燈盞乙素通過細胞轉(zhuǎn)運途徑對阿爾茨海默病大鼠β.淀粉樣蛋白跨血腦屏障的影響

李可 苗果 柳秋 ，趙昆朋

摘要 目的： 探討燈盞乙素對阿爾茨海默?。ˋD）大鼠β.淀粉樣蛋白（Aβ）跨血腦屏障（BBB）的影響及其機制。 方法： 無特定病原體（SPF）級SD大鼠70只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組以及陽性對照組，除假手術(shù)組大鼠外，其余組大鼠側(cè)腦室注射Aβ ?1.42 氯化鈉溶液建立AD大鼠模型，燈盞乙素低 劑量和高劑量組大鼠分別灌胃燈盞乙素5 mg/kg和10 mg/kg， 陽性對照組灌胃鹽酸多奈哌齊0.9 mg/kg，持續(xù)30 d，觀察大鼠行為能力以及血腦屏障通透性，進行蘇木精.伊紅（HE）染色和免疫組化染色，蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測基質(zhì)金屬蛋白酶.9（MMP.9）、閉合蛋白.5（Claudin.5）、咬合蛋白（Occludin）、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白（LRP.1）以及p糖蛋白（P.gp）表達情況。 結(jié)果： 模型組神經(jīng)元細胞排列疏松、紊亂，細胞數(shù)量減少，可見明顯空泡化，燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組及陽性對照組神經(jīng)元細胞數(shù)量增多，空泡化細胞減少，細胞排列稍整齊致密。燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組及陽性對照組大鼠逃避潛伏期、伊文思藍含量、Aβ斑塊面積以及MMP.9蛋白相對表達量均低于模型組，穿過平臺的次數(shù)以及LRP.1、P.gp、Claudin.5、Occludin蛋白相對表達量高于模型組（ P ＜0.05）。 結(jié)論： 燈盞乙素可減輕AD大鼠神經(jīng)元病理損傷，保護血腦屏障。

關(guān)鍵詞 ?阿爾茨海默??；血腦屏障；β.淀粉樣蛋白；燈盞乙素；實驗研究

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.009

Effect ?of Breviscapine on β.amyloid across Blood.brain Barrier of Alzheimer′s Disease Rats Via Cellular Transporter Pathway

LI Ke， MIAO Guo， LIU Qiu， ZHAO Kunpeng

Nanshi Hospital of Nanyang， Nanyang 473000， Henan， China， E.mail： like880919@163.com

Abstract Objective： To investigate the effect of breviscapine on β.amyloid（Aβ） across blood.brain barrier （BBB） in rats with Alzheimer′s ?disease（AD） rats and its mechanism. ?Methods： Seventy specific pathogen free（SPF） SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，scutellarin low.dose group，scutellarin high.dose group and positive control group.Except for sham operation group，the AD rat model was established by injecting Aβ ?1.42 ?sodium chloride solution into the lateral ventricle of the other groups.Scutellarin low.dose group and scutellarin high.dose group were gavaged scutellarin with 5 mg/kg and 10 mg/kg for 30 days respectively，and positive control group was gavaged donepezil hydrochloride with 0.9 mg/kg for 30 days.The behavioral ability and BBB permeability of rats were observed，and hematoxylin.eosin staining（HE） and immunohistochemical staining were performed.Matrix metalloproteinase.9（MMP.9），closure protein.5（Claudin.5），Occludin，low density lipoprotein.related ?protein（LRP.1） and P.glycoprotein（P.gp） ?were detected by Western Blot. ?Results： In the model group，the neuronal cells arranged loosely and disorganized，the number of cells reduced，and the vacuolation was obvious.The number of neuronal cells increased in the scutellarin low.dose group，scutellarin high.dose group and positive control group，and the number of vacuolated cells reduced，and the arrangement of the cells was slightly neat and dense.The escape latency，Evans blue content，Aβ plaque area and relative expression of MMP.9 protein in the scutellarin low.dose group，scutellarin high.dose group and positive control group were lower than those in model group.The frequency of crossing the platform，the relative expression of LRP.1，P.gp，Claudin.5 and Occludin were higher than those in the model group（ P ＜0.05）. ?Conclusion： Breviscapine could alleviate pathological damage of neurons and protect BBB in rats with AD.

