藍(lán)莓果醋最適發(fā)酵溫度及抗氧化性研究

王龍宇，王宇婷，王云峰，熊思瑞，金鐵巖

延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院（延吉 133002）

藍(lán)莓（Vacciniumspp.），外表為藍(lán)色的果實(shí)，有豐富的果漿，屬杜鵑花科，越橘屬植物。最開(kāi)始出現(xiàn)在北美洲，是一種長(zhǎng)年生長(zhǎng)的灌木果樹(shù)。藍(lán)莓大致可分為2種：一種是野生品種，果實(shí)偏小，富含花青素，一般出現(xiàn)在低灌木中；另一種是人工培育品種，最高可長(zhǎng)至240 cm高，果實(shí)較大，顆粒飽滿(mǎn)，在食用口感方面也比野生藍(lán)莓風(fēng)味更佳，人體對(duì)于花青素的吸收率也相對(duì)較高[1]。1980年初，我國(guó)對(duì)藍(lán)莓進(jìn)行初步研究，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小漿果研究所率先進(jìn)入藍(lán)莓研究領(lǐng)域建立第一個(gè)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)基地[2-3]。藍(lán)莓果實(shí)含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪，以及大量的維生素A、維生素C、胡蘿卜素及其他人體所必需的微量元素。藍(lán)莓中還有熊果素、花色素、超氧歧化酶、黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)等多種特殊的活性成分。所以藍(lán)莓能夠緩解視力疲勞及提高夜間視力；使人體免疫力得到有效提高，預(yù)防心血管疾病，也能延緩人體衰老、增強(qiáng)記憶；有效地防止由膠原和花生烯酸等引起的血小板凝固，以達(dá)到預(yù)防血栓的目的；可抑制加速癌細(xì)胞增殖的酶的活性；藍(lán)莓果實(shí)中熊果素主要功能就是通過(guò)抑制體內(nèi)酪氨酸酶的活性，防止黑色素的生成，從而達(dá)到美白皮膚的作用[4]。

果醋是一種利用微生物在厭氧條件下經(jīng)過(guò)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵而成的一種具有獨(dú)特風(fēng)味的特殊調(diào)味食品。果醋飲料中的糖類(lèi)在發(fā)酵時(shí)被微生物分解為有機(jī)酸，果醋產(chǎn)品中僅有少量的糖類(lèi)沒(méi)有被轉(zhuǎn)化，同時(shí)各種維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失也很小，最終保存在果醋的成品中，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值[5]。

現(xiàn)代果醋的發(fā)酵方式主要有2種[6]：一是自然發(fā)酵，該方法操作簡(jiǎn)單，但是發(fā)酵速率不易控制，原料容易腐敗且發(fā)酵周期時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)；二是人工發(fā)酵，盡管該步驟操作瑣碎，但發(fā)酵時(shí)間短、容易控制且產(chǎn)品的產(chǎn)率高。國(guó)內(nèi)工廠使用的是人工控制方法形成的系統(tǒng)的工藝生產(chǎn)線。

藍(lán)莓果醋（blueberry vinegar）是在果酒發(fā)酵完畢之后利用醋酸菌再次進(jìn)行醋酸發(fā)酵；醋酸菌在進(jìn)行代謝時(shí)能產(chǎn)生更多的有機(jī)酸，所含有的各種水解酶可以將藍(lán)莓中的蛋白質(zhì)水解成各種氨基酸。這些氨基酸使成品的藍(lán)莓醋可以滿(mǎn)足對(duì)人體必需氨基酸的提供，大幅提高藍(lán)莓營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的利用率[7]。醋酸菌在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)除需要一定濃度的酒精作為底物外，還需要大量的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而藍(lán)莓中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)非常適合發(fā)酵制作果醋類(lèi)飲品[8-9]。藍(lán)莓果醋是將藍(lán)莓的營(yíng)養(yǎng)特性和果醋的營(yíng)養(yǎng)特性融為一體的一種特殊的飲料，可稱(chēng)作為一種功能性的飲料。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)果醋中的多酚類(lèi)物質(zhì)通過(guò)其抗氧化作用對(duì)預(yù)防一些慢性疾病有很好的效果[10]。為此此次試驗(yàn)不僅表明了藍(lán)莓果醋的最適酒精發(fā)酵溫度與醋酸發(fā)酵溫度，還對(duì)其進(jìn)行了抗氧化性研究。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

