肉制品中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及其相互作用吸附 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理研究進(jìn)展

聶若彤，魏相茹，張德權(quán)，王振宇，劉 歡

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是評(píng)價(jià)肉制品品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)存在于肉制品中的主要原因是風(fēng)味形成與風(fēng)味吸附（保留）[2]。目前，已有大量學(xué)者對(duì)風(fēng)味形成進(jìn)行了系統(tǒng)研究與綜述，明確了美拉德反應(yīng)、脂質(zhì)氧化、硫胺素降解及其相互作用是形成肉制品風(fēng)味的關(guān)鍵，并揭示了其形成路徑[3-4]。肉制品中風(fēng)味吸附載體主要包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及碳水化合物[5-6]，其中蛋白質(zhì)與脂質(zhì)最為關(guān)鍵。本研究綜述肉制品中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及其相互作用吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的作用機(jī)理、檢測(cè)方法及內(nèi)外源影響因素，以期從風(fēng)味保留的角度實(shí)現(xiàn)肉制品風(fēng)味保真，為肉制品加工提供參考。

1 蛋白質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理研究進(jìn)展

風(fēng)味保留與肉制品基質(zhì)大分子密切相關(guān)，蛋白質(zhì)是吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的理想載體[7]。肌原纖維蛋白與膠原蛋白分別是肌肉與皮的主體蛋白質(zhì)，血清蛋白是血液的重要蛋白質(zhì)，研究表明，肌原纖維蛋白與血清蛋白可以顯著保留醛類、醇類、酮類、含硫與含氮等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[8-10]。內(nèi)外源因素使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變或變性，其羧基、胺基、硫醇等官能團(tuán)等被激活，進(jìn)而吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[4,11]。蛋白質(zhì)結(jié)合風(fēng)味物質(zhì)的作用力主要包括可逆與不可逆作用力，可逆結(jié)合化學(xué)作用力包括疏水和靜電相互作用、氫鍵及范德華力，不可逆結(jié)合化學(xué)作用力包括氨基和巰基結(jié)合等[12-13]。以蛋白質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)疏水作用為例（圖1），蛋白質(zhì)通過非共價(jià)作用力折疊成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，氨基酸的疏水側(cè)鏈主要在蛋白質(zhì)內(nèi)部，極性基團(tuán)在外部，通過疏水作用力吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[14]。

1.1 肌原纖維蛋白

肌原纖維蛋白是肉制品中的主要蛋白質(zhì)，占總蛋白含量的50%以上，其主要包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌原蛋白和肌動(dòng)球蛋白等[15]。肌原纖維蛋白、肌球蛋白等吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的作用機(jī)理包括：一是暴露更多的疏水作用位點(diǎn)與氫鍵結(jié)合風(fēng)味化合物實(shí)現(xiàn)可逆結(jié)合[16]；二是暴露色氨酸、賴氨酸、谷氨酸等氨基酸殘基或巰基實(shí)現(xiàn)不可逆結(jié)合[17]。以肌球蛋白研究為例，外源條件使肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而暴露出更多的疏水結(jié)合位點(diǎn)與巰基結(jié)合戊醛、己醛、庚醛、辛醛與壬醛等醛類物質(zhì)，結(jié)合作用位點(diǎn)主要包括蘇氨酸殘基、脯氨酸殘基與色氨酸殘基等[18]。然而，含硫與含氮類物質(zhì)是肉制品中呈烤肉味與肉香味的關(guān)鍵物質(zhì)，相關(guān)學(xué)者應(yīng)進(jìn)一步聚焦不同類型肌原纖維蛋白吸附含硫與含氮等關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的作用機(jī)理解析。肌原纖維蛋白吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的作用機(jī)理如表1所示。

表1 肌原纖維蛋白吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的作用機(jī)理Table 1 Binding mechanism between myofibrillar protein and volatile compounds

1.2 膠原蛋白

膠原蛋白是由3 條左手螺旋的多肽鏈通過范德華力、氫鍵與共價(jià)鍵相互纏繞形成右手超螺旋結(jié)構(gòu)的高分子蛋白質(zhì)，具有很高的機(jī)械強(qiáng)度[24]。膠原蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要依賴于非共價(jià)作用力，如氫鍵、范德華力、靜電和疏水相互作用。膠原蛋白分子的固有結(jié)構(gòu)是由內(nèi)力結(jié)合在一起的，其結(jié)構(gòu)的變化與蛋白分子間共價(jià)交聯(lián)的數(shù)量密不可分，在大多數(shù)情況下，隨著溫度的升高蛋白質(zhì)發(fā)生“熱變性”，氨基酸鏈展開，分子內(nèi)部基團(tuán)暴露在分子表面，改變了分子對(duì)其他分子的親和性[25]。研究表明：豬皮膠原蛋白結(jié)合醛類、酮類及酯類等（己醛、 2-庚酮、2-戊基呋喃、丁酸乙酯）風(fēng)味物質(zhì)的能力隨溫度升高（75 ℃）顯著增強(qiáng)，75～95 ℃又顯著降低，原因可能是溫度超過85 ℃，膠原蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（聚集）和沉積趨勢(shì)增加；膠原蛋白吸附萜烯類風(fēng)味物質(zhì)的作用力主要為疏水相互作用與氫鍵，其中氫鍵是主要作用力，但萜烯類化合物良好的疏水特性導(dǎo)致膠原蛋白結(jié)合效果不明顯[26]。

