豬偽狂犬病病毒gE 蛋白的真核表達及其活性鑒定

王清龍，王瑞寧，，王 勛，李青梅，李 鴿，張真真，楊蘇珍，郭軍慶，張改平，5

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，河南 鄭州 450011；2.河南省農(nóng)業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河南 鄭州 450002；4.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100；5.揚州大學 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225009）

偽狂犬病（Pseudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種高度接觸性傳染病，該病毒沒有宿主嗜性，豬、狗、牛、兔和鼠等大多數(shù)哺乳動物，甚至一些鳥類均易感[1-2]。PRV 感染的臨床癥狀通常表現(xiàn)為全身奇癢、體溫升高、多器官功能衰竭等，雖然豬是其唯一自然宿主，但是不同日齡豬群均可以感染該病毒，并且日齡越小其臨床癥狀越嚴重，會引起新生仔豬神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失[3]。2011 年，PRV變異株在我國免疫傳統(tǒng)疫苗的豬場暴發(fā)，自此PRV流行率急劇上升，值得警惕的是PRV 變異株毒力增加，傳統(tǒng)疫苗無法保護變異株感染豬群[4]。2020年，F(xiàn)AN 等[5]報道了PRV 感染人的病例，證明PRV 具有感染人的能力，引起廣泛關注。

PRV 是一種屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科、豬皰疹病毒Ⅰ型的雙鏈線狀DNA 病毒，其基因組全長約為150 kb，基因組編碼的11 種不同囊膜蛋白在病毒復制不同階段發(fā)揮重要作用，其中位于基因組US 區(qū)的gE基因是PRV 重要的毒力基因，全長1.7 kb，其編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白gE 蛋白在影響病毒毒力、細胞的感染融合和侵襲神經(jīng)系統(tǒng)方面起著重要作用[6-8]。當PRV 毒株缺失gE基因后，會大幅降低對小鼠和仔豬的毒力[9]。目前，臨床上應用的PRV 疫苗多為基于gE基因缺失的疫苗，基于gE 蛋白的抗體檢測可以鑒別野毒感染和疫苗免疫豬群，因此，獲得純度高、活性好和接近天然狀態(tài)的gE 檢測抗原顯得尤為重要。PRV gE蛋白已在大腸桿菌、酵母和昆蟲細胞中成功表達，建立的ELISA、免疫熒光等方法可以區(qū)分野毒感染與疫苗免疫抗體，具有良好的應用前景[10-14]。然而，原核表達gE 重組蛋白因缺乏糖基化修飾顯著影響其抗原活性，不能滿足臨床檢測需求；而在真核細胞內(nèi)表達的gE蛋白則面臨表達量低、純化難度大等突出問題。為此，利用HEK293F 細胞分泌表達PRV gE 蛋白，通過鎳親和層析和凝膠過濾層析純化獲得具有高表達量、高純度、高活性和糖基化修飾的gE 重組蛋白，為PRV 感染與免疫鑒別檢測試劑研發(fā)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

根據(jù)PRV 流行毒株gE基因序列（KP257591.1）優(yōu)化gE胞外區(qū)基因序列，gE胞外區(qū)基因及其重組質(zhì)粒pCMV-gE由上海生工生物工程有限公司合成和克隆，DH5α 感受態(tài)細胞購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 主要試劑

金牌超量無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自康為世紀公司；SMM 293-TⅡ培養(yǎng)基和Sinofection 轉(zhuǎn)染試劑購自北京義翹神州科技有限公司；HisTrapTMExcel 層析柱（5 mL）購自Cytiva 公司；羊抗豬和羊抗鼠酶標二抗購自Abbkine 公司，HRP-Conjugated 6×His 抗體購自Proteintech Group 公司；ECL 超敏顯影液購自蘇州新賽美生物科技有限公司；BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒和TMB 單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司。PRV/ADV gI 抗體檢測試劑盒購自IDEXX 公司，PRV 陽性血清為PRV/ADV gI 抗體檢測試劑盒陽性對照血清；陰性血清和gE單克隆抗體7B7均由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室制備并保存。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

