et al.，2002）。心肌細(xì)胞具有很高的能量需求，其中大部分是通過(guò)脂肪酸氧化獲得的，其余30%來(lái)自于葡萄糖和乳酸代謝（Neely et al.，1972）。然而，對(duì)于糖尿病患者來(lái)說(shuō)，葡萄糖攝取、糖酵解和丙酮酸氧化等過(guò)程受到抑制，脂肪代謝活動(dòng)上調(diào)，從而產(chǎn)生心肌脂變、過(guò)量ROS 生成和心肌細(xì)胞死亡等問(wèn)題。已有研究認(rèn)為，作為決定脂肪酸氧化能力的重要代謝因子（Bugger et al.，2014），過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）可能通過(guò)激活脂肪酸攝取和β 氧化相關(guān)基因調(diào)控糖尿病心肌代謝（Finck et al.，2002； Lee et al.，2017）。有證據(jù)表明，PPARα-/-小鼠不易發(fā)生糖尿病誘導(dǎo)的心臟肥大，而心臟特異性PPARα 過(guò)表達(dá)的糖尿病小鼠則表現(xiàn)出心肌細(xì)胞脂質(zhì)堆積（Finck et al.，2003； 蔡歡 等，2016）。此外，miR-30c 及GLP-1（glucagon-like peptide-1，胰高血糖素樣肽-1）也被認(rèn)為通過(guò)PPARα 信號(hào)通路參與改善糖尿病心肌?。╓u et al.，2018；Yin et al.，2019）。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練一直被認(rèn)為是干預(yù)糖尿病溫和、有效的手段，能通過(guò)阻礙ROS 堆積、改善線粒體功能、抑制心肌凋亡通路、改善心肌纖維化等途徑改善糖尿病心臟病變和心功能，并促進(jìn)心肌代謝由脂肪酸氧化向葡萄糖供能轉(zhuǎn)化（Delfan et al.，2020； Seo et al.，2019； Wang et al.，2020）。然而，目前鮮見(jiàn)探索PPARα 在運(yùn)動(dòng)緩解糖尿病心肌代謝失調(diào)中作用的研究，且糖尿病和運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)PPARα 表達(dá)的影響也尚存爭(zhēng)議，考慮這可能與采用的動(dòng)物模型和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練強(qiáng)度不同有關(guān)（陳國(guó)慶 等，2014； 張崇林 等，2018；Lee et al.，2010）。

除代謝失調(diào)外，胰島素抵抗是導(dǎo)致糖尿病心肌病變發(fā)生的另一重要原因，其中，MG53 表達(dá)上調(diào)可能是導(dǎo)致糖尿病心肌胰島素抵抗的因素之一（齊潔 等，2016； Liu et al.，2015）。MG53 是一種TRIM 家族蛋白，在骨骼肌和心肌中特異性表達(dá)?；谵D(zhuǎn)基因動(dòng)物模型（MG53Tg及MG53-/-）的研究顯示，作為一種E3 泛素連接酶，MG53 可能通過(guò)誘導(dǎo)胰島素受體（insulin receptor，IR）和胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）降解促進(jìn)胰島素抵抗（Song et al.，2013）。除介導(dǎo)胰島素抵抗外，MG53還被認(rèn)為抑制糖代謝相關(guān)基因表達(dá)，上調(diào)脂代謝相關(guān)基因，且上述過(guò)程是通過(guò)上調(diào)PPARα 及其靶基因?qū)崿F(xiàn)的（Hu et al.，2018；Liu et al.，2015）。然而，在自然生理病理?xiàng)l件下，MG53 是否參與各組織胰島素抵抗尚未定論。有研究顯示，肥胖及2 型糖尿病患者及模式鼠中可見(jiàn)血清MG53 水平升高，且采用單克隆抗體中和血MG53 能提高db/db小鼠胰島素敏感性（Wu et al.，2019）。

