人參新品種福星牛性狀觀測(cè)及SSR 分子鑒定

楊忠亮，徐懷友，侯玉兵，張 瑞，雷秀娟，王英平

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林參王植保科技有限公司，吉林 撫松 134500；3.撫松人參質(zhì)量檢測(cè)中心，吉林 撫松 134500；4.人參新品種選育與開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118）

人參（Panax ginseng）為多年生草本植物，是中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有提高組織抗缺氧能力、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤和提高免疫力等多種功效[1-2]。近年來(lái)，隨著人參產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，人們?cè)谧非蟾咝б娴耐瑫r(shí)，忽視了對(duì)種源的開(kāi)發(fā)和保護(hù)，造成人參種源高度混雜，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊[3-4]。據(jù)考證，中國(guó)從清朝便開(kāi)始了大規(guī)模的人參種植[5]，但品種選育工作相對(duì)滯后，目前國(guó)內(nèi)僅有23 個(gè)人參品種[6-8]。因此，結(jié)合產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，加速種源開(kāi)發(fā)和品種選育工作迫在眉睫。由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)和吉林參王植?？萍加邢薰韭?lián)合選育的人參新品種福星牛，于2021 年通過(guò)吉林省農(nóng)作物品種委員會(huì)審定，審定編號(hào)為吉登藥2021002。該品種適宜在吉林省白山市、延邊州、吉林市等海拔400～900 m、無(wú)霜期90～130 d的針闊混交林或低質(zhì)改造地種植。

SSR（Simple sequence repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列）具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、較表型鑒定品種更具準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于作物品種鑒定[9-10]，然而利用SSR 進(jìn)行人參品種鑒定的研究鮮有報(bào)道。鑒于此，擬以人參新品種福星牛為研究對(duì)象，以福星2 號(hào)、大馬牙2 個(gè)高產(chǎn)品種為對(duì)照，系統(tǒng)分析福星牛人參新品種的表型性狀，篩選精準(zhǔn)鑒定引物并開(kāi)展SSR 分子鑒定，為福星牛的推廣應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2019 年在吉林省白山市撫松縣抽水鄉(xiāng)正岔溝村開(kāi)展，試驗(yàn)品種為福星牛，以福星2 號(hào)、大馬牙2個(gè)高產(chǎn)品種為對(duì)照，挑選肥力中等、均勻一致的地塊進(jìn)行試驗(yàn)。3個(gè)參試品種采用統(tǒng)一栽培管理技術(shù)，2019 年10 月將大小均勻一致、健康的3年生種苗進(jìn)行移栽，株距10 cm、行距25 cm，每行16 棵，移栽深度為越冬芽至參床表面8 cm。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 植株表型性狀測(cè)定 參照《人參田間調(diào)查記載方法》[11]進(jìn)行植株表型性狀測(cè)定，2022年8月每個(gè)品種隨機(jī)選擇20 株進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查指標(biāo)包括葉長(zhǎng)、葉寬、莖高、莖粗、葉厚、單株根鮮質(zhì)量、主根長(zhǎng)和主根粗。葉長(zhǎng)、葉寬、莖高和主根長(zhǎng)測(cè)量精度要求達(dá)到0.01 cm，莖粗、葉厚和主根粗測(cè)量精度要求達(dá)到0.01 mm，單株根鮮質(zhì)量測(cè)量精度要求達(dá)到0.01 g。

葉面積=葉片長(zhǎng)×葉片寬×0.645 2[11]。

1.2.2 果實(shí)表型性狀測(cè)定 果實(shí)表型性狀測(cè)定方法同1.2.1，于2022 年8 月果實(shí)成熟期每個(gè)品種隨機(jī)選擇20株進(jìn)行果實(shí)表型性狀調(diào)查，測(cè)定指標(biāo)包括果穗類(lèi)型、果穗直徑、果穗質(zhì)量、果穗粒數(shù)、果粒長(zhǎng)度、果粒寬度和果粒厚度。果穗直徑、果粒長(zhǎng)度、果粒寬度和果粒厚度測(cè)量精度要求達(dá)到0.01 mm，果穗質(zhì)量測(cè)量精度要求達(dá)到0.01 g。