栽培藍(lán)莓（天賜四號(hào)，購(gòu)于延吉市西市場(chǎng)）；酵母菌種（Fermivin，Bio-Ingredients Specialist公司）；醋酸菌種（上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司）；白糖（市售）；藍(lán)莓醋（陳釀10 d）；蘋(píng)果醋、食醋（食品級(jí)，市售）。

硫代硫酸鈉（AR級(jí)）、二次蒸餾水、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、三氯乙酸、無(wú)水乙醇（AR級(jí)），均為天津市科密歐試劑有限公司；水楊酸、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、濃鹽酸（上海市麥克林生化科技有限公司）；過(guò)氧化氫（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；三氯化鐵（AR級(jí)，sigma公司）；DPPH、三羥基甲基氨基甲烷（均為AR級(jí)，Aladdin試劑公司）

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

電子稱(chēng)（AWH-SA型，上海英展機(jī)電企業(yè)有限公司）；分析天平（FA1104型，上海精科天平有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-6型，常州華普教學(xué)儀器有限公司）；半導(dǎo)體電子酒柜（JC-16C型，上海邦希電器有限公司）；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（HJ-3型，常州金壇市新航儀器廠）；酒精計(jì)（0.5%，3支裝，沈陽(yáng)玻璃儀器制造廠）；pH酸度計(jì)（PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；紫外分光光度計(jì)（U-3900型，上海日立高科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理

在藍(lán)莓中挑取出無(wú)破損，新鮮的藍(lán)莓果實(shí)，把挑好的藍(lán)莓破碎，攪拌到黏稠狀。因?yàn)榻湍妇纳L(zhǎng)代謝環(huán)境需要消耗大量葡萄糖，并且糖的濃度不宜過(guò)高，過(guò)高的糖原會(huì)使酵母菌代謝旺盛，酒精濃度持續(xù)升高，且變化速率過(guò)快，不宜進(jìn)行控制；如果糖原過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致酵母菌代謝速率過(guò)慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)的同時(shí)會(huì)引起副產(chǎn)物即雜醇的產(chǎn)生[11]。因此在進(jìn)行酒精發(fā)酵之前要加入適量的白糖來(lái)調(diào)整藍(lán)莓果漿中糖的濃度，將初始糖度調(diào)整至15%~16%，加入原料質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的硫代硫酸鈉殺菌4 h。

1.2.2 最適酒精發(fā)酵溫度的測(cè)定

稱(chēng)取原料質(zhì)量0.1%的Fermivin酵母菌，加入適量蒸餾水，在30 ℃水浴恒溫30 min活化酵母菌。等待出現(xiàn)大量泡沫，即活化充分。將活化好的酵母菌倒入之前調(diào)制好的藍(lán)莓漿液中，待攪拌均勻后放入恒溫酒柜中發(fā)酵。

在確定藍(lán)莓果酒酒精發(fā)酵的常用酵母菌種和接種量情況下，對(duì)酒精發(fā)酵影響最大的是發(fā)酵溫度，溫度的高低影響酵母菌的活性，即酵母菌的代謝速率的快慢。溫度過(guò)高導(dǎo)致酵母菌活性過(guò)快，酒精度的確定不易控制，并且溫度太高酵母菌直接失活；溫度過(guò)低，代謝速率慢，導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)。酒精發(fā)酵階段，設(shè)置4個(gè)溫度梯度，分別為10，15，20和25 ℃，在4種溫度下發(fā)酵時(shí)記錄每天的酒精度，根據(jù)發(fā)酵期間酒精度的變化速率確定酒精發(fā)酵時(shí)期的最適發(fā)酵溫度。