db/db小鼠是一種應(yīng)用廣泛的自發(fā)性2 型糖尿病模型。db/db小鼠的心臟在10～14 周齡時(shí)即出現(xiàn)心肌代謝改變、收縮功能減弱等特性，因此適宜用于糖尿病心血管病變相關(guān)研究?；诖?，本研究探索12 周跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)db/db小鼠心肌代謝和胰島素抵抗的作用，并分析PPARα和MG53 在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20 只SPF 級(jí)6 周齡雄性db/db（BSK.Cg-Dock7m ＋/＋Leprdb/JNju）小鼠和20 只m/m（C57BLKS/JNju）小鼠，購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。db/db小鼠和m/m小鼠系通過(guò)雜合子db/m小鼠交配繁殖獲得。在后代的3 種表型中，黑色肥胖者為db/db小鼠，具有2 型糖尿病的典型特征，灰色瘦小者為m/m小鼠，常用作對(duì)照鼠，小鼠均經(jīng)過(guò)基因型鑒定。小鼠分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（22±2） ℃，空氣濕度（50±10）%，12 h/12 h 晝夜節(jié)律，自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，小鼠隨機(jī)分為4 組：db/db對(duì)照組（DC，n=10），db/db運(yùn)動(dòng)組（DE，n=10），m/m對(duì)照組（MC，n=10）和m/m運(yùn)動(dòng)組（ME，n=10）。測(cè)量并記錄各組小鼠體質(zhì)量和空腹血糖值。

1.2 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案以已有研究為基礎(chǔ)（Broderick et al.，2017； Sennott et al.，2008）：第1 周，小鼠以7.0～13.3 m/min 的速度運(yùn)動(dòng)15～20 min，一周4 次。第2 周，小鼠以13.3 m/min的速度運(yùn)動(dòng)30～45 min，一周6 次，周日休息。第3～12 周，上述運(yùn)動(dòng)速度和頻率維持不變，每日連續(xù)運(yùn)動(dòng)1 h，周日休息。小鼠運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)間為20：00—21：00。在第12 周，再次測(cè)量各組小鼠體質(zhì)量和空腹血糖值。

1.3 腹腔胰島素耐量（IPITT）實(shí)驗(yàn)

末次運(yùn)動(dòng)結(jié)束12 h 后，每組隨機(jī)選取5 只小鼠進(jìn)行IPITT 實(shí)驗(yàn)。小鼠禁食4 h，從尾部靜脈取血測(cè)空腹血糖值（ACCU-CHEK 血糖測(cè)試儀）。腹腔內(nèi)注射胰島素（2 U/kg）后30、60、90、120 min 分別取血并測(cè)量血糖值。

1.4 組織獲取

IPITT 實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，小鼠過(guò)夜禁食。每組隨機(jī)抽取3 只小鼠進(jìn)行胰島素刺激。采用異戊烷（4%～5%）吸入對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，隨后腹腔注射5 U/kg 胰島素，10 min 后取心臟。其余小鼠經(jīng)眼眥取血后采用頸部脫臼法處死，取心臟，沖洗、稱重，迅速裝入已標(biāo)記的凍存管中，立即置于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)存至-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.5 血清生化檢測(cè)

采用IPITT 實(shí)驗(yàn)中所取血液，4 ℃下1 100 g 離心15 min獲得血清。采用試劑盒檢測(cè)血清甘油三酯（A110-1，南京建成）和總膽固醇（A111-1，南京建成）含量。

1.6 RNA提取和Real-Time PCR

根據(jù)TRIzol（Invitrogen）方法從30 mg 凍存心肌組織提取總RNA。采用分光光度法測(cè)量RNA 的濃度和純度。引物（表1）根據(jù)NCBI和PrimerBank 設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用TOYOBO FSQ-101 試劑盒從總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用ABI StepOne 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)量，β-actin為內(nèi)參。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

1.7 蛋白定量

取30 mg 心肌組織，冰上剪碎，于裂解液中勻漿。4 ℃下12 000 g 離心20 min，取上清液，BCA 法測(cè)量蛋白濃度后變性。采用10%分離膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜。4 ℃下一抗（表2）孵育過(guò)夜，洗膜后室溫下二抗避光孵育2 h。顯影后采用Alpha FC2 凝膠成像系統(tǒng)掃膜并進(jìn)行灰度值分析，β-actin 為內(nèi)參。