1.2.3 種子表型性狀測(cè)定 種子表型性狀測(cè)定方法同1.2.1，將果實(shí)清洗出種子后進(jìn)行種子表型性狀調(diào)查，測(cè)定指標(biāo)包括種子百粒質(zhì)量、單株種子粒數(shù)、種子長(zhǎng)度、種子寬度和種子厚度。百粒質(zhì)量測(cè)量精度要求達(dá)到0.01 g，種子長(zhǎng)度、種子寬度和種子厚度測(cè)量精度要求達(dá)到0.01 mm。

1.2.4 根部產(chǎn)量和根部病害發(fā)生情況測(cè)定 根部病害病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同《人參田間調(diào)查記載方法》[14]，于2022年9月隨機(jī)測(cè)定3個(gè)參試品種5 m2內(nèi)根部產(chǎn)量和根部病害病情指數(shù)。

根病情指數(shù)＝（各病害等級(jí)根數(shù)與相應(yīng)病害等級(jí)乘積之和/調(diào)查根數(shù)與最高病害等級(jí)乘積）×100。

1.2.5 根部人參皂苷含量測(cè)定 3 個(gè)參試品種根部人參樣品經(jīng)洗刷瀝水后置于陰涼通風(fēng)處，陰干后粉碎過(guò)25.4 mm 孔徑篩子，利用UltiMate3000 UHPLC液相色譜儀進(jìn)行根部人參皂苷含量測(cè)定。液相條件為DIONEX UltiMate 3000 液相色譜儀（自帶UltiMate 3000 自動(dòng)進(jìn)樣器），采用UNIEX-7700 蒸發(fā)光檢測(cè)器，載氣流速為2.5 L/min，溫度為75 ℃，增益值為1。檢測(cè)條件：XBridge C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3 SSR鑒定

利用高效植物基因組DNA 提取試劑盒（DP350-02）提取3 個(gè)參試品種種子DNA。試驗(yàn)所用的50對(duì)SSR 引物[12-16]由上海生工生物工程股份有限公司合成。10 μL PCR 反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 5.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染顯色。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019、SPSS 25、Origin 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 福星牛與對(duì)照品種地上植株表型性狀比較

地上植株表型性狀如表1 所示。由表1 可知，福星牛的葉面積（107.48 cm2）、莖粗（8.03 mm）和葉厚（0.19 mm）均顯著高于其他2 個(gè)品種（P＜0.05）。福星牛莖高（32.60 cm）與福星2 號(hào)差異不顯著（P＞0.05），但與大馬牙差異顯著（P＜0.05）。

表1 福星牛與福星2號(hào)、大馬牙地上表型性狀比較Tab.1 Comparison of aboveground phenotypic traits of Fuxingniu，F(xiàn)uxing 2 and Damaya

2.2 福星牛與對(duì)照品種果實(shí)表型性狀比較

福星牛與對(duì)照品種果實(shí)表型性狀如表2 所示。由表2可知，福星牛與對(duì)照品種均為傘形果穗，福星牛果穗直徑（59.04 mm）和果穗質(zhì)量（21.09 g）顯著高于大馬牙（P＜0.05）。福星牛果穗粒數(shù)（96.60粒）、果粒長(zhǎng)度（9.27 mm）、果粒寬度（6.79 mm）、果粒厚度（5.38 mm）均顯著高于福星2 號(hào)和大馬牙（P＜0.05）。

表2 福星牛與福星2號(hào)、大馬牙果實(shí)表型性狀比較Tab.2 Comparison of fruit phenotypic traits of Fuxingniu，F(xiàn)uxing 2 and Damaya