Keywords ?Alzheimer′s disease; blood.brain barrier; β.amyloid; breviscapine; experimental study

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種具有進展性、隱匿性且不可治愈的神經(jīng)退行性疾病，其 臨床癥狀主要以學(xué)習(xí)能力和記憶力喪失、行為認知能力異常為主 ?［1］ 。β.淀粉樣蛋白（β.amyloid，Aβ）腦內(nèi)過度沉積是發(fā)生AD公認的病理學(xué)變化，Aβ由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）水解而成，是造成神經(jīng)元死亡的重要因素，Aβ的過度產(chǎn)生和異常積累以及在大腦中的清除是治療AD的焦點 ?［2］ 。血腦屏障（blood.brain barrier，BBB）是一種具有高選擇性的半透明結(jié)構(gòu)，而且是一道有力的化學(xué)屏障，在維持大腦內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定，阻礙腦外異物侵入大腦方面發(fā)揮了重 要作用，一旦血腦屏障受損，將導(dǎo)致Aβ從腦內(nèi)清除到外周血液的能力降低，引起Aβ沉積和神經(jīng)毒性，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、記憶力喪失和認知功能障礙 ?［3］ 。燈盞乙素是燈盞細辛主要的藥理活性成分，研究發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素通過干預(yù)Aβ生成途徑中的相關(guān)因子抑制Aβ的產(chǎn)生，從而發(fā)揮改善AD的作用 ?［4］ 。而本研究通過兩側(cè)海馬內(nèi)注射Aβ ?1.42 建立AD大鼠模型，探討燈盞乙素是否通過發(fā)揮保護血腦屏障、清除Aβ蛋白沉積從而改善AD病理癥狀。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級SD大鼠70只，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2017.0011。

1.2 試劑與儀器

燈盞乙素購自南京澤朗生物醫(yī)藥科技有限公司；Aβ ?1.42 購自美國Sigma公司；蘇木素試劑盒和免疫組化試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；鹽酸多奈哌齊購自陜西方舟制藥有限公司；基質(zhì)金屬蛋白酶.9（matrix metalloprotein 9，MMP.9）、閉合蛋白.5（Claudin.5）、咬合蛋白（Occludin）、低密度脂蛋白相關(guān)蛋白 1（low density lipoprotein receptor.related protein.1，LRP.1） 、p糖蛋白（P.glycoprotein，P.gp）抗體購自美國Abcam公司；DW.2000腦立體定位儀購自成都泰盟有限公司；MK3型酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3 模型制備與分組

將70只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組以及陽性對照組，每組14只。除假手術(shù)組14只大鼠外，其余大鼠予腹腔麻醉，固定于腦立體定位儀上，剔除頭部局部毛發(fā)，消毒，在距前囟2 mm、正中矢狀縫左右各2 mm處做一長約1 cm、深約3 mm的切口，用微量進樣器沿切口向兩側(cè)海馬注射2 μL含2.5 μg/μL的Aβ ?1.42 氯化鈉溶液，而假手術(shù)組大鼠僅注射氯化鈉溶液 ?［5］ 。造模后，燈盞乙素低劑量組和高劑量組大鼠分別灌胃燈盞乙素5 mg/kg和10 mg/kg，陽性對照組灌胃鹽酸多奈哌齊0.9 mg/kg，假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水，持續(xù)給藥30 d，給藥期間每天定時海馬內(nèi)注射Aβ ?1.42 氯化鈉溶液。

1.4 實驗方法

1.4.1 Morris水迷宮實驗

末次給藥結(jié)束后，進行水迷宮測試，將水迷宮劃分為4個區(qū)域，將一黑色平臺置于左下方區(qū)域水面上，將大鼠從右上方區(qū)域面向池壁放入，直至大 鼠找到平臺并停留于平臺上，停止記錄時間（逃避潛伏期），若1 min 內(nèi)未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺位置，并停留5 s，連續(xù)進行為期4 d的學(xué)習(xí)，于第5天，撤去平臺，從原來的位置將大鼠放入水池，記錄大鼠穿過平臺所在位置的次數(shù)。