1.3 血清蛋白

血清蛋白是血清中的一種球狀蛋白，包含3 個(gè)脂質(zhì)結(jié)合域[11]。以牛血清蛋白為例，其通過氫鍵、范德華力等可逆作用力結(jié)合香草醛（圖2），在Tyr 149、Arg 256和His 241氨基酸殘基位點(diǎn)通過氫鍵結(jié)合香草醛，在Arg 198、Leu 237、Lys 221、Ala 290和Ser 286氨基酸殘基位點(diǎn)通過疏水與靜電相互作用結(jié)合香草醛[27]；牛血清蛋白結(jié)合醛類、酮類、醇類風(fēng)味物質(zhì)的化學(xué)作用力為氫鍵與疏水相互作用，結(jié)合位點(diǎn)主要為色氨酸殘基[28-29]； 另外，牛血清蛋白可通過疏水相互作用結(jié)合烷基吡嗪化合物[30-31]。

圖2 牛血清蛋白吸附醛類風(fēng)味物質(zhì)（以香草醛為例）作用機(jī)理Fig. 2 Mechanism of bovine serum protein binding to aldehydes (vanillin)

1.4 檢測(cè)方法

肉制品中蛋白質(zhì)空間構(gòu)象變化影響揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合程度，這些變化可以通過色譜、質(zhì)譜與光譜等方法檢測(cè)。本文從風(fēng)味吸附程度、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、作用力與作用位點(diǎn)三方面綜述蛋白質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理（表2）。蛋白質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)程度主要采用液相分析法與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法解析，2 種方法操作簡(jiǎn)單，可以反映蛋白質(zhì)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的整體吸附能力，但液相分析法會(huì)隱藏部分結(jié)合位點(diǎn)，GC-MS法很難反映蛋白內(nèi)部與風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化主要采用熱力學(xué)方法與圓二色光譜法進(jìn)行解析，熱力學(xué)方法樣品用量小，方法靈敏度高，但缺乏特異性，圓二色光譜法方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、可定量，但對(duì)溶液的澄清度、濃度要求高。蛋白質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的作用力與作用位點(diǎn)主要采用光譜法、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）與分子對(duì)接技術(shù)解析，熒光光譜法應(yīng)用廣泛并且精準(zhǔn)，但對(duì)風(fēng)味化合物濃度要求較高，測(cè)定值通常偏高，NMR可研究蛋白動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、功能及其動(dòng)力學(xué)特性，無需結(jié)晶，但受相對(duì)分子質(zhì)量限制，需要標(biāo)記，分子對(duì)接模擬技術(shù)可在原子水平準(zhǔn)確闡明相互作用。目前，諸多相關(guān)研究聚焦于熒光光譜、紫外-可見吸收光譜、圓二色光譜和分子對(duì)接等多種手段解析蛋白質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理。

表2 蛋白質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理解析方法Table 2 Analytical methods for binding mechanism between protein and volatile compounds

2 脂質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理研究進(jìn)展

脂質(zhì)是肉制品中風(fēng)味形成的重要底物，也是吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵基質(zhì)[42]。肉制品中的脂質(zhì)包括中性脂質(zhì)、磷脂、鞘脂、衍生脂質(zhì)等[43]。醛類、醇類、酯類、含硫與含氮類等風(fēng)味物質(zhì)具有脂溶性特點(diǎn)，表現(xiàn)出疏水特性，對(duì)脂質(zhì)有很大的親和力[6]。脂質(zhì)含量與脂質(zhì)類型均顯著影響揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保留，含量對(duì)香氣保留的影響大于類型[44]。中性脂質(zhì)（甘油三酯）與磷脂對(duì)肉制品風(fēng)味保持具有重要作用[45]。大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)（如醛類、醇類、脂類）具有疏水性，這些分子與脂質(zhì)相似相溶，通過疏水相互作用被包裹在脂質(zhì)分子內(nèi)部。

