液相色譜法檢測雞肉中芬苯達唑及其代謝物殘留

趙欣然 ，齊文婷 ，張偉 ，通信作者

（1.天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；2.天津藥物研究院，天津 300450）

芬苯達唑（Fenbendazole）屬于苯并咪唑類（Ben zimidazoles）藥物，對胃腸道線蟲、網(wǎng)尾線蟲、片形吸蟲和絳蟲均有良好的驅(qū)蟲效果[1]。與苯并咪唑類其他藥物相同，芬苯達唑通過破壞微管蛋白組裝聚合，引起蟲體代謝障礙，導(dǎo)致生長發(fā)育受阻，甚至引起寄生蟲死亡[2]。作為抗寄生蟲藥，芬苯達唑具有驅(qū)蟲譜廣、效果好、毒性低等特點，廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)和人醫(yī)臨床。另外，芬苯達唑還是一種潛在的抗癌藥[3-4]。芬苯達唑的代謝產(chǎn)物為芬苯達唑砜（Fenbendazole Sulphone）和芬苯達唑亞砜（Fenbendazole Sulphoxide）。芬苯達唑亞砜又被稱為奧芬達唑（Oxfendazole），也具有驅(qū)蠕蟲作用，活性比芬苯達唑強，驅(qū)蟲譜與芬苯達唑相同[1]。奧芬達唑和芬苯達唑可以相互轉(zhuǎn)化，但是芬苯達唑砜不能進行再代謝[5]。其分子式如圖1所示。

圖1 芬苯達唑及其代謝物的化學(xué)式圖

芬苯達唑和奧芬達唑具有致畸作用，且殘留于動物機體的藥物可以隨食物鏈對人體造成傷害。各國均設(shè)定了動物性食品中該類物質(zhì)的殘留限量[6-7]。

目前，檢測芬苯達唑及其代謝物殘留的方法有氣相色譜[8-9]、液相色譜[10-11]、液質(zhì)聯(lián)用[12-14]，ELISA[15]等方法。液質(zhì)聯(lián)用具有檢測限低、同時可檢測多種藥物殘留的特點[12-14]，但是液質(zhì)聯(lián)用的價錢非常高，不適合基層使用。氣相色譜的靈敏度不高，且芬苯達唑及其衍生物的檢測需要進行衍生化，因此逐漸被高靈敏度、高特異性的檢測器所代替。ELISA的假陽性較多，且檢測限偏高。

本文采用 SPE-HPLC（紫外檢測器）檢測雞肉中芬苯達唑及其代謝物殘留。方法簡單可行，可滿足殘留檢測，適用于基層動物組織中芬苯達唑及其代謝物殘留檢測。

1 材料

1.1 試驗材料

取雞肉，絞碎，勻漿，-20 ℃冷凍保存。

1.2 藥品和試劑

乙腈和甲醇，色譜純，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；芬苯達唑、芬苯達唑砜、奧芬達唑，色譜純，均購自SIGMA公司；乙酸銨和無水硫酸鈉，色譜純，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯和正己烷，分析純，均購自天津市光復(fù)科技發(fā)展公司；磷酸，分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司；二甲基亞砜，分析純，購自天津博迪化工股份有限公司；純凈水，購自娃哈哈公司； C18固相萃取柱，購自大連中譜科技有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀配紫外檢測器（Agilent-1260）購自安捷倫科技有限公司；ODS-3色譜柱（5 μm，4.6 mm×250.0 mm）購自島津企業(yè)管理（中國）有限公司；氮吹儀（DC-12）購自上海安譜實驗科技股份有限公司；微型漩渦混合儀（WH-2）購自上海滬西分析儀器廠；恒溫水浴鍋（DC-12H）購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.4 標準溶液配置

標準儲備液: 取芬苯達唑、芬苯達唑砜、奧芬達唑10 mg，置于10 mL容量瓶，加入0.5 mL二甲基亞砜，然后加入甲醇定容，配制成濃度為1 mg/mL的混合溶液。

標準工作液：用流動相（乙腈∶5 mol/L乙酸銨水溶液＝1∶1）將芬苯達唑、芬苯達唑砜和奧芬達唑的儲備液稀釋，配制成濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL 的標準溶液。

2 試驗方法

2.1 色譜條件

ODS-3色譜柱（5 μm，4.6 mm×250.0 mm），流動相A相為5 mol/L乙酸銨水溶液，B相為乙腈。流速為0.8 mL/min，檢測波長為294 nm，柱溫為20 ℃，進樣量為20 μL，洗脫程序見表1。采用外標法定量。

