市售酶抑制-比色法農(nóng)殘速測(cè)試劑盒對(duì)多種農(nóng)藥敏感性的研究

河南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心 喬禮

鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心 羅俊霞

酶抑制法農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)試劑盒是基于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)動(dòng)物體內(nèi)膽堿酯酶的抑制作用研制的。進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在膽堿酯酶及其底物（乙酰膽堿）的共存體系中加入農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液，當(dāng)樣品中含有不同濃度的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥時(shí)，酶活性受到不同程度抑制，乙酰膽堿被酶催化水解的程度發(fā)生變化，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑的變色反應(yīng)亦隨之發(fā)生變化；反之，如果試樣提取液中未含有該兩類農(nóng)藥，酶的活性不被抑制，試樣中加入的底物被酶催化水解，其產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)的變色程度較大。目測(cè)顏色的變化或用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度在一定時(shí)間內(nèi)的變化值，計(jì)算出抑制率，可以粗略判斷樣品中是否含有該兩類農(nóng)藥殘留。該方法的核心試劑是酶，而酶來源廣泛，不同來源及來源于同一生物體不同部位的酶活性均不相同，對(duì)農(nóng)藥的敏感性也存在較大差異，由此衍生出的兩種快速檢測(cè)試劑盒對(duì)農(nóng)藥的敏感性也各不相同，因此在日常檢測(cè)工作中應(yīng)用該方法的檢測(cè)結(jié)果同樣品實(shí)際時(shí)常不符，出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。為了全面了解市售酶抑制-比色法農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)試劑盒的品質(zhì)，使其在農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)與監(jiān)管工作中發(fā)揮更大作用，特安排本試驗(yàn)，以期為使用者提供一定的借鑒作用。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)儀器

上海復(fù)博農(nóng)業(yè)科技有限公司、上海博納新技術(shù)研究所生產(chǎn)的16 通道、CL-BIII 型農(nóng)殘速測(cè)儀；杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)的SHA-C 型、雙重恒溫水浴振蕩器；WH-861 型旋渦混合器；北京三二八科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的HH.W21-Cr 420 型電熱恒溫水浴鍋；Thermo 品牌的200μL 和Rongtai 品牌的 5 mL 移液槍。

（二）試劑及其配制方法

1. 產(chǎn)自深圳的永道品牌的酶抑制-比色法農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)試劑盒；試驗(yàn)用水為純凈水；使用前，采用500 mL 的純凈水溶解緩沖鹽得到緩沖溶液；使用3 mL的緩沖溶液配制酶和顯色劑；使用3 mL 的純凈水配制底物。

2.農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品。辛硫磷、喹硫磷、敵敵畏、氧化樂果、毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲、伏殺硫磷、蠅毒磷、水胺硫磷、倍硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷22 種有機(jī)磷類農(nóng)藥和涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威、涕滅威砜5 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1000 mg·L-1，來源于農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所，使用時(shí)先稀釋成80 μg· mL-1的儲(chǔ)備液，試驗(yàn)時(shí)按照需要進(jìn)行吸取。

（三）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分別取適量農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品于一次性燒杯中，按照2 g 稱樣量，使農(nóng)藥的質(zhì)量濃度分別為0.05 mg·kg-1、0.5 mg·kg-1、1 mg·kg-1、2 mg·kg-1、3 mg·kg-1，每 一種農(nóng)藥設(shè)5 個(gè)濃度梯度；每個(gè)濃度水平3 次重復(fù)。

1.測(cè)試方法。對(duì)照液和農(nóng)藥測(cè)試：對(duì)照液和農(nóng)藥的測(cè)試方法參照國(guó)標(biāo)進(jìn)行；設(shè)定2.5 mL 和3 mL 兩種樣品提取體積。分別移取2.5 mL 和3 mL 的緩沖溶液和樣品提取液于10 mL 一次性試管中，再依次加入100μL 酶、100μL 顯色劑，旋渦混勻，在37℃條件下水浴10 min，之后加入100μL 底物搖勻，將對(duì)照液和樣品同時(shí)放入16 通道的CL-BIII 型農(nóng)殘速測(cè)儀比色池中進(jìn)行檢測(cè)（對(duì)照液放第一通道）；儀器根據(jù)第一通道測(cè)定的對(duì)照3 min內(nèi)吸光度的變化值自動(dòng)計(jì)算得到抑制率，記錄抑制率。