表2 抗體信息Table 2 Antibodies Information

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，統(tǒng)計(jì)軟件為IBM SPSS Statistics 23，繪圖軟件為Graphpad prism 7。組間差異采用雙因素方差分析檢驗(yàn)；糖尿病模型和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)兩個(gè)干預(yù)因素間存在交互作用時(shí)，采用簡(jiǎn)單效應(yīng)分析（least significant difference，LSD）檢測(cè)一個(gè)自變量在另一個(gè)自變量各水平上的差異。小鼠體質(zhì)量和空腹血糖在干預(yù)前后的差異采用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。采用線性回歸對(duì)PPARα 蛋白表達(dá)與Cpt1b、Acadm、Acadvl、Acaa2和Pdk1 的mRNA 表達(dá)間的相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)（R）和P。P＜0.05 表示具有顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟質(zhì)量、血清指標(biāo)和IPITT 的影響

4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組間小鼠心臟質(zhì)量無(wú)顯著差異（圖1）。MC、ME、DC 和DE 組小鼠血清膽固醇變異系數(shù)（coefficience of variation，CV）值分別為8%、13%、25%和22%；MC、ME、DC 和DE 組小鼠血清甘油三酯CV 值分別為13%、22%、13%和18%。盡管個(gè)別CV 值較高，但總體符合小鼠血清指標(biāo)的離散特征。經(jīng)雙因素方差分析檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與MC 組相比，DC 組小鼠血清總膽固醇和甘油三酯含量顯著升高；與DC 組相比，DE 組小鼠血清總膽固醇和甘油三酯含量顯著降低。IPITT 測(cè)試中，DC 組的曲線下面積（AUC）比MC 組顯著增加，DE 組比DC 組顯著降低。上述結(jié)果表明，糖尿病導(dǎo)致小鼠血脂含量增加，胰島素耐量降低，且12 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)上述變化有明顯改善作用。

圖1 小鼠基本特征示意圖Figure 1.Basic Characteristics of the Mice

2.2 各組小鼠體質(zhì)量與空腹血糖的變化

本研究分別在運(yùn)動(dòng)干預(yù)前（適應(yīng)性喂養(yǎng)期）和運(yùn)動(dòng)干預(yù)的最后一周測(cè)量各組小鼠的體質(zhì)量和空腹血糖值。結(jié)果顯示（圖2），運(yùn)動(dòng)干預(yù)前，與MC 組相比，DC 組的體質(zhì)量和空腹血糖均顯著升高。運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，與MC 組相比，DC 組的體質(zhì)量和空腹血糖均顯著升高；與DC 組相比，DE 組的空腹血糖顯著降低。與運(yùn)動(dòng)干預(yù)前相比，運(yùn)動(dòng)干預(yù)后各組小鼠體質(zhì)量均顯著增長(zhǎng)，DC 組和DE 組空腹血糖顯著升高。

圖2 運(yùn)動(dòng)干預(yù)前后，小鼠體質(zhì)量與空腹血糖變化示意圖Figure 2.Changes of Body Weights and Fasting Blood Glucose of Mice Pre and Post Exercise Intervention

2.3 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)心功能相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

本研究檢測(cè)了ANF、BNF、α-MHC、β-MHC、Actc1、Myl2、Itga5 和Caspase-3 共8 種心功能相關(guān)指標(biāo)的基因表達(dá)。結(jié)果顯示，與MC 組相比，DC 組ANF 和BNF 的mRNA表達(dá)顯著降低，且跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著改善db/db小鼠的ANF 表達(dá)（圖3）。與MC 組 相 比，DC 組α-MHC 和β-MHC 的mRNA 表達(dá)呈相反的變化，其中，α-MHC 表達(dá)降低，β-MHC表達(dá)升高；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著增加db/db小鼠的α-MHC 表達(dá)。與MC 組相比，DC 組小鼠心肌Actc1 的mRNA 表達(dá)呈下降的趨勢(shì)（P=0.051），且跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)正常鼠和糖尿病鼠的Actc1 表達(dá)分別有降低和升高的作用。4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組間未見(jiàn)Myl2、Itga5 和Caspase-3 的mRNA 表達(dá)有顯著差異。