表1 梯度洗脫條件

2.2 線性試驗

分別精密量取 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL濃度的標準工作液20 μL，按照2.1液相色譜條件，進行分析，每個濃度進樣3次。分別以芬苯達唑、芬苯達唑砜和奧芬達唑的工作液濃度為橫坐標，色譜響應(yīng)值峰面積為縱坐標做標準曲線，進行線性統(tǒng)計分析。

2.3 樣品凈化

稱量勻漿雞肉樣品2 g，加入無水硫酸鈉2 g，再加入含10%二甲基亞砜的乙酸乙酯10 mL，渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清9 mL；重復(fù)提取，合并上清。上清液用45 ℃水浴旋蒸濃縮至干，再用3 mL 1mol/L磷酸分三次溶解殘渣，合并磷酸溶液。向磷酸溶液中加入8 mL正己烷去脂，渦旋1 min，使其充分混合，4 000 r/min離心5 min，棄去上層正己烷，再加入8 mL正己烷重復(fù)上述操作，合并磷酸溶液，備用。

將上述磷酸溶液加入已活化好的C18柱，待其完全通過C18柱后，用5 mL 5%甲醇、5 mL 30%甲醇依次淋洗，最后用2 mL甲醇洗脫。然后40 ℃氮氣吹干洗脫液，0.5 mL流動相復(fù)溶，過濾，液相色譜-紫外檢測分析。

C18固相萃取小柱活化：先加入5 mL甲醇，再加入5 mL水。

2.4 添加回收率試驗

設(shè)1、5、25 μg/kg三個添加水平，在2 g空白雞肉中分別添加0.02、0.10、0.50 μg/mL芬苯達唑、芬苯達唑砜和奧芬達唑標準品混合工作液100 μL，常溫振蕩1 h，使空白雞肉組織濃度分別為1、5、25 μg/kg，按照方法2.3處理添加樣品，方法 2.1進行液相色譜-紫外檢測分析。然后對照各自標準曲線，計算回收率；同一天重復(fù)測定3次，計算日內(nèi)變異系數(shù)；連續(xù)測定3 d，計算日間變異系數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性試驗

在0.02～0.50 μg/mL范圍內(nèi)，芬苯達唑、芬苯達唑砜和奧芬達唑的線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)如表2所示。由表可知，三個化合物的相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，線性良好。

表2 回歸方程及其相關(guān)系數(shù)

3.2 靈敏度

在空白雞肉組織中添加1 μg/kg芬苯達唑、芬苯達唑砜和奧芬達唑時，其信噪比均大于10，如圖2所示。

圖2 空白雞肉組織中添加1 μg·kg-1標準物質(zhì)色譜圖

3.3 回收率及精密度

在1～25 μg/kg范圍內(nèi)，芬苯達唑、芬苯達唑砜和奧芬達唑的回收率為77.9～96.6%，日內(nèi)變異系數(shù)為 3.10～6.81%（n＝3），日間變異系數(shù)為1.19～7.74%（n＝3），如表3所示。

表3 芬苯咪唑類藥物及其代謝物的回收率和靈敏度

4 討論

4.1 前處理方法

本試驗分別采用乙腈、堿化乙腈[14]、酸化乙腈[8]、乙酸乙酯和含二甲基亞砜的乙酸乙酯提取雞肉中芬苯達唑及其代謝物，試驗結(jié)果表明使用乙腈、堿化乙腈、酸化乙腈和乙酸乙酯提取雜質(zhì)峰過多，且回收率不高，含二甲基亞砜的乙酸乙酯回收率高，目標峰處沒有明顯雜質(zhì)峰，所以選取含二甲基亞砜的乙酸乙酯作為提取試劑。然后對使用不同量的提取試劑提取進行試驗，結(jié)果表明采用10 mL提取試劑重復(fù)提取兩次回收率最高，在 70%以上。在提取過程同時，在樣品中加入無水硫酸鈉，形成液液分區(qū)，提高了提取效率。

4.2 液相色譜檢測

液相色譜方法雖不及液質(zhì)靈敏度高，但是液相色譜方法適合于基層使用。另外，以往檢測苯并咪唑的方法通常是檢測苯并咪唑類藥物殘留的方法，而本文采用檢測芬苯達唑及其代謝物的方法，使殘留檢測更加合理。

4.3 流動相選擇

本文比較了甲醇和乙腈作為有機相，發(fā)現(xiàn)在其他條件相同的情況下，用甲醇作為流動相，峰比較復(fù)雜，雜峰與藥物的目標峰無法分開；采用乙腈作為有機相，則可以與藥物的目標峰分開。此外，比較了純水和醋酸銨及醋酸。發(fā)現(xiàn)醋酸銨作為水相，芬苯達唑及其代謝物的雜峰最少，且檢測限最低。這可能是由于芬苯達唑?qū)儆谌鯄A性，在弱堿性的流動相中不宜解離。