1.4.2 血腦屏障通透性檢測

取材前1 h隨機從各組大鼠中取6只，經(jīng)尾靜脈注射2%伊文思藍（4 mL/kg），直至大鼠皮膚以及四肢變藍，1 h后予腹腔麻醉，打開腹腔，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，直至右心耳有清亮液體流出，冰臺上迅速解剖取出腦組織，將腦組織置于甲酰胺溶液中浸泡72 h，避光，研磨，勻漿，離心，取上清液，在酶標儀630 nm波長處測定吸光（A）值，計算出伊文思藍含量。

1.4.3 蘇木精.伊紅（HE）染色

取各組剩余大鼠腦組織，經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片后，按照HE染色試劑盒說明書進行操作，顯微鏡下觀察病理損傷情況。

1.4.4 免疫組化染色

取石蠟切片，經(jīng)脫水、透明 后，根據(jù)免疫組化試劑盒說明書進行Aβ含量測定，棕黃色為Aβ陽性染色面積。

1.4.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測

取部分腦組織，剪碎，勻漿，加入裂解液裂解，二喹啉甲酸法（BCA）測定蛋白濃度，120 V恒壓電泳，0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)，室溫封閉，GAPDH、MMP.9、LRP.1、P.gp、Claudin.5以及Occludin蛋白抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育，顯色，Image J分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（ x ?± s ）表示，多樣本定量資料比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD. t 檢驗，以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為能力

在水迷宮實驗中，隨著訓(xùn)練時間的延長各組大鼠的逃避潛伏期均有縮短，而各時間點模型組大鼠逃避潛伏期均高于假手術(shù)組，燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組及陽性對照組大鼠逃避潛伏期均低于模型組（ P ＜0.05）。模型組大鼠穿過平臺的次數(shù)低于假手術(shù)組，燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組及陽性對照組大鼠穿過平臺的次數(shù)高于模型組（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.2 血腦屏障通透性

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織伊文思藍含量升高（ P ＜0.05）；與模型組比較，燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組及陽性對照組大鼠腦組織中伊文思藍含量降低（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.3 腦組織病理變化

假手術(shù)組未見神經(jīng)元異常，錐體細胞排列有序、整齊且致密；模型組神經(jīng)元細胞排列疏松紊亂、細胞數(shù)量減少，可見明顯空泡化；燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組及陽性對照組神經(jīng)元細胞數(shù)量增多，空泡化細胞減少，細胞排列稍整齊、致密。詳見圖1。

2.4 腦組織Aβ斑塊面積

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Aβ斑塊面積增大（ P ＜0.05）；與模型組比較，燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組及陽性對照組大鼠腦組織中Aβ斑塊面積減?。?P ＜0.05）。假手術(shù)組大鼠腦組織未見棕黃色深染的Aβ斑塊；模型組大鼠腦組織棕黃色深染的Aβ斑塊明顯增多；燈盞乙素各劑量組大鼠腦組織棕黃色深染的Aβ斑塊較模型組減少。詳見表3及圖2。

2.5 腦組織中MMP.9、LRP.1、P.gp、Claudin.5及Occludin蛋白表達

與假手術(shù)組比較，模型組MMP.9蛋白相對表達量升高，LRP.1、P.gp、Claudin.5以及Occludin蛋白相對表達量降低（ P ＜0.05）；與模型組比較，燈盞乙素低劑量組、燈盞乙素高劑量組及陽性對照組大鼠腦組織中MMP.9蛋白相對表達量降低，LRP.1、P.gp、Claudin.5以及Occludin蛋白相對表達量升高（ P ＜0.05）。詳見表4及圖3。

3 討 論

Aβ異常沉積將導(dǎo)致一系列神經(jīng)毒性，包括膽堿能功能障礙、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激以及突觸損傷和線粒體功能障礙等，而這些神經(jīng)毒性反應(yīng)相互作用最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡，誘發(fā)癡呆 ?［6］ 。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，燈盞乙素具有抗L.谷氨酸造成的HT22神經(jīng)細胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此，可能成為治療AD的潛在藥物 ?［7］ 。本研究通過海馬內(nèi)注射Aβ ?1.42 建立AD模型，探討燈盞 乙素對AD大鼠血腦屏障的保護作用及對Aβ的清除 作用。