以重組質(zhì)粒pCMV-gE轉(zhuǎn)染HEK293F 細胞（由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室保存提供），當細胞密度達到3×106個/mL、活率高于90%時，將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑按比例混合，進行細胞轉(zhuǎn)染。具體操作：將20 mL 細胞置于100 mL 無菌、透氣搖瓶中；用150 mmol/L NaCl 稀釋20 μg DNA 至總體積0.5 mL，溫和混勻；用150 mmol/L NaCl 稀釋100 μL Sinofection 轉(zhuǎn)染試劑至總體積0.5 mL，溫和混勻；將稀釋好的DNA 和轉(zhuǎn)染試劑同時單獨靜置約5 min后溫和混勻，總體積為1 mL，室溫靜置10 min；將轉(zhuǎn)染液逐滴加入到細胞培養(yǎng)液中，滴加的同時輕輕搖動培養(yǎng)瓶，搖勻后放入37 ℃、5% CO2恒溫搖床中，150～175 r/min懸浮培養(yǎng)。

1.4 重組蛋白的表達與鑒定

1.4.1 重組蛋白的表達鑒定 細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，取細胞培養(yǎng)物進行超聲破碎，以未轉(zhuǎn)染細胞為對照，采用Dot blot 方法鑒定重組蛋白的表達。具體操作：無菌取5 mL 細胞培養(yǎng)物，用超聲破碎儀超聲處理6 s，暫停3 s，直至細胞培養(yǎng)物完全澄清，3 000×g離心5 min，取上清，沉淀用PBS 重懸；分別取2 μL上清和重懸沉淀點印在硝酸纖維素（NC）膜上；用5%脫脂奶粉封閉液37 ℃封閉2 h；加入1∶200 稀釋PRV 陽性血清作為一抗，37 ℃反應30 min；加入1∶5 000 稀釋羊抗豬酶標二抗，37 ℃反應30 min。上述每步均用含0.05% Tween-20 的PBS 洗滌5 遍，用ECL顯影液進行化學發(fā)光檢測。

1.4.2 重組蛋白的分泌表達鑒定 為確定重組蛋白是分泌表達或細胞內(nèi)表達，用Dot blot 對培養(yǎng)上清和細胞進行檢測。具體操作：細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，取1 mL細胞培養(yǎng)物300×g離心5 min，收取上清；細胞沉淀用細胞裂解液進行處理，取1 μL PMSF 加入499 μL 細胞裂解液中重懸細胞，置冰上并在搖床上孵育15 min，10 000 ×g離心10 min，取裂解上清。將培養(yǎng)上清和裂解細胞點印于NC 膜，同上進行Dot blot檢測。

1.4.3 重組蛋白的最佳表達時間鑒定 為確定重組蛋白最佳表達時間，分別在轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h收取培養(yǎng)上清和轉(zhuǎn)染細胞，同上進行Dot blot檢測。

1.5 重組蛋白純化

1.5.1 鎳親和層析純化 在重組蛋白表達量達到峰值時收取細胞培養(yǎng)上清，以鎳親和層析純化PRV gE 重組蛋白。收取大量培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)物，300×g離心5 min 取上清，再經(jīng)10 000×g離心10 min 取上清，上清經(jīng)0.22 μm 過濾后加入經(jīng)結(jié)合緩沖液（含20 mmol/L 咪唑的PBS）平衡的HisTrapTMExcel 層析柱（5 mL），用洗滌緩沖液（含20 mmol/L咪唑的PBS）洗滌后，以洗脫緩沖液（含200 mmol/L 咪唑的PBS）洗脫目的蛋白，分別收集流穿液、洗滌液和洗脫液，利用SDS-PAGE和Western blot分析純化的蛋白質(zhì)。

1.5.2 凝膠過濾層析純化 利用AKTA pure蛋白質(zhì)純化儀以HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 預裝柱（瑞典GE 公司）凝膠過濾層析進一步純化PRV gE 重組蛋白。將鎳親和層析純化蛋白質(zhì)加入經(jīng)PBS 平衡的HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 預 裝 柱，以

