冰菜多糖提取物的抗氧化性及抑菌活性研究

楊宗芬，王敏，王貞利，王海鳳，王俊斌,c,通信作者

（天津農(nóng)學院 a.基礎科學學院，b.農(nóng)業(yè)分析測試中心，c.化學實驗教學中心，天津 300392）

冰菜（Mesembryanthemum crystallinum）又稱冰葉日中花、冰花，原產(chǎn)非洲南部，由于其莖、葉表面富含礦物質(zhì)的囊狀細胞，在太陽光照射下，反射光線像冰晶一樣，因此得名。冰菜具有非常獨特的口感和較高的營養(yǎng)價值，不僅富含氨基酸、抗酸化物等機能性高的物質(zhì)，還含有鈉、鉀、胡蘿卜素等礦物質(zhì)[1]。而且冰菜富含松醇、芒柄醇和肌醇，肌醇可以促進脂肪代謝、預防脂肪肝和動脈硬化，減少膽固醇、防止脫發(fā)、改善濕疹等。松醇具有降低血糖的效果，有一定的藥用價值[2]。冰菜中的天然植物鹽是一種低鈉鹽，對人體的新陳代謝有促進作用，同時還可以預防糖尿病。由于這些優(yōu)良特性，冰菜已成為一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d保健蔬菜，市場前景廣闊。

多糖（Polysaccharide），即多聚糖，是由超過10個單糖分子經(jīng)脫水縮合以糖苷鍵結合的高分子聚合化合物。植物多糖能夠有效參與調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，具有降低血糖血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒及抗衰老等多種藥理活性[3-6]。例如在海藻中提取的多糖可以抑制癌細胞的增殖等[7]。植物多糖也是一種比較普遍的藥用成分，具有重要的應用潛力和價值[8]。科學家們對芡實多糖[9]、薺菜多糖[10]、見血青多糖[11]等植物活性成分進行研究表明，這些多糖類物質(zhì)具有抗病毒、抗腫瘤、抑菌、降血糖血脂和抗血栓等生理活性和免疫調(diào)節(jié)活性[12-13]。植物多糖來源廣泛、提取成本較低、對機體的毒性較低等特點，近年來，越來越受到人們的重視及關注。但是，目前關于冰菜多糖的抗氧化及抑菌活性的研究還很少。

本研究以新鮮冰菜為原料，利用超聲波輔助法提取多糖，對冰菜多糖提取物的抗氧化及抑菌活性進行研究，可以為冰菜中生物活性物質(zhì)提取及未來進一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮冰菜洗凈后用吸水紙吸干，50 ℃烘干至恒重，粉碎后過篩。試劑均為分析純。儀器：Elma P120H超聲儀、T6新世紀紫外可見分光光度計、其他常規(guī)分析儀器。試驗菌種：枯草桿菌、大腸桿菌，由天津農(nóng)學院生物化學實驗室保存。

1.2 冰菜多糖的提取及含量測定

參照熊斌等[14]的方法，以吸光度為縱坐標y，葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標x，繪制葡萄糖標準曲線如圖1，進行線性擬合后得到方程：y＝15.129 0x－0.001 1，R2＝0.995 6。參照文獻[15-16]的方法對冰菜多糖進行提取。稱取若干冰菜粉末，以1∶20的料液比加入蒸餾水，在60 ℃的條件下用超聲波提取儀在功率200 W作用60 min，然后過濾離心（4 200 r/min，10 min），除去濾渣。并對提取液依次進行脫色（提取液中加入1%的活性炭，不斷攪拌30 min，離心過濾，去濾渣）、脫蛋白（上清液中加入 15%的三氯乙酸，4 ℃靜置過夜，離心過濾，去濾渣）、濃縮醇沉（用無水乙醇倒入脫蛋白后的上清液中至無水乙醇濃度為 80%，醇沉12 h，過濾），沉淀物50 ℃干燥至恒重。取適量提取物粉末用蒸餾水定容至100 mL，得冰菜多糖提取液。取提取液2 mL，測定方法同標準曲線，依據(jù)線性回歸方程求得提取液中多糖的濃度，冰菜多糖百分含量按照下式計算：

圖1 葡萄糖標準曲線

多糖含量（%）＝（C×V×D）/M×100

式中，C為待測液的質(zhì)量濃度（mg/mL），V為待測液的體積（mL），D為稀釋倍數(shù)，M為樣品的質(zhì)量（mg）。

1.3 羥基自由基清除率的測定

參考銀喆等[17]的方法。將多糖溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的冰菜多糖提取液。依次取6.0 mmol/L FeSO4溶液、6.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、冰菜多糖提取液及6.0 mmol/L H2O2溶液各2 mL于試管中，混合均勻后在37 ℃下反應30 min，于510 nm處測定其吸光度，記為A1。用2.0 mL蒸餾水代替冰菜多糖提取液測定其吸光度，記為A0。用2.0 mL蒸餾水代替H2O2溶液測定其吸光度，記為A2。