本研究通過為期4 d的Morris水迷宮實驗，結(jié)果顯示：模型組大鼠逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組，燈盞乙素低、高劑量組和陽性對照組大鼠逃避潛伏期較模型組縮短。經(jīng)過為期4 d的訓(xùn)練后，第5天撤去平臺，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠穿過平臺的次數(shù)低于假手術(shù)組，給予藥物治療后，穿過平臺的次數(shù)多于模型組。由此可見，Aβ ?1.42 造成大鼠記憶功能障礙，而燈盞乙素治療可改善這一病理特征。海馬區(qū)主要負責(zé)存儲信息，是學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位，在AD病人中，海馬體最先受到損傷，因此，病人出現(xiàn)記憶力衰退以及方向知覺喪失 ?［8］ 。本研究通過HE染色顯示：模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞排列紊亂，細胞數(shù)量減少且出現(xiàn)空泡化，經(jīng)燈盞乙素和鹽酸多奈哌齊治療后，神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞數(shù)量增多，排列致密?？梢姛舯K乙素具有改善AD海馬神經(jīng)損傷的作用。血腦屏障是介于血液和腦組織之間的一種特殊屏障，是一個極其復(fù)雜的細胞系統(tǒng)，在多種神經(jīng)退行性疾病中常伴隨血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能損壞，導(dǎo)致局部通透性增加，腦組織所處內(nèi)環(huán)境紊亂，有害物質(zhì)入侵，營養(yǎng)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物通過異常，最終造成神經(jīng)元損傷 ?［9］ 。本研究通過伊文思藍染色檢測了血腦屏障的通透性，結(jié)果顯示：模型組大鼠血腦屏障通透性明顯增加，經(jīng)燈盞乙素和鹽酸多奈哌齊治療后血腦屏障的通透性降低，可見燈盞乙素可保護血腦屏障。此外，顯微鏡下觀察AD大鼠海馬組織，發(fā)現(xiàn)海馬體中出現(xiàn)一些老年斑，而且已經(jīng)證實這些老年斑是Aβ蛋白沉積的結(jié)果 ?［10.11］ 。本研究通過免疫組化法檢測海馬區(qū)Aβ蛋白沉積情況，結(jié)果顯示：模型組大鼠海馬區(qū)Aβ蛋白斑明顯多于假手術(shù)組，經(jīng)燈盞乙素和鹽酸多奈哌齊治療后Aβ蛋白斑減少?？梢姛舯K乙素可抑制Aβ蛋白沉積。根據(jù)以上結(jié)果，推測燈盞乙素可能通過改善血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性，增強Aβ蛋白的轉(zhuǎn)運能力，抑制Aβ蛋白造成的神經(jīng)毒性，從而改善AD大鼠記憶功能障礙。

血腦屏障的結(jié)構(gòu)組成包括許多相鄰細胞間的緊密連接，而這種緊密連接主要是由多種結(jié)構(gòu)和功能相聯(lián)系的蛋白質(zhì)組合成一個群體而實現(xiàn)的，在這個群體中Claudin家族和Occludin發(fā)揮了重要作用 ?［12］ 。Occludin是一種跨膜蛋白，它的頭端和尾端暴露于細胞質(zhì)中，中間形成兩個存在于細胞膜外面的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而兩個相鄰細胞正是借助這兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)實現(xiàn)彼此連接，從而使細胞間縫隙被封鎖。Claudin.5是Claudin家族在調(diào)節(jié)血腦屏障通透性中起到重要作用的一員 ?［13］ 。LRP.1是一種跨膜糖蛋白，一方面LRP.1通過與APP裂解酶競爭性結(jié)合減少Aβ生成，另一方面可介導(dǎo)Aβ在血腦屏障中向外轉(zhuǎn)運 ?［14］ 。P.gp是一種多藥轉(zhuǎn)運蛋白，其可限制循環(huán)成分進入大腦，保護腦組織免受有害物質(zhì)的入侵，對維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用，此外，還可增強血腦屏障的外排能力 ?［15］ 。MMP.9可特異性分解構(gòu)成血腦屏障結(jié)構(gòu)的緊密連接蛋白，因此，MMP.9水平直接影響血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整性 ?［16］ 。

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠MMP.9蛋白表達升高，LRP.1、P.gp、Claudin.5以及Occludin蛋白表達降低，經(jīng)燈盞乙素和鹽酸多奈哌齊治療后逆轉(zhuǎn)各蛋白表達情況。由此可見，燈盞乙素可上調(diào)血腦屏障中緊密連接蛋白LRP.1、P.gp、Claudin.5以及Occludin，下調(diào)MMP.9，加強Aβ的清除率，從而改善AD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，減輕神經(jīng)元病理損傷，保護血腦屏障。

參考文獻：

［1］ ?KHAN S， BARVE K H，KUMAR M S.Recent advancements in pathogenesis，diagnostics and treatment of Alzheimer′s disease［J］.Curr Neuropharmacol，2020，18（11）：1106.1125.