0.4 mL/min流速洗脫層析柱，收集洗脫峰。

1.5.3 SDS-PAGE 和Western blot 分析 對純化蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE 和Western blot 分析。具體操作：分別取鎳親和層析和凝膠過濾層析純化樣品，加入Loading Buffer 煮沸后離心；將樣品加入10%SDS-PAGE 凝膠，每孔上樣20 μL，電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉后，以HRP-Conjugated 6×His抗體進行檢測。

1.6 重組蛋白去糖基化分析

取10 μg 純 化 的PRV gE 蛋 白，加 入1 μL Glycoprotein Denaturing Buffer（10×）和超純水組成10 μL 反應體系，100 ℃加熱10 min 使糖蛋白變性；在冰上冷卻變性糖蛋白后離心10 s；加入2 μL GlycoBuffer 2（10×）、2 μL 10% NP-40 和6 μL 超純水；加入1 μL PNGase F 酶，輕輕混勻，37 ℃孵育1 h；SDS-PAGE 分析去糖基化gE 重組蛋白的分子質(zhì)量，以gE 單克隆抗體7B7 和羊抗鼠酶標二抗通過Western blot分析抗原活性。

1.7 重組蛋白ELISA活性鑒定

用0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）適當或倍比稀釋HEK293F 細胞表達和大腸桿菌表達gE 重組蛋白（Ecoli-gE，由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點試驗室保存提供），包被96孔酶標板，50 μL/孔，37 ℃孵育2 h；用5%脫脂奶粉封閉液200 μL/孔，37 ℃封閉1 h；分別加入1∶200稀釋或倍比稀釋PRV陽性和陰性血清，50 μL/孔，37 ℃反應30 min；加入1∶5 000 稀釋的羊抗豬酶標二抗，50 μL/孔，37 ℃反應30 min；上述每步均用含0.05% Tween-20 的PBS洗滌5 遍；加入TMB 顯色液室溫顯色10 min，2 mol/L H2SO4終止顯色，酶標儀讀取OD450值，并進行統(tǒng)計分析。

1.8 臨床血清樣品檢測

以適當稀釋PRV gE 重組蛋白包被96 孔酶標板，按常規(guī)條件建立基于gE 重組蛋白的間接ELISA方法（gE-ELISA）及其判定標準，對85 份豬場PRV疑似血清進行臨床檢測，并與IDEXX PRV/ADV gI抗體檢測試劑盒進行平行比對，初步評價其檢測PRV感染的臨床應用價值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV gE重組蛋白表達的鑒定

Dot blot 檢 測 結(jié) 果 顯 示，pCMV-gE轉(zhuǎn) 染HEK293F細胞的裂解上清和沉淀，均可被PRV陽性血清特異識別，裂解上清顯色顯著強于細胞沉淀，而未轉(zhuǎn)染對照細胞未見非特異顯色（圖1），表明gE重組蛋白在HEK293F細胞中成功表達，具有較好的抗原性。

圖1 PRV gE重組蛋白表達的Dot blot鑒定Fig.1 Identification of PRV gE recombinant protein expression by Dot blot

2.2 PRV gE重組蛋白分泌表達的鑒定

對pCMV-gE轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清的Dot blot檢測顯示，轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清被PRV 陽性血清特異識別，顯色強度與轉(zhuǎn)染細胞裂解物相當，而未轉(zhuǎn)染對照細胞培養(yǎng)上清未見非特異顯色（圖2），表明gE 重組蛋白利用自身信號肽分泌表達于細胞培養(yǎng)上清。

圖2 PRV gE重組蛋白分泌表達的Dot blot鑒定Fig.2 Identification of secretory expression of PRV gE recombinant protein by Dot blot

2.3 PRV gE重組蛋白最佳表達時間的鑒定

為確定gE重組蛋白最佳表達時間，在轉(zhuǎn)染不同時間收集轉(zhuǎn)染細胞及其培養(yǎng)上清進行Dot blot 檢測，結(jié)果顯示，gE重組蛋白在轉(zhuǎn)染細胞中高效表達，細胞培養(yǎng)上清在轉(zhuǎn)染24 h 可檢出微量表達重組蛋白，并隨表達時間逐漸增強，在轉(zhuǎn)染96 h 達到峰值，而轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)表達量保持穩(wěn)定（圖3）。因此，選取轉(zhuǎn)染96 h收集轉(zhuǎn)染細胞上清，純化gE重組蛋白。

