大明膠囊治療高脂血癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對(duì)接驗(yàn)證研究

張?jiān)?張卉青 楊提 徐春梅

[關(guān)鍵詞]大明膠囊；高脂血癥；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；靶點(diǎn)預(yù)測(cè)；分子對(duì)接

高脂血癥是由于脂肪代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)異常而導(dǎo)致的血漿中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂[1]。高脂血癥是心血管疾病發(fā)病和病死的主要危險(xiǎn)因素。他汀類是血脂異常的首選治療藥物，盡管他汀類藥物治療對(duì)心血管事件有積極作用，但患者的依從性往往較差[2]。因此，探索不良反應(yīng)較低且作用有效的降脂藥物具有重要意義。

中藥治療高脂血癥具有療效確切、毒性相對(duì)較低、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此得到越來越多人的關(guān)注。大明膠囊是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的具有活血化瘀作用的中成藥。大明膠囊由6味中藥，即大黃、決明子、丹參、陳皮、人參和茯苓組成，對(duì)高脂血癥患者有確切療效[3-4]。但由于大明膠囊所含成分復(fù)雜，其治療高脂血癥的關(guān)鍵活性成分及潛在分子機(jī)制至今尚不明確。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，分析大明膠囊治療高脂血癥的分子機(jī)制，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 大明膠囊相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）獲得中成藥大明膠囊成分的化學(xué)組分，根據(jù)口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的2個(gè)ADME屬性值進(jìn)行初步篩選以獲得活性成分及各活性成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未檢索到的活性成分的已知靶點(diǎn)。最后使用UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。

1.2 高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

以“hyperlipemia”為關(guān)鍵詞，利用GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)獲取高脂血癥的潛在治療靶點(diǎn)，并以DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中臨床一線治療藥物的靶點(diǎn)為補(bǔ)充。合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到高脂血癥的潛在治療靶點(diǎn)。

1.3 大明膠囊成分-高脂血癥共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用（protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny2.1對(duì)大明膠囊成分相關(guān)靶點(diǎn)與高脂血癥靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖。通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建交集靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，將生物類型設(shè)定為“homosapiens”，最小互作閾值設(shè)定為“highestconfidence>0.9”，其余選項(xiàng)設(shè)為默認(rèn)值，得到大明膠囊成分-高脂血癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因本體（geneontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）富集分析

GO對(duì)基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述，將基因功能分為三個(gè)部分：細(xì)胞組分（cellularcomponent，CC）、分子功能（molecularfunction，MF）、生物過程（biologicalprocess，BP）[5]。KEGG是一個(gè)整合基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫(kù)[6]。應(yīng)用R語言軟件中ClusterProfilerGO.R插件及Perl語言對(duì)大明膠囊活性成分及藥物-疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集，對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析，得到大明膠囊治療高脂血癥的生物功能和信號(hào)通路。

1.5 大明膠囊成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.7.2構(gòu)建大明膠囊成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape3.7.2內(nèi)置工具包分析成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度、介度及緊密度等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

利用軟件AutoDockVina對(duì)確定的大明膠囊活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，研究其結(jié)合方式和結(jié)合程度。

2 結(jié)果

2.1 大明膠囊活性成分靶點(diǎn)的獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)初步獲取、ADME篩選得到陳皮、大黃、丹參、茯苓、決明子、人參的活性成分分別為5、10、19、6、13、17種?；钚猿煞值淖饔冒悬c(diǎn)分別為69、70、103、22、67、115個(gè)，合并刪除重復(fù)值后共得到靶點(diǎn)196個(gè)。

2.2 高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共得到高脂血癥潛在靶點(diǎn)1463個(gè)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Score≥2倍中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為高脂血癥的潛在靶點(diǎn)，通過GeneCards所得高脂血癥靶點(diǎn)Score最大值為45.99，最小值為0.12，中位數(shù)為0.50，故設(shè)定Score≥1的靶點(diǎn)為高脂血癥的潛在靶點(diǎn)。結(jié)合DisGeNET、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充，合并刪除重復(fù)值后，得到541個(gè)高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 大明膠囊活性成分-高脂血癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的大明膠囊活性成分與高脂血癥靶點(diǎn)取交集繪制韋恩圖，得到64個(gè)共有靶點(diǎn)，見圖1。在STRING平臺(tái)中錄入共有靶點(diǎn)得到大明膠囊活性成分靶點(diǎn)-高脂血癥靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

2.4 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

應(yīng)用R語言軟件ClusterProfilerGO.R插件對(duì)大明膠囊治療高脂血癥的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

生物過程分析顯示，這些靶點(diǎn)主要富集于類固醇代謝過程、營(yíng)養(yǎng)水平的應(yīng)答等，見圖3A。分子功能分析顯示，其靶點(diǎn)主要涉及受體配體活性、信號(hào)受體激活因子活性等，見圖3B。細(xì)胞組分分析表明，這些靶點(diǎn)主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等，見圖3C。

KEGG通路分析提示，大明膠囊治療高脂血癥的機(jī)制可能與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路等有關(guān)，見圖3D。

2.5 大明膠囊成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建大明膠囊成分-高脂血癥靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖4。再通過軟件內(nèi)置的NetworkAnalyzer工具分析大明膠囊調(diào)血脂網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心成分及核心靶點(diǎn)。Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明山柰酚（kaempferol）連接度、介度、緊密度最高，分別為21、0.15、0.45，預(yù)測(cè)山柰酚為大明膠囊治療高脂血癥的主要成分。HSP90AA1在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的連接度、介度、緊密度最高，分別為35、0.25、0.48，預(yù)測(cè)其為大明膠囊治療高脂血癥的最重要靶點(diǎn)。NCOA2、AKT1、ADRB2、RXRA、TNF、NCOA1、PPARG、MAPK1、IL-6、IL-1β、ESR1亦為相對(duì)重要靶點(diǎn)。