［2］ ?YANG L， ZHOU R Y.Effects of androgens on the amyloid.β protein in Alzheimer′s disease［J］.Endocrinology，2018，159（12）：3885.3894.

［3］ ?WU T， CHEN L，ZHOU L， et al. Platelets transport β.amyloid from the peripheral blood into the brain by destroying the blood.brain barrier to accelerate the process of Alzheimer′s disease in mouse models［J］.Aging（Albany NY），2021，13（5）：7644.7659.

［4］ ?王豫君， 敖俊文，郭莉莉，等.燈盞乙素對阿爾茨海默病小鼠腦組織 β分泌酶途徑相關(guān)蛋白表達的影響［J］.山東醫(yī)藥，2018，58（26）：5.8.

［5］ ?林志川， 文國強，呂艷，等.天麻素對阿爾茨海默癥大鼠神經(jīng)保護作用的研究［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2020，37（8）：1435.1441.

［6］ ?SIMUNKOVA M， ALWASEL S H，ALHAZZA I M， et al. Management of oxidative stress and other pathologies in Alzheimer′s disease［J］.Arch Toxicol，2019，93（9）：2491.2513.

［7］ ?HU X， TENG S，HE J， et al. Pharmacological basis for application ?of scutellarin in Alzheimer′s disease：antioxidation and antiapoptosis ［J］.Mol Med Rep，2018，18（5）：4289.4296.

［8］ ?曹育， 安玉蘭，張卓銘，等.針刺對阿爾茨海默癥小鼠海馬CA1區(qū)樹突結(jié)構(gòu)及認知功能影響的研究［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2021，31（10）： 9.15.

［9］ ?SOLM， ESTEBAN.LOPEZ M，TALTAVULL B， et al. Blood.brain barrier dysfunction underlying Alzheimer′s disease is induced by an SSAO/VAP.1.dependent cerebrovascular activation with enhanced Aβ deposition［J］.Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2019，1865（9）：2189.2202.

［10］ ?KINOSHITA M， KAKIMOTO E，TERAKAWA M S， et al. Model membrane size.dependent amyloidogenesis of Alzheimer′s amyloid.β peptides［J］.Physical Chemistry Chemical Physics，2017，19（24）：16257.16266.

［11］ ?MICHNO W， NYSTRM S，WEHRLI P， et al. Pyroglutamation of amyloid.βx.42（Aβx.42）followed by Aβ1.40 deposition underlies plaque polymorphism in progressing Alzheimer′s disease pathology［J］.The Journal of Biological Chemistry，2019，294（17）：6719.6732.

［12］ ?ZHU L， LIN M Q，MA J， et al. The role of LINC00094/miR.224.5p（miR.497.5p）/endophilin.1 axis in Memantine mediated protective effects on blood.brain barrier in AD microenvironment［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2019，23（5）：3280.3292.

［13］ ?YAMAZAKI Y， SHINOHARA M，SHINOHARA M， et al. Selective loss of cortical endothelial tight junction proteins during Alzheimer′s disease progression［J］.Brain，2019，142（4）：1077.1092.

［14］ ?WU S， LIU H，ZHAO H， et al. Environmental lead exposure aggravates the progression of Alzheimer′s disease in mice by targeting on blood brain barrier［J］.Toxicol Lett，2020，319：138.147.

［15］ ?STORELLI ?F， BILLINGTON ?S，KUMAR ?A ?R， et ?al. Abundance ?of ?P.Glycoprotein and other drug transporters at the human blood.brain barrier in Alzheimer′s disease：a quantitative targeted proteomic study［J］.Clin Pharmacol Ther，2021，109（3）：667.675.

［16］ ?LIU C Y， BAI K，LIU X H， et al. Hyperoside protects the blood.brain barrier from neurotoxicity of amyloid beta 1.42［J］.Neural Regeneration Research，2018，13（11）：1974.1980.

（收稿日期：2022.09.13）

（本文編輯 王雅潔）