同時以維生素C作為陽性對照，按下列公式計算羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率（%）＝[1－（A1－A2）/A0]×100

1.4 DPPH自由基清除率的測定

參考文獻[18]的方法。將多糖溶液配制成質(zhì)量濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的冰菜多糖提取液。在試管中依次加入冰菜多糖提取液1 mL、濃度為0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2.5 mL，避光反應30 min，在517 nm處測定其吸光度，記為A0。取2.5 mL無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測定其吸光度，記為A1。取2.5 mL DPPH乙醇溶液與1.0 mL乙醇混合，測定其吸光度，記為A2。

同時以維生素C作為陽性對照，按下列公式計算清除率：

DPPH 清除率（%）＝[1－（A0－A1）/A2]×100

1.5 總還原能力的測定

參考文獻[19]的方法，將多糖溶液配制成質(zhì)量濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的冰菜多糖提取液。在10 mL離心管中分別依次加入0.2 mol/L pH為6.6的磷酸緩沖液2.5 mL、冰菜多糖提取液1 mL、1% 鐵氰化鉀2.5 mL?；旌暇鶆蚝笤?0 ℃水浴鍋中反應20 min，取出后加入10%三氯乙酸2.5 mL終止反應，在離心機中5 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL于試管中，再依次加入蒸餾水2.5 mL、FeCl30.5 mL，混合均勻后靜止10 min，并在700 nm處測定其吸光度。同時以維生素C作為陽性對照。

1.6 亞硝酸根離子清除率的測定

參照文獻[20]的方法，將多糖溶液配制成質(zhì)量濃度分別為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的冰菜多糖提取液。準確吸取5 μg/mL NaNO2溶液2 mL于25 mL的容量瓶中，加入冰菜多糖提取液1 mL，在25 ℃下放置30 min，再加入4 mg/mL 的對氨基苯磺酸溶液2 mL，混勻，靜置在25 ℃下5 min，加入2 mg/mL鹽酸萘乙二胺溶液1 mL ，加水至刻度。25 ℃放置15 min，并于538 nm處測定吸光度，記為A0。按上述方法測定其不加冰菜多糖提取液時NaNO2的吸光度，記為A1。按上述方法測定不加 NaNO2溶液時冰菜多糖提取液的吸光度，記為A2。

同時以維生素C作為陽性對照，按下列公式計算清除率：

亞硝酸根離子清除率（%）＝[1－（A0－A1）/A2]×100

1.7 油脂氧化抑制率的測定

采用文獻[21]的測定方法，以雞油和菜籽油作為動物油和植物油樣品。稱取2 g油樣，加入一定量的冰菜多糖提取物，45 ℃下恒溫24 h。處理過的混合油樣 1 mL加入 2 mL 20%的三氯乙酸和2 mL 0.6%的硫代巴比妥酸，在沸水浴下20 min，取出冷卻后加入5 mL三氯甲烷，充分混勻，離心后取上清液在532 nm下測定其吸光度，記為A1。以蒸餾水代替樣品測定吸光度，記為A0。

同時以維生素C作為陽性對照，按下列公式計算抑制率：

抑制率（%）＝（A0－A1）/A0×100

1.8 抑菌活性測定

配制含量為0.25、0.50、1.0、1.5、2.5 mg/mL的冰菜多糖提取液，利用濾紙片法[22]進行抑菌試驗。將定性濾紙制成6 mm圓形濾紙片，121 ℃滅菌20 min，觀察冰菜多糖提取液對大腸桿菌和枯草桿菌的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法，經(jīng)計算冰菜提取物中多糖百分含量為11.21%（干重）。表明在料液比1∶20、提取溫度60 ℃，超聲提取60 min的條件下適合提取冰菜多糖。

2.2 冰菜多糖提取物的抗氧化能力

2.2.1 冰菜多糖提取物對羥基自由基的清除作用

由圖2可以看出，冰菜多糖提取物的質(zhì)量濃度從0.02 mg/mL上升到0.10 mg/mL時，對羥基自由基的清除能力也隨之增加，在質(zhì)量濃度為 0.10 mg/mL時，清除能力為73.93%。結果表明冰菜多糖提取物對羥基自由基具有較高的清除效果，清除率與提取物質(zhì)量濃度成正相關。與維生素C對照組相比，冰菜多糖提取物對羥基自由基的清除能力略低。