2.數(shù)據(jù)處理。選取5 種農(nóng)藥在各濃度水平下3 次測(cè)定所得抑制率的加權(quán)平均值在0～100%的濃度值，用Excel 將抑制率和農(nóng)藥濃度常用對(duì)數(shù)的散點(diǎn)圖進(jìn)行線性擬合，得到濃度-效應(yīng)曲線方程、求出相關(guān)系數(shù)及每一種農(nóng)藥對(duì)各種試劑盒的半抑制濃度IC50。根據(jù)濃度-效應(yīng)曲線方程y=kx+b求得y=50%時(shí)對(duì)應(yīng)的x軸的值，IC50=10x；線性范圍是指抑制率為0 對(duì)應(yīng)最大的濃度值到測(cè)定的最大的抑制率對(duì)應(yīng)的濃度值之間的范圍；同樣求出IC10。

因食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定新鮮蔬菜中毒死蜱、甲基對(duì)硫磷、氧化樂果的最大限量分別為0.05 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1、0.02 mg·kg-1，個(gè)別試劑盒測(cè)定這3 種農(nóng)藥的IC50的最大值分別為6.70 mg·kg-1、9.924 mg·kg-1、10.397 mg·kg-1，其對(duì)應(yīng)的IC10的值分別為0.940 mg·kg-1、1.620 mg·kg-1、2.781 mg·kg-1，均大于國(guó)家的限量標(biāo)準(zhǔn)，因此，本試驗(yàn)將IC10設(shè)定為試劑盒的檢測(cè)限，以此比較不同的試劑盒對(duì)不同農(nóng)藥的敏感性；IC10越低，說明試劑盒對(duì)該農(nóng)藥越敏感。當(dāng)IC10＜10-3mg·kg-1，試劑盒對(duì)農(nóng)藥極敏感；當(dāng)10-3mg·kg-1＜ IC10＜ 10-1mg·kg-1，試劑盒對(duì)農(nóng)藥較敏感；當(dāng)10-1mg·kg-1＜IC10＜1 mg·kg-1，試劑盒對(duì)農(nóng)藥不太敏感；當(dāng)IC10≥1 mg·kg-1，試劑盒對(duì)農(nóng)藥不敏感。

通過試驗(yàn)的結(jié)果比較2.5 mL 和3 mL 的樣品提取體積對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響和該試劑盒對(duì)不同的有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性。

二、結(jié)果與分析

經(jīng)過測(cè)定，試劑盒測(cè)定蠅毒磷和甲基異柳磷，當(dāng)提取液取用3 mL 時(shí)，抑制率同農(nóng)藥濃度之間不存在線性關(guān)系，當(dāng)提取液取用2.5 mL 時(shí)，在農(nóng)藥5 個(gè)濃度水平下，抑制率均為0。無論樣品提取液取用3 mL 還是2.5 mL，測(cè)定水胺硫磷和倍硫磷，抑制率同農(nóng)藥濃度之間不存在線性關(guān)系；伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷7 種農(nóng)藥，在5 個(gè)濃度水平下，抑制率均為0。也就是說該試劑盒對(duì)蠅毒磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、倍硫磷、伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷11 種農(nóng)藥極不敏感。

（一）取用3 mL 樣品提取液試驗(yàn)