脂質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味化合物受物理化學(xué)作用的影響[46]。 在肉制品加工過程中甘油三酯對(duì)揮發(fā)性化合物的吸附作用隨溫度的升高而增強(qiáng)，而液態(tài)甘油三酯的吸附作用隨溫度的升高而減弱；甘油三酯中脂肪酸不飽和程度會(huì)顯著影響與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)合能力[47]。相關(guān)學(xué)者采用脂質(zhì)組學(xué)研究烤羊肉中的脂質(zhì)，結(jié)果表明，烤羊肉中主要包括7 種脂質(zhì)，如中性脂質(zhì)、磷脂、鞘脂、脂肪?；?、糖甘油脂、衍生脂質(zhì)等，并發(fā)現(xiàn)1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯與1,3-二硬脂酰-2-油酰甘油酯是吸附風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵脂質(zhì)[48]。

因此，在研究脂質(zhì)吸附風(fēng)味物質(zhì)作用時(shí)，以下幾點(diǎn)需要注意[14]：1）脂質(zhì)在研究體系中的分布形態(tài)。脂質(zhì)是具有疏水性和非極性的物質(zhì)，可在加熱、超聲和其他條件下在介質(zhì)中形成乳濁液。風(fēng)味化合物遵循物理定律，分布在脂質(zhì)和水相之間，并在理想條件下達(dá)到真正的平衡，在各相間的分布主要取決于其分配系數(shù)；2）脂質(zhì)在研究體系中的含量。在不同脂肪含量的復(fù)合食品中，風(fēng)味化合物的閾值與脂肪含量成比例增加；3）風(fēng)味化合物在脂質(zhì)中閾值的確定。風(fēng)味化合物在不同介質(zhì)中的分配系數(shù)不同，導(dǎo)致其閾值也有所不同，這主要與化合物的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

目前主要采用脂質(zhì)組學(xué)方法解析脂質(zhì)含量與類型（表3），包括GC-MS、薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間MS（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS，MALDI-TOF-MS）、電噴霧電離MS（electrospray ionization MS，ESI-MS）Q-Exactive高分辨MS和NMR等。單一技術(shù)并不能完全反映分子之間的相互作用，具有一定局限性，可以采用MS、多光譜、分子模擬等技術(shù)聯(lián)合使用。

3 蛋白質(zhì)與脂質(zhì)相互作用吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理 研究進(jìn)展

脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化密切相關(guān)，脂質(zhì)氧化程度越高導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化反應(yīng)越強(qiáng)，影響肉制品品質(zhì)[52]。在肉制品的加工過程中，肌肉蛋白不可避免地受到活性氧基團(tuán)攻擊，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并造成氧化 損傷[53]。蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及二者的氧化分解產(chǎn)物也會(huì)在肉品加工過程中發(fā)生交互作用，顯著影響食品的風(fēng)味[54]。脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的自由基和過氧化物會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)的氧化，二者的氧化產(chǎn)物所形成的自由基鏈相似，形成的氧化產(chǎn)物可以結(jié)合轉(zhuǎn)化為烷基過氧化物，進(jìn)而形成烷基自由基和羥基衍生物[55]。

脂質(zhì)氧化會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)水平[8,55]。食品加工過程中，蛋白質(zhì)通過疏水締合和二硫鍵部分展開聚集，一些脂類（如棕櫚酸酯）可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，減緩蛋白質(zhì)去折疊和變性[56]。脂質(zhì)與肌原纖維蛋白體外氧化研究表明，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化可發(fā)生耦合及相互作用[21]，分子間的相互作用因蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)和電荷而異，并通過界面作用調(diào)控穩(wěn)定性[57]。葉黃素二棕櫚酸酯通過氫鍵、范德華力和疏水作用自發(fā)地與牛血清白蛋白結(jié)合[5]。脂質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合機(jī)理見圖3（以牛血清蛋白與葉黃素二棕櫚酸酯為例）。膠原蛋白與表沒食子兒茶素沒食子酸酯結(jié)合的作用力包括靜電相互作用、疏水相互作用，主要作用位點(diǎn)為丙氨酸（Ala 932、Ala 945）與賴氨酸殘基（Lys 935）[58]。

圖3 脂質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合機(jī)理示意圖（以牛血清蛋白與葉黃素 二棕櫚酸酯為例）Fig. 3 Binding mechanism between lipid (lutein dipalmitate) and protein (bovine serum protein)