圖3 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)心功能相關(guān)基因mRNA的影響Figure 3.Effects of Diabetes and Treadmill Running on mRNA Expression of Genes Related to Cardiac Function

2.4 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)脂肪和糖代謝以及PPARα信號(hào)通路的影響

本研究檢測(cè)了PPARα 的蛋白表達(dá)，以及脂肪代謝相關(guān)酶（Cpt1b、Acadm、Acadvl 和Acaa2），糖代 謝相關(guān)酶（Pdk1、Pdk2）和PPARα 信號(hào)通路關(guān)鍵分子的mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與MC 組相比，DC 組心肌Cpt1b、Acadm、Acadvl 和Acaa2 的mRNA 表達(dá)均顯著升高；與DC 組相比，DE 組心肌中上述指標(biāo)的表達(dá)顯著降低（圖4）。與MC 組相比，DC 組Pdk1 的mRNA 表達(dá)顯著升高；與DC 組相比，DE 組Pdk1 的mRNA 表 達(dá) 顯 著 降 低。PPARα 是 脂 肪代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。與MC 組相比，DC 組PPARα 的蛋白水平顯著升高；與DC 組相比，DE 組PPARα 的蛋白水平顯著降低。與MC 組相比，DC 組CD36、PGC-1β 和Fabp3 的mRNA 水平顯著升高；與DC 組相比，DE 組CD36 的mRNA表達(dá)顯著降低。

圖4 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)脂肪和糖代謝以及PPARα信號(hào)通路影響示意圖Figure 4.Effects of Diabetes and Treadmill Running on Metabolism of Fat and Glucose and PPARα Signaling Pathway

2.5 PPARα與Cpt1b、Acaa2和Acadvl之間的相關(guān)性分析

本研究對(duì)PPARα 的蛋白表達(dá)與Cpt1b、Acadm、Acadvl、Acaa2 和Pdk1 的mRNA 表達(dá)間進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，PPARα 與Acadm（P=0.55）和Pdk1（P=0.20）間不存在線性相關(guān)；PPARα 與Acaa2（P=0.049，R=0.43）和Acadvl（P=0.034，R=0.50）間呈正相關(guān)；PPARα 與Cpt1b 間存在相關(guān)的趨勢(shì)（P=0.072，R=0.40；圖5）。

圖5 PPARα與Acaa2、Acadvl和Cpt1b間的相關(guān)性分析Figure 5.Correlation Analysis among PPARα，Acaa2 and Acadvl and Cpt1b

2.6 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)MG53的mRNA和蛋白表達(dá)水平影響

本研究檢測(cè)了MG53 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與MC 組相比，DC 組MG53 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高；與DC 組相比，DE 組MG53 的mRNA 表達(dá)顯著降低（圖6）。然而，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組間MG53 的蛋白表達(dá)未見(jiàn)顯著差異。

圖6 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)MG53表達(dá)影響示意圖Figure 6.Effects of Diabetes and Treadmill Running on the Expression of MG53

2.7 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌胰島素抵抗的影響

本研究檢測(cè)了胰島素信號(hào)通路中β-IR、IRS1 和AKT的總蛋白，以及急性胰島素刺激下磷酸化蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組間β-IR、IRS1 和AKT 的總蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（圖7）。與MC 組相比，DC 組胰島素刺激下β-IR 和AKT 的磷酸化水平顯著降低，IRS1 的磷酸化水平顯著升高；與DC 組相比，DE 組胰島素刺激下β-IR 和AKT的磷酸化水平顯著升高，IRS1 的磷酸化水平顯著降低。MC 組與DC 組間GLUT4 蛋白表達(dá)未見(jiàn)顯著差異；與DC組相比，DE 組的GLUT4 蛋白水平顯著增加。

圖7 糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌胰島素抵抗影響示意圖Figure 7.Effects of Diabetes and Treadmill Running on Cardiac Insulin Resistance