由表1 知，當(dāng)提取液取用3 mL 時(shí)，試劑盒對(duì)16 種農(nóng)藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、辛硫磷、涕滅威、喹硫磷、涕滅威砜、敵敵畏、氧化樂果、毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲的順序依次降低。試劑盒對(duì)涕滅威亞砜、克百威農(nóng)藥極為敏感，其IC10均在10-3mg·kg-1以下，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的7.41 %；試劑盒對(duì)滅多威、辛硫磷、涕滅威、喹硫磷4 種農(nóng)藥較為敏感，其IC10均在10-3～10-1mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的14.81%；試劑盒對(duì)涕滅威砜、敵敵畏、氧化樂果3 種農(nóng)藥不太敏感，其IC10在 10-1～1 mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的11.11%；試劑盒對(duì)毒死蜱、久效磷、三唑磷、殺撲磷、二嗪磷、馬拉硫磷、敵百蟲極不敏感，其IC10在1 mg·kg-1以上，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的25.93%，總體上講，試劑盒極不敏感的農(nóng)藥占所測(cè)試農(nóng)藥的66.67%。

表1 提取液取用3 mL 時(shí)試劑盒對(duì)16 種農(nóng)藥的敏感性對(duì)照

（二）取用2.5 mL 樣品提取液試驗(yàn)

由表2 可知，當(dāng)提取液取用2.5 mL 時(shí)，試劑盒對(duì)16 種農(nóng)藥的敏感性按照涕滅威亞砜、克百威、滅多威、涕滅威、喹硫磷、涕滅威砜、敵敵畏、辛硫磷、氧化樂果、久效磷、毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、伏殺硫磷、馬拉硫磷、敵百蟲、殺撲磷的順序依次降低。試劑盒對(duì)涕滅威亞砜、克百威農(nóng)藥極為敏感，其IC10均在10-3mg·kg-1以下，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的7.41 %；試劑盒對(duì)滅多威、涕滅威、喹硫磷3 種農(nóng)藥較為敏感，其IC10均在 10-3～10-1mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的11.11%；試劑盒對(duì)涕滅威砜、敵敵畏、辛硫磷、氧化樂果4 種農(nóng)藥不太敏感，其IC10在10-1～1 mg·kg-1，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的14.81%；試劑盒對(duì)久效磷、毒死蜱、三唑磷、二嗪磷、伏殺硫磷、馬拉硫磷、敵百蟲、殺撲磷極不敏感，其IC10在1 mg·kg-1以上，占所測(cè)試農(nóng)藥總數(shù)的29.63%，總體上講，試劑盒極不敏感的農(nóng)藥占所測(cè)試農(nóng)藥的66.67%

表2 提取液取用2.5 mL 時(shí)試劑盒對(duì)16 種農(nóng)藥的敏感性對(duì)照

三、結(jié)論與討論

從IC10看，在所測(cè)試的27 種農(nóng)藥中，試劑盒對(duì)蠅毒磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、倍硫磷、伏殺硫磷、丙溴磷、樂果、地蟲磷、甲拌磷、甲基對(duì)硫磷、對(duì)硫磷11種農(nóng)藥極不敏感，測(cè)定時(shí)樣品提取液無論是取用3 mL還是2.5 mL，在設(shè)定的5 個(gè)農(nóng)藥濃度水平下，抑制率 為0或者抑制率同農(nóng)藥濃度之間無線性關(guān)系。在用該試劑 盒測(cè)定實(shí)際樣品時(shí)，當(dāng)樣品中含有這11 種農(nóng)藥中的任意一種或者幾種（在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量中規(guī)定的限量以上、在3 mg·kg-1以下），用該試劑盒測(cè)定將出現(xiàn)假陰性；當(dāng)樣品中含有涕滅威亞砜，其含量大于2.041 7×10-4mg·kg-1、小于食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量中規(guī)定的限量時(shí)，用該試劑盒測(cè)定將出現(xiàn)假陽性。因此，試劑盒對(duì)各農(nóng)藥敏感性的巨大差異是導(dǎo)致試劑盒檢測(cè)樣品出現(xiàn)假陽性和假陰性的原因之一。

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的規(guī)定，采用永道試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照50%的判定閾值進(jìn)行判定，在所測(cè)定的27 種農(nóng)藥中，只有當(dāng)樣品中含有涕滅威砜、克百威時(shí)可以報(bào)出陽性，含有其他25種農(nóng)藥均只能報(bào)出陰性，因此，建議國(guó)標(biāo)和行標(biāo)修改判定閾值。