圖3 不同轉(zhuǎn)染時間PRV gE重組蛋白表達量的Dot blot分析Fig.3 Analysis of gE recombinant protein expression at different time post-transfection by Dot blot

2.4 PRV gE重組蛋白的純化

以鎳親和層析和凝膠層析從轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清中純化gE 重組蛋白，通過SDS-PAGE 和Western blot 對純化的重組蛋白進行鑒定。在鎳親和層析中，gE 重組蛋白在200 mmol/L 咪唑洗脫條件下出現(xiàn)峰值，在63～180 ku 呈彌散蛋白質(zhì)條帶，而在流穿液和20 mmol/L 咪唑洗滌液中未見顯色條帶（圖4A）；經(jīng)凝膠層析純化后，進一步提高gE 蛋白純度，在75 ku 左右顯現(xiàn)特異條帶，gE 蛋白純度約為90%（圖4B）。經(jīng)BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定，gE蛋白質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL。

2.5 PRV gE重組蛋白的去糖基化分析

SDS-PAGE 分析結(jié)果（圖5）顯示，gE 重組蛋白經(jīng)PNGase F 去糖基化酶處理之后在35 ku處出現(xiàn)單一條帶，其分子質(zhì)量顯著低于處理前gE 重組蛋白（約75 ku），表明gE 重組蛋白糖基化修飾充分。Western blot 分析結(jié)果顯示，去糖基化gE 蛋白未見明顯條帶，而未處理重組蛋白在75 ku 處出顯現(xiàn)特異條帶，表明gE重組蛋白去糖基化后不能被gE單克隆抗體7B7識別，顯著影響gE重組蛋白抗原活性。

圖5 去糖基化PRVgE重組蛋白的SDS-PAGE和Western-blot分析Fig.5 SDS-PAGE and Western-blot analyses of the deglycosylated gE recombinant protein

2.6 PRV gE重組蛋白的抗原活性

2.6.1 gE 重組蛋白與PRV 陽性血清的反應性 以

gE 重組蛋白為檢測抗原的間接ELISA 結(jié)果顯示，gE重組蛋白檢測PRV 陽性血清的抗體效價可達1∶12 800，而對PRV 陰性血清未見非特異性反應（圖6），表明PRV gE 重組蛋白具有良好抗原活性，可用于PRV感染抗體檢測。

圖6 基于gE重組蛋白的PRV抗體ELISA檢測Fig.6 ELISA detection of PRV antibody based on the gE recombinant protein

2.6.2 真核與原核表達gE 重組蛋白活性比較 以1∶200 稀釋PRV 陽性血清分別對HEK293F 細胞和大腸桿菌表達gE 蛋白進行ELISA 檢測，結(jié)果顯示，HEK293F 細胞表達gE 蛋白檢出限為31.25 ng/mL，大腸桿菌表達gE 蛋白檢出限為125 ng/mL，其抗原活性為原核表達的4 倍；2 種gE 重組蛋白對PRV 陰性血清均無明顯非特異性反應（圖7）。

圖7 真核與原核表達PRV gE重組蛋白活性比較Fig.7 Comparison of antigen activities of the eukaryotically and prokaryotically expressed gE proteins using PRV positive serum

2.6.3 臨床血清樣品的檢測 分別用基于gE 重組蛋白ELISA（gE-ELISA）和IDEXX PRV/ADV gI 抗體檢測試劑盒對85份豬臨床疑似血清進行初步檢測，結(jié)果顯示，gE-ELISA 檢測PRV 抗體陽性率為67.1%（57/85），略低于IDEXX ELISA 試劑盒（68.2%）；以IDEXX ELISA 試 劑 盒 為 參 照，gE-ELISA 的 敏 感 性為93.1%（54/58），特異性為88.9%（24/27），符合率為96.5%（78/85）（表1），表明PRV gE 重組蛋白可用于PRV感染的臨床血清檢測。