一般情況下，果酒發(fā)酵結(jié)束的酒精度在15%vol，其中有的會(huì)高一些，但是最高的一般也不會(huì)超過(guò)20%vol。酒精度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致滲透壓過(guò)高，不適合醋酸菌進(jìn)行正常的生理生化活動(dòng)，因?yàn)榇姿峋哪途凭芰苋?，適合醋酸菌發(fā)酵的酒精度約在6%vol，因此試驗(yàn)需控制酒精度在5%vol~6%vol時(shí)就終止酒精發(fā)酵階段，將發(fā)酵好的果酒進(jìn)行壓榨、過(guò)濾，放入冰箱中。

1.2.3 最適醋酸發(fā)酵溫度的測(cè)定

取上述待用的酒精度5%vol~6%vol的酒醪，在80 ℃條件下加熱30 min，將其溫度降至30 ℃。撒入醋酸菌粉末發(fā)酵，間隔一定的時(shí)間慢慢攪拌并通入適量氧氣。待種液的總酸含量上升至2%，即活化完畢，可接種使用，用于醋酸發(fā)酵階段。將擴(kuò)大培養(yǎng)的醋酸菌按規(guī)定的比例加入待用的藍(lán)莓果酒中，定期攪拌均勻，進(jìn)行醋酸發(fā)酵階段，待發(fā)酵結(jié)束后過(guò)濾，最終得到藍(lán)莓果醋。

醋酸發(fā)酵階段，向發(fā)酵好的藍(lán)莓果酒中添加一定的醋酸菌種，使其分別置于25，30，35和40 ℃溫度下進(jìn)行醋酸發(fā)酵，每隔24 h測(cè)定發(fā)酵期間總酸含量，根據(jù)總酸含量的變化情況及發(fā)酵結(jié)束的最終含量確定醋酸發(fā)酵的最適溫度。總酸含量采用標(biāo)準(zhǔn)的NaOH滴定法測(cè)定。

1.2.4 藍(lán)莓果醋抗氧化性質(zhì)的研究

試驗(yàn)以對(duì)DPPH、·OH-、·O2-這3種自由基的清除能力大小為指標(biāo)，利用得到的最適釀造溫度釀制出來(lái)的藍(lán)莓果醋與市售蘋(píng)果醋和食醋的自由基清除率對(duì)比，分析三者的抗氧化能力情況。

1.2.5 藍(lán)莓果醋DPPH清除率（R1）

藍(lán)莓果醋對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考賈冬英等[12]方法進(jìn)行合理修改進(jìn)行測(cè)定。藍(lán)莓果醋DPPH清除率（R1）按式（1）計(jì)算。

式中：A0為乙醇+DPPH的吸光度；A1為樣液+DPPH的吸光度；A2為樣液+乙醇的吸光度。1.2.6 藍(lán)莓果醋·OH-清除率（R2）

藍(lán)莓果醋對(duì)羥自由基·OH-清除能力的測(cè)定采用水楊酸法并且做出合適修改進(jìn)行測(cè)定[13]。藍(lán)莓果醋·OH-清除率（R2）按式（2）計(jì)算。

在510 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定樣品溶液的吸光度A1，蒸餾水代替H2O2測(cè)定得吸光度A2，蒸餾水進(jìn)行空白調(diào)零。蒸餾水代替樣液得到的吸光度記作A0。

1.2.7 藍(lán)莓果醋·O2

-清除率（R3）藍(lán)莓果醋對(duì)超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測(cè)定[14]。藍(lán)莓果醋·O2-清除率（R3）按式（3）計(jì)算。

依據(jù)方法配制好的溶劑在299 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A1，蒸餾水代替鄰苯三酚測(cè)定吸光度A0，蒸餾水代替果醋樣液測(cè)定吸光度A2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響

在不同溫度條件下酒精發(fā)酵時(shí)酒精度上升變化的曲線如圖1所示。經(jīng)過(guò)5 d發(fā)酵，15 ℃時(shí)酒精升高的速度最快，20 ℃次之，10 ℃和25 ℃條件下前3 d均無(wú)明顯變化，第4天變化明顯。通過(guò)參考周景瑞等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)15 ℃時(shí)酒精升高的速率變化過(guò)快，不易控制，且最高酒精度達(dá)7%vol，但是10 ℃和25 ℃最高的酒精度數(shù)滿(mǎn)足不了后續(xù)醋酸發(fā)酵的條件，在較短的時(shí)間內(nèi)20 ℃的條件下的酒精發(fā)酵溫度可達(dá)6%vol，且變化速度容易掌控，因此酒精最適發(fā)酵溫度為20 ℃。