4 肉制品流變特性保留揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理研究進(jìn)展

食品基質(zhì)流變性顯著影響揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)保留[59]。食品基質(zhì)黏度越高，揮發(fā)性化合物吸附作用越強(qiáng)[60-62]。大分子溶液的表觀黏度隨著濃度的增大而顯著增強(qiáng)，分子間/內(nèi)部作用力的破壞和重組影響膠體穩(wěn)定性，改變食品基質(zhì)的流變學(xué)特性，導(dǎo)致食品基質(zhì)的結(jié)合和風(fēng)味物質(zhì)釋放程度不同[9,46,63]，如適度加熱使蛋白質(zhì)變性，二級(jí)結(jié)構(gòu)展開導(dǎo)致流變特性增強(qiáng)[9,64]。親水膠體作為增稠劑可減少風(fēng)味釋放，這主要是由于介質(zhì)中的擴(kuò)散減少和風(fēng)味化合物與基質(zhì)成分之間的分子相互作用[60]。

食品基質(zhì)中風(fēng)味物質(zhì)的保留平衡根據(jù)增稠劑的濃度而變化，并且取決于其他分子特性，如疏水性[65]。風(fēng)味化合物的結(jié)構(gòu)特征同樣影響食品基質(zhì)中的保留/釋放行為，不飽和醇在水性介質(zhì)中的保留作用比在乳制品凝膠中的保留更強(qiáng)，相反，醛、酮、酯類物質(zhì)在乳制品凝膠中的保留程度高于在水性介質(zhì)中的保留程度，并且基質(zhì)組成強(qiáng)烈影響伯醇的保留，而對(duì)叔醇的保留影響較小[65]。

添加適量脂質(zhì)可以改善冰淇淋的特性（黏度增加、類似泡沫的外觀、防止乳清脫落和抗熔化性）。在冰淇淋攪打步驟中乳脂的部分不穩(wěn)定導(dǎo)致形成穩(wěn)定氣室的脂肪網(wǎng)絡(luò)，此外，乳制品甜點(diǎn)中乳脂的增加有助于減少摩擦，通過部分聚結(jié)機(jī)制促進(jìn)對(duì)奶油油膩和黏性屬性的更好感知[66]。肉制品加工過程可借助外界條件（加熱、加壓與攪拌等）改變調(diào)節(jié)食品基質(zhì)的流變學(xué)特性，進(jìn)而調(diào)控風(fēng)味物質(zhì)保留。

5 結(jié) 語(yǔ)

我國(guó)食品工業(yè)已進(jìn)入“風(fēng)味與健康”雙導(dǎo)向的深度轉(zhuǎn)型期，風(fēng)味是實(shí)現(xiàn)食品高質(zhì)量發(fā)展的重要抓手，風(fēng)味形成與保持理論和技術(shù)的突破是實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的重要途徑。風(fēng)味物質(zhì)的形成已進(jìn)行了相對(duì)系統(tǒng)的研究與綜述，肉制品風(fēng)味形成后如何保持以及如何保持更長(zhǎng)久是當(dāng)下食品風(fēng)味研究的熱點(diǎn)，意義重大。食品基質(zhì)吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)研究主要聚焦于蛋白質(zhì)（如肌原纖維蛋白、膠原蛋白），闡明了蛋白質(zhì)吸附醛類、醇類、酮類、呋喃類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的作用力與作用位點(diǎn)，如可逆相互作用（氫鍵、疏水作用等）與不可逆相互作用（共價(jià)結(jié)合等），初步解析了甘油三酯是吸附揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要脂質(zhì)，明確了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等可以發(fā)生化學(xué)相互作用，進(jìn)而影響風(fēng)味吸附，并發(fā)現(xiàn)肉制品的流變特性也可以調(diào)控風(fēng)味物質(zhì)的吸附水平。

目前，由于肉制品體系的復(fù)雜性與技術(shù)的局限性，肉制品中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及其相互作用吸附風(fēng)味物質(zhì)作用機(jī)理解析任重道遠(yuǎn)。從現(xiàn)有理論突破與技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)來分析，在可預(yù)見的未來，以下內(nèi)容將有深入挖掘的空間：1）大多數(shù)研究是在離體模型中進(jìn)行，肉制品是一個(gè)包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)的復(fù)雜體系，如何更加真實(shí)地解析肉制品基質(zhì)中蛋白質(zhì)吸附風(fēng)味物質(zhì)機(jī)理將是重要研究?jī)?nèi)容；2）蛋白質(zhì)吸附風(fēng)味物質(zhì)作用位點(diǎn)驗(yàn)證與作用力決定風(fēng)味保留系數(shù)計(jì)算需要理論突破； 3）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-碳水化合物及其共同形成的流變特性如何調(diào)控風(fēng)味物質(zhì)吸附是一個(gè)復(fù)雜且重要的課題；4）風(fēng)味物質(zhì)修飾肉制品基質(zhì)進(jìn)而如何影響風(fēng)味物質(zhì)吸附需要系統(tǒng)解析。