3 討論

心肌底物代謝異常和胰島素抵抗是糖尿病小鼠心臟的顯著病理特征，然而致其發(fā)生的分子機(jī)制并不完全明確，PPARα 和MG53 在上述過(guò)程中的作用也有待進(jìn)一步探索。本研究中，通過(guò)對(duì)db/db和m/m小鼠實(shí)施12 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，PPARα 參與糖尿病小鼠心肌脂肪代謝異常和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)脂代謝的改善作用。而與預(yù)期不同，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)背景下，MG53 沒(méi)有參與糖尿病心肌胰島素抵抗。

一般認(rèn)為，心臟肥大、糖尿病心肌病以及心力衰竭等疾病或病理狀態(tài)往往伴隨著心臟收縮、舒張功能的變化，同時(shí)，若干相關(guān)基因也表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄異常（如α-MHC 和β-MHC）。α-MHC 基因表達(dá)下調(diào)和β-MHC 基因表達(dá)上調(diào)與心肌收縮功能受到抑制有關(guān)（齊潔 等，2021；Chang et al.，2011； Lasheras et al.，2016；Plante et al.，2015）。本實(shí)驗(yàn)中，可見(jiàn)db/db小 鼠心肌α-MHC 和β-MHC 的mRNA 表達(dá)分別降低和升高，此外，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著緩解了糖尿病所致的α-MHC 轉(zhuǎn)錄下調(diào)。上述結(jié)果表明，db/db小鼠心肌收縮功能可能受損，且跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)其有緩解作用。此外，本研究還檢測(cè)了ANF 和BNF 的mRNA 表達(dá)情況。ANF 和BNF 是心肌細(xì)胞產(chǎn)生的激素，對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞具有抗肥大作用（Gutkowska et al.，2009；Woods，2004）。本研究中，db/db小鼠心肌ANF 和BNF 的mRNA 表達(dá)顯著降低，且跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)改善糖尿病小鼠ANF 的mRNA 表達(dá)。然而，本研究并未對(duì)上述指標(biāo)的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，且對(duì)小鼠心臟質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組間未見(jiàn)顯著差異，因此尚不能判斷db/db小鼠是否存在心肌肥大。最后，本研究還檢測(cè)了Actc1 的表達(dá)水平。Actc1 是編碼α-心肌肌動(dòng)蛋白的基因，與心臟收縮活動(dòng)有關(guān)。研究顯示，db/db小鼠心肌Actc1 的mRNA 表達(dá)有下降的趨勢(shì)（P=0.051），且跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著上調(diào)db/db小鼠的Actc1 表達(dá)，這表明跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可能使db/db小鼠心肌收縮加強(qiáng)，該結(jié)果也與已有證據(jù)相吻合（Cox et al.，2013）。然而，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)下調(diào)了對(duì)照鼠心肌Actc1 的表達(dá)，目前對(duì)此尚無(wú)合理解釋。心功能相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果表明，本研究中db/db小鼠的心功能與2 型糖尿病的病程發(fā)展相吻合，且跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)其有改善作用。然而，本研究的不足之處在于，沒(méi)有采用超聲心動(dòng)圖對(duì)小鼠的心功能進(jìn)行直接測(cè)定，因此，上述基因表達(dá)結(jié)果只能作為間接證據(jù)，支持跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)糖尿病小鼠心功能的正面影響。

有研究表明，糖尿病小鼠存在系統(tǒng)性糖、脂代謝異常，且運(yùn)動(dòng)干預(yù)能改善甚至逆轉(zhuǎn)上述變化（劉軍 等，2020）。本研究中，db/db小鼠血清總膽固醇和甘油三酯含量顯著增加，且跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著降低上述指標(biāo)。其次，db/db小鼠IPITT 結(jié)果的AUC 與對(duì)照鼠相比顯著升高，且在12 周跑臺(tái)訓(xùn)練后顯著降低。此外，db/db小鼠的空腹血糖水平也在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后顯著降低。上述結(jié)果證實(shí)了db/db小鼠存在系統(tǒng)性糖、脂代謝異常，且有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可顯著緩解db/db鼠機(jī)體糖、脂代謝紊亂，并改善其胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