圖1 不同發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響

2.2 不同溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

如圖2所示，不同溫度條件下果醋中總酸含量均呈上升趨勢(shì)。發(fā)酵開(kāi)始的前2 d變化趨勢(shì)不明顯，第3天開(kāi)始總酸含量明顯升高。從曲線的變化趨勢(shì)可以看出：在35 ℃條件下總酸含量上升最顯著，醋酸菌的生理活性最高；25 ℃時(shí)，上升最慢，由微生物學(xué)知識(shí)可知該溫度條件下醋酸菌的生理代謝緩慢，溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，出現(xiàn)部分醋酸菌失活，代謝速率變低。綜上所述，醋酸發(fā)酵階段的最適發(fā)酵溫度為35 ℃。

圖2 不同發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵階段的影響

2.3 食醋、蘋(píng)果醋和藍(lán)莓果醋的自由基清除能力情況

從表1可以看出，藍(lán)莓果醋對(duì)DPPH清除率為51.7%，對(duì)·OH-清除率為76.4%，對(duì)·O2-清除率為27.5%。蘋(píng)果醋對(duì)DPPH清除率為49.4%，對(duì)·OH-清除率為71.4%，對(duì)·O2-清除率為24.4%。食醋對(duì)DPPH清除率為45.9%，對(duì)·OH-清除率為59.7%，對(duì)·O2-清除率為20.3%。結(jié)果表示，3種樣品的自由基清除率之間都存在顯著性差異。其中，藍(lán)莓果醋的清除能力最好，這可能和藍(lán)莓中含有多種還原能力較強(qiáng)的活性成分如多酚、花色素和黃酮類(lèi)等物質(zhì)有關(guān)。

3 結(jié)論

利用微生物發(fā)酵將藍(lán)莓進(jìn)行兩步發(fā)酵，最終得到藍(lán)莓果醋。試驗(yàn)測(cè)定藍(lán)莓最適酒精發(fā)酵溫度，并確定最適醋酸發(fā)酵溫度。對(duì)藍(lán)莓果醋的抗氧化性質(zhì)進(jìn)行分析，分別測(cè)定DPPH、·OH-、·O2-自由基清除能力試驗(yàn)，與市售蘋(píng)果醋和食醋進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓果醋的清除能力最好，說(shuō)明試驗(yàn)方法釀制的藍(lán)莓果醋有很好的抗氧化能力。

結(jié)果表明：藍(lán)莓果醋的最適酒精發(fā)酵溫度為20 ℃；在此條件下發(fā)酵制成的藍(lán)莓果酒酒精度達(dá)到5%vol~6%vol時(shí)，進(jìn)行壓榨、過(guò)濾后終止發(fā)酵；此時(shí)的酒液呈明亮深紅色，其酒精度比較容易控制，更適合進(jìn)行后續(xù)的醋酸發(fā)酵。藍(lán)莓果醋最適醋酸發(fā)酵條件為溫度35 ℃，此條件下發(fā)酵釀制的藍(lán)莓果醋外觀品相最好，口感最佳；抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果表明，藍(lán)莓果醋的自由基清除率分別為51.7%（DPPH），76.4%（·OH-）和27.5%（·O2-），高于市場(chǎng)銷(xiāo)售的蘋(píng)果醋和食醋，說(shuō)明試驗(yàn)方法釀制的藍(lán)莓果醋有很好的抗氧化能力。

綜上所述，利用試驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵溫度可大幅改善藍(lán)莓醋風(fēng)味，所得到的果醋酸甜適中，并且該溫度釀制的藍(lán)莓果醋的抗氧化能力高于市售的蘋(píng)果醋和食醋，是一種具有飲品開(kāi)發(fā)價(jià)值的保健型果醋。一旦應(yīng)用于工廠工藝上，不僅能減少藍(lán)莓的浪費(fèi)現(xiàn)象，也有助于推動(dòng)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。