圖2 冰菜多糖提取物對羥基自由基的清除作用

2.2.2 冰菜多糖提取物對DPPH自由基的清除作用

從圖3可知，隨著冰菜多糖提取物質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH自由基的能力也隨之增加，但清除能力相比維生素C對照組較弱。在質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時，清除率達到最高，為34.75%。結果表明DPPH清除率與提取物質(zhì)量濃度成正相關，說明冰菜提取物具有一定的清除DPPH自由基能力。

圖3 冰菜多糖提取物對DPPH自由基的清除作用

2.2.3 冰菜多糖提取物的總還原能力

測定總還原能力時，其吸光度值越大表示還原能力越強，即抗氧化性越強。由圖4可知，在0.02～0.10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，冰菜多糖提取物總還原能力與吸光度呈線性關系，當樣品質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時，吸光度為0.265，表明冰菜多糖提取物具有一定的還原能力。結果也表明，冰菜多糖提取物的總還原能力低于維生素C。

圖4 冰菜多糖提取物的總還原能力

2.2.4 冰菜多糖提取物對亞硝酸根離子的清除作用

如圖5所示，冰菜多糖提取物在質(zhì)量濃度為0.02～0.10 mg/mL之間時，隨著質(zhì)量濃度增加，其對亞硝酸根離子清除能力也逐漸增加，當提取物質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時，亞硝酸根離子清除能力為36.73%。并且冰菜多糖提取物對亞硝酸根離子清除能力高于維生素C對照組。這表明冰菜多糖提取物對亞硝酸根離子有較強的清除能力。

圖5 冰菜多糖對亞硝酸根離子的清除作用

2.3 冰菜多糖提取物對油脂氧化的抑制效果

由圖6可知，隨著冰菜多糖提取物添加量的不斷增加，其對氧化產(chǎn)物丙二醛的抑制率也逐步增大，但都略低于維生素C的抑制率。當多糖提取物的添加量在 1.50%時，對植物油氧化的抑制率為71.81%，對動物油氧化的抑制率為57.64%。研究結果表明，冰菜多糖提取物對植物油和動物油的氧化都有一定程度的抑制作用，對植物油的氧化抑制效果強于對動物油的氧化抑制效果。

圖6 冰菜多糖提取物對油脂的抗氧化效果

2.4 冰菜多糖提取物的抑菌能力

冰菜多糖提取物對大腸桿菌、枯草桿菌的抑菌試驗效果見表1。結果表明，在所測試的范圍內(nèi)，冰菜多糖提取物對兩種菌均有不同程度的抑制作用，對枯草桿菌的抑制作用更強，且隨質(zhì)量濃度增大抑制效果增強。在質(zhì)量濃度低于1.00 mg/mL時，提取物的抑菌效果不明顯或沒有抑菌效果。在2.00 mg/mL最大質(zhì)量濃度下，對枯草桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為（12.10±0.30）和（10.40±0.35）mm。

表1 冰菜多糖提取物的抑菌圈直徑 mm

3 討論與結論

冰菜作為一種新型特色蔬菜，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。國內(nèi)外一些研究者對冰菜提取物中的活性成分進行的研究表明：冰菜具有良好的抗氧化活性，能有效清除體內(nèi)自由基，抑制脂質(zhì)過氧化及保護機體生物大分子[23-24]。大量研究表明，植物多糖具有增強免疫力、抗腫瘤、抑菌、抗氧化等作用[25]。以往文獻報道，羊棲菜、黃花菜、莼菜等植物中多糖能有效清除DPPH、超氧陰離子和羥基自由基[26-28]。本研究利用超聲波輔助法對冰菜多糖進行提取和測定，研究冰菜多糖提取物的抗氧化和抑菌活性。限于試驗時間和條件，未對冰菜多糖提取物進行純化，獲得的只是粗提物，因此多糖含量較低。未來進一步研究可以采用大孔樹脂法、溶劑萃取法和沉淀法等方法，提高冰菜提取物中的多糖純度。

本試驗采用DPPH自由基和羥基自由基清除率來評價冰菜多糖提取物的抗氧化活性，結果表明，冰菜多糖提取物具有較強清除自由基的能力。同時，冰菜多糖提取物也具有很強的清除亞硝酸離子的能力和一定的總還原力。在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，冰菜多糖提取物對油脂氧化的抑制能力與濃度成正相關。此外，冰菜多糖提取物對細菌呈現(xiàn)出不同程度的抑制活性，并且對革蘭氏陽性菌（枯草桿菌）的抑菌作用大于革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）。本研究結果表明，冰菜多糖提取物具有一定的抗氧化及抑菌活性，為人們進一步認識冰菜的營養(yǎng)價值提供了參考依據(jù)。