除了系統(tǒng)代謝異常外，糖尿病患者心肌的糖、脂代謝也發(fā)生紊亂，表現(xiàn)為幾乎完全倚賴脂肪酸氧化以供能（田閣 等，2018）。本研究檢測(cè)了小鼠心肌中脂肪氧化相關(guān)酶的mRNA 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)db/db小鼠心肌Cpt1b、Acadm、Acadvl和Acaa2 的mRNA 表達(dá)上調(diào)，且12 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著抑制Cpt1b、Acadm、Acadvl 和Acaa2 的表達(dá)。上述結(jié)果表明，長(zhǎng)期有氧訓(xùn)練能有效逆轉(zhuǎn)糖尿病胰島素抵抗所致的脂肪酸代謝紊亂。在脂肪氧化供能增加的同時(shí)，糖尿病心肌中葡萄糖代謝也受到抑制。事實(shí)上，基于人類被試的研究顯示，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)濃度與胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)（Krssak et al.，1999）。脂肪酸氧化增加會(huì)激活PDK，隨后磷酸化并抑制PDH（曾芳桂，2017；Lee et al.，2017）。本研究中，可見(jiàn)db/db小鼠心肌Pdk1 的mRNA 表達(dá)顯著增加，這可能由脂肪酸氧化增多所致；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可顯著下調(diào)Pdk1的mRNA 表達(dá)，表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)心肌糖代謝紊亂的保護(hù)作用。此外，本研究還探索了心肌GLUT4 的變化，這是對(duì)心肌葡萄糖攝取能力的直觀反映。一般認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌代謝的保護(hù)作用部分是通過(guò)GLUT4 的上調(diào)實(shí)現(xiàn)的（許瀚 等，2020；Lehnen et al.，2010； Schaun et al.，2017）。本研究中，12 周跑臺(tái)訓(xùn)練誘導(dǎo)db/db小鼠心肌GLUT4 的蛋白水平上調(diào)。然而，對(duì)照組小鼠心肌GLUT4 的表達(dá)并未因運(yùn)動(dòng)發(fā)生變化，且這與以往的發(fā)現(xiàn)相一致（Osborn et al.，1997）。對(duì)上述結(jié)果的分析認(rèn)為，這可能是由于對(duì)照組小鼠的GLUT4 水平已經(jīng)處于正常范圍，因此不會(huì)因運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練而進(jìn)一步上調(diào)。此外，還有一種可能的原因——由于對(duì)照組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力較高，因此同樣的運(yùn)動(dòng)刺激不足以誘導(dǎo)其心肌GLUT4 水平發(fā)生變化。

2 型糖尿病動(dòng)物模型往往表現(xiàn)為心肌脂肪酸攝取、氧化增加，一般認(rèn)為這主要是由血清脂肪酸、甘油三酯水平升高，以及PPARα 活動(dòng)增強(qiáng)所致（Bugger et al.，2014）。PPARs 是核脂質(zhì)激活受體，調(diào)控脂質(zhì)代謝通路的諸多基因（Francis et al.，2003）。在PPARs 的3 種亞型中，PPARα 在肝臟、心臟和骨骼肌中高度表達(dá)，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控脂肪酸代謝相關(guān)酶調(diào)節(jié)脂質(zhì)和能量穩(wěn)態(tài)。目前，PPARα 在肥胖、高脂膳食（high-fat diet，HFD）等引起的肝臟病變（如非酒精性脂肪肝）中的作用已得到證實(shí)，然而鮮見(jiàn)其在心臟中的作用研究。此外，盡管基于轉(zhuǎn)基因模型的研究認(rèn)為PPARα 過(guò)表達(dá)可模擬糖尿病心肌病變（Finck et al.，2003），然而也有證據(jù)顯示，有些研究中糖尿病大鼠心肌可見(jiàn)PPARα 表達(dá)升高（Lee et al.，2010）。上述矛盾結(jié)果的產(chǎn)生可能與模式鼠所處的糖尿病階段不同有關(guān)。Saunders 等（2008）認(rèn)為，糖尿病早期可見(jiàn)心肌PPARα 表達(dá)上調(diào)，所致的脂肪酸氧化增強(qiáng)有利于維持心肌能量代謝。然而，在糖尿病晚期，心肌細(xì)胞對(duì)脂肪酸的過(guò)量攝取導(dǎo)致PPARα表達(dá)下調(diào)，同時(shí)PPAR-γ 表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞脂毒性加重。本研究發(fā)現(xiàn)，19 周齡db/db小鼠心肌PPARα 表達(dá)顯著上調(diào)。此外，在對(duì)PPARα 靶基因［FAT、CD36、FABP和肌肉CPT1 等］的表達(dá)水平做進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，此階段db/db小鼠心肌CD36、PGC-1β 和Fabp3 的mRNA 表達(dá)均顯著上調(diào)，且12 周跑臺(tái)訓(xùn)練能降低db/db小鼠PPARα 和CD36的表達(dá)，這表明PPARα 信號(hào)通路參與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)db/db小鼠心肌代謝紊亂的改善作用。此外，相關(guān)性分析的結(jié)果也佐證了PPARα 對(duì)脂質(zhì)代謝的正調(diào)控作用。