3 結(jié)論與討論

當前，PR 凈化尤其是種豬場凈化是我國PR 防控的根本戰(zhàn)略，高效的基因缺失或標記疫苗與精確鑒別檢測方法結(jié)合使得通過從疫苗接種動物中區(qū)分感染動物（Differentiate infected from vaccinated animals，DIVA）戰(zhàn)略根除PR 變得切實可行[15]。PRVgE基因是與病毒顆粒在神經(jīng)元中的順行運輸相關的關鍵毒力因子，是減毒活疫苗株中通常缺失的基因之一，PRVgE基因缺失疫苗的廣泛使用使得其成為DIVA 血清學檢測的首選靶標，gI 阻斷ELISA和gE 間接ELISA 等PRV gE 抗體檢測方法已被開發(fā)用于快速有效區(qū)分感染動物和疫苗免疫動物[4，9]。然而，對于PR 低發(fā)地區(qū)現(xiàn)有診斷方法的敏感性和特異性仍需進一步提高，以及時準確診斷和消除偶發(fā)感染動物，同時潛伏感染也是鑒別診斷面臨的巨大挑戰(zhàn)。盡管診斷方法的敏感性可通過新型標記技術而有所提高，但高純度和高抗原活性的gE抗原是檢測方法的關鍵和核心。為此，本研究利用gE蛋白信號肽在HEK293F 真核細胞中分泌表達PRV gE蛋白胞外區(qū)，其翻譯和修飾與PRV 病毒感染相似，獲得具有天然結(jié)構和抗原活性的gE重組蛋白。

通常N-糖基對于蛋白質(zhì)正確折疊、靶向和生物學功能非常重要，許多囊膜病毒利用囊膜蛋白糖基化使其在受體結(jié)合、膜融合、入侵細胞和病毒出芽等方面發(fā)揮作用。PRV gE蛋白作為病毒糖蛋白，其糖基化修飾與蛋白質(zhì)功能和抗原性密切相關，對gE蛋白胞外區(qū)N-糖基化位點的分析發(fā)現(xiàn)，其存在4 個潛在的N-糖基化位點。SDS-PAGE 和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，HEK293F 細胞表達gE 重組蛋白的分子質(zhì)量（約75 ku）顯著大于理論預測值（45 ku），經(jīng)PNGase F 去糖基化酶處理之后重組蛋白分子質(zhì)量明顯變小（35 ku），表明gE 蛋白存在翻譯后糖基化修飾，與郎巧利等[16]在HEK293FF 細胞的表達結(jié)果相似；同時，去糖基化gE 蛋白失去與gE 單克隆抗體的反應性，對PRV 陽性血清反應性也顯著降低，提示gE 蛋白糖基在誘導抗體產(chǎn)生和識別中發(fā)揮重要作用。gE 重組蛋白常用的表達系統(tǒng)包括原核表達系統(tǒng)、酵母細胞表達系統(tǒng)和昆蟲細胞表達系統(tǒng)等[17-19]，大腸桿菌因表達效率高，但缺乏翻譯后修飾，通常不能形成天然蛋白質(zhì)結(jié)構，尤其對糖蛋白無法糖基化，嚴重影響抗原活性，以其為抗原制備的單克隆抗體可能不能識別天然病毒[20]。張洪亮等[21]利用原核表達系統(tǒng)表達純化了gE 蛋白核心抗原區(qū)，基于該蛋白質(zhì)的ELISA 檢測PRV 陽性血清抗體效價為1∶1 600，而本研究初步建立的gE-ELISA為1∶12 800，敏感性顯著提高。任雪楓[22]在巴斯德畢赤酵母中表達PRV gE 主要抗原表位基因，區(qū)分PRV gE陰性和陽性血清的能力較為有限，分析可能與糖基化不正確修飾有關。朱和超等[14]用桿狀病毒表達系統(tǒng)以其自身信號肽表達RPV gE 蛋白，Western blot 在感染細胞中檢出目的蛋白，而在細胞培養(yǎng)上清中未檢出特異條帶，未實現(xiàn)分泌表達。本研究利用PRV gE 自身信號肽實現(xiàn)了gE蛋白在細胞上清的分泌表達，有利于大批量表達純化高純度重組蛋白，顯示其在PRV 感染鑒別檢測中的良好應用潛力。