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

上述結(jié)果表明，大明膠囊治療高脂血癥的核心靶點(diǎn)為HSP90AA1、NCOA2、AKT1、ADRB2、RXRA、TNF、NCOA1、PPARG、MAPK1、IL-6、IL-1β、ESR1，主要成分為山柰酚。利用AutoDockVina軟件將山柰酚與核心靶點(diǎn)相互作用進(jìn)行分子對(duì)接預(yù)測(cè)。AutoDockVina軟件對(duì)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行打分，即Affinity（kcal/mol），其值越小越易與蛋白質(zhì)結(jié)合。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，山柰酚與HSP90AA1、NCOA2、AKT1、ADRB2、RXRA、TNF、NCOA1、PPARG、MAPK1、IL-6、IL-1β、ESR1的結(jié)合能分別為-5.8、-3.95、-5.64、-5.76、-5.04、-5.59、-4.07、-5.7、-4.91、-5.29、-6.67、-4.68kcal/mol，均在-3.95～-6.67kcal/mol，說明山柰酚與核心靶點(diǎn)均具有較強(qiáng)的結(jié)合能力。其中山柰酚與IL-1β的結(jié)合能為-6.67kcal/mol，表明其結(jié)合能力最強(qiáng)，見圖5。

3 討論

大明膠囊具有清熱降濁、活血化瘀之功效，適用于熱郁血瘀型高脂血癥的輔助治療。既往研究表明，蒽醌類化合物蘆薈大黃素作為大明膠囊的潛在有效成分之一，具有調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇的作用[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在系統(tǒng)生物學(xué)理論基礎(chǔ)上的一門新的學(xué)科，它分析生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)，選擇特定的信號(hào)節(jié)點(diǎn)來設(shè)計(jì)多靶點(diǎn)藥物分子[8]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法從整體角度探索大明膠囊治療高脂血癥的活性成分及其分子作用機(jī)制，結(jié)果預(yù)測(cè)黃酮類化合物山柰酚可能為大明膠囊治療高脂血癥的主要成分。山柰酚是各種植物性食品中主要的膳食類黃酮，具有抗癌、抗氧化和抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種有益特性[9]。山柰酚可通過抑制Akt和激活PPARα、PPARδ發(fā)揮降低三酰甘油的作用[10]，還可通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路的失活上調(diào)miR-26a-5p緩解ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11]。上述研究表明山柰酚具有調(diào)節(jié)血脂、改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

3.1 大明膠囊治療高脂血癥關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

根據(jù)上述研究結(jié)果，大明膠囊治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)為HSP90AA1、NCOA2、AKT1、ADRB2、RXRA、TNF、NCOA1、PPARG、MAPK1、IL-6、IL-1β、ESR1。根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，IL-1β與山柰酚的結(jié)合能力最強(qiáng)，可能是大明膠囊治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。炎癥反應(yīng)伴隨著高脂血癥的發(fā)生發(fā)展，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子均與高脂血癥有著密切的聯(lián)系[12]。IL-1β是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，其對(duì)宿主反應(yīng)和抵抗病原體至關(guān)重要，且能夠加劇急性和慢性疾病的組織損傷[13]。在一項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)中，ApoE和IL-1β雙敲除小鼠主動(dòng)脈竇動(dòng)脈粥樣硬化病變的大小和硬化面積比明顯小于單敲除ApoE小鼠[14]。IL-1β通過抑制炎癥因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)，可減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，進(jìn)而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[15]。

3.2 通路與生物進(jìn)程分析

GO-CC富集結(jié)果表明，大明膠囊主要在細(xì)胞膜上發(fā)揮其降血脂作用，且主要分布于膜閥、膜微結(jié)構(gòu)域。膜閥及膜微結(jié)構(gòu)域是高度動(dòng)態(tài)且富含甾醇和鞘磷脂的結(jié)構(gòu)域[16-17]，在信號(hào)傳導(dǎo)、響應(yīng)外部刺激等方面起著至關(guān)重要的作用[18]。GO-MF結(jié)果表明，大明膠囊的降血脂作用主要與細(xì)胞內(nèi)受體配體活動(dòng)及信號(hào)受體激活因子等有關(guān)。大明膠囊能夠通過激活A(yù)MPK通路使血清和肝臟中的脂質(zhì)減少。AMPK的激活可增強(qiáng)PPARα的表達(dá)和脂蛋白脂肪酶的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致三酰甘油水解；也可增強(qiáng)低密度脂蛋白受體蛋白表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)代謝[19]。大明膠囊還可通過SIRT1/AMPK信號(hào)通路增加心肌細(xì)胞自噬，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而改善心肌梗死后的心功能[4]。KEGG結(jié)果表明，大明膠囊降血脂作用涉及的主要信號(hào)通路包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等，亦證明大明膠囊通過作用于多個(gè)信號(hào)通路共同發(fā)揮其治療高脂血癥的作用，其主要與IL-6、PPARG、TNF、NOS3、VCAM1、AKT、MAPK1等炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)因子有關(guān)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，篩選了大明膠囊治療高脂血癥的主要化學(xué)成分及核心靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了山柰酚在大明膠囊降血脂中發(fā)揮重要的作用，并推測(cè)其治療高脂血癥的藥理學(xué)機(jī)制可能是通過調(diào)控炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激因子實(shí)現(xiàn)的，為今后大明膠囊治療高脂血癥的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。