作為導(dǎo)致糖尿病心肌病變的另一重要因素，胰島素信號(hào)通路受損在本研究中也表現(xiàn)明顯，其中，db/db小鼠心肌AKT 磷酸化受到抑制。此外，12 周跑臺(tái)訓(xùn)練顯著改善了p-β-IR、p-IRS1 和p-AKT 的表達(dá)，表明有氧訓(xùn)練保護(hù)并改善糖尿病心肌受損的胰島素信號(hào)通路。在調(diào)控胰島素信號(hào)通路的一系列因子中，MG53 是近年備受關(guān)注。已有證據(jù)顯示，MG53 參與一系列生理、病理過(guò)程，包括心肌和骨骼肌膜修復(fù)、心肌缺血預(yù)適應(yīng)以及調(diào)控胰島素敏感性等（Zhang et al.，2016）。然而，在體環(huán)境中MG53 是否參與介導(dǎo)胰島素抵抗尚存爭(zhēng)議。Song 等（2013）認(rèn)為，db/db小鼠骨骼肌中可見(jiàn)MG53 表達(dá)上調(diào)，而Yi 等（2013）認(rèn)為db/db小鼠MG53 表達(dá)與對(duì)照組未存在顯著差別，對(duì)ob/ob小鼠及2 型糖尿病患者的骨骼肌樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，也未發(fā)現(xiàn)其MG53 的蛋白表達(dá)與各自對(duì)照組間存在顯著差異。此外，盡管目前鮮見(jiàn)探索運(yùn)動(dòng)對(duì)MG53 影響的研究，但總體證據(jù)支持運(yùn)動(dòng)干預(yù)下調(diào)胰島素抵抗骨骼肌中MG53 的表達(dá)。例如，8 周游泳運(yùn)動(dòng)能通過(guò)下調(diào)大鼠MG53 的mRNA 和蛋白表達(dá)分別改善HFD 及2 型糖尿病引起的骨骼肌胰島素抵抗（唐艷婕 等，2014； Qi et al.，2016）。盡管如此，運(yùn)動(dòng)干預(yù)如何影響胰島素抵抗心肌的MG53 表達(dá)尚無(wú)定論。本研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠心肌MG53的mRNA 表達(dá)顯著增加，且12 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)能逆轉(zhuǎn)此變化。然而，無(wú)論是糖尿病還是運(yùn)動(dòng)干預(yù)均未影響MG53 的蛋白水平。結(jié)合本研究中糖尿病和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素抵抗的顯著影響得出：在當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)設(shè)定下，MG53 未參與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)db/db小鼠心肌胰島素抵抗的改善作用。

綜上所述，12 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能顯著改善db/db小鼠心肌底物代謝紊亂和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，且PPARα 信號(hào)通路在糖尿病心肌糖、脂代謝異常中具有重要作用。