2.3 福星牛與對(duì)照品種種子表型性狀比較

福星牛與對(duì)照品種種子表型性狀如表3 所示。由表3可知，福星牛種子性狀表現(xiàn)優(yōu)異，不僅種子大小（種子長(zhǎng)度5.60 mm、種子寬度4.81 mm）顯著大于2 個(gè)對(duì)照品種（P＜0.05），百粒質(zhì)量（3.13 g）、單株種子粒數(shù)（143.60個(gè)）、種子厚度（2.82 mm）也顯著高于大馬牙（P＜0.05）。

表3 福星牛與福星2號(hào)、大馬牙種子表型性狀比較Tab.3 Comparison of seed phenotypic traits of Fuxingniu，F(xiàn)uxing 2 and Damaya

2.4 福星牛與對(duì)照品種根部表型性狀和根部病害比較

福星牛與福星2號(hào)和大馬牙的根部表型性狀和病害發(fā)生情況見(jiàn)表4。由表4 可知，福星牛單株根鮮質(zhì)量（81.49 g）、主根長(zhǎng)（15.96 cm）、主根粗（35.45 mm）和根部產(chǎn)量（3.12 kg/m2）均顯著高于2個(gè)對(duì)照品種（P＜0.05）。在田間自然發(fā)病情況下，福星牛紅皮病病情指數(shù)為15.91，銹腐病病情指數(shù)為1.10，均在三者中最低。

表4 福星牛與福星2號(hào)、大馬牙根部表型性狀和根部病害調(diào)查T(mén)ab.4 Investigation on phenotypic traits and diseases of roots of Fuxingniu，F(xiàn)uxing 2 and Damaya

續(xù)表4 福星牛與福星2號(hào)、大馬牙根部表型性狀和根部病害調(diào)查T(mén)ab.4 Investigation on phenotypic traits and diseases of roots of Fuxingniu，F(xiàn)uxing 2 and Damaya

2.5 福星牛與對(duì)照品種根部人參皂苷含量比較

3 個(gè)參試品種根部9 種主要人參皂苷含量如圖1 所示。由圖1 可知，福星牛9 種皂苷（Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd）的含量分別為0.85%、0.91%、0.17%、0.22%、0.56%、0.20%、0.31%、0.04%、0.03%，其中Re含量顯著高于福星2號(hào)和大馬牙（P＜0.05）。3 個(gè)參試品種有效成分含量均超出了2020版《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》[17]要求的最低標(biāo)準(zhǔn)。其中，福星牛根部人參皂苷Rg1、Re含量合計(jì)為1.76%，比2020 版《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》要求的0.30%高出1.46 個(gè)百分點(diǎn)；Rb1含量為0.56%，比2020 版《中華人民共和國(guó)藥典（一部）》要求的0.20%高出0.36個(gè)百分點(diǎn)。

圖1 福星牛與福星2號(hào)、大馬牙根部9種人參皂苷含量差異Fig.1 Differences in the content of nine kinds of ginsenosides roots of Fuxingniu，F(xiàn)uxing 2 and Damaya

2.6 福星牛與對(duì)照品種性狀變異分析

福星牛、福星2號(hào)和大馬牙的表型性狀、根部產(chǎn)量、抗性與有效成分含量變異情況見(jiàn)表5。由表5可知，3 個(gè)參試品種的30 個(gè)性狀存在不同程度的變異。地上表型性狀中變異系數(shù)最高的為莖粗（25.86%），最低的為葉厚（5.56%）。果實(shí)表型性狀中變異系數(shù)最高的為果穗粒數(shù)（21.75%），最低的為果穗直徑（9.43%）。種子表型性狀中變異系數(shù)最高的為種子厚度（9.26%），最低的為種子長(zhǎng)度（7.68%）。根部表型性狀中變異系數(shù)最高的為紅皮病病情指數(shù)（43.04），最低的為單株根鮮質(zhì)量（11.01 g）。9 種根部人參皂苷含量中變異系數(shù)最高的 是Rg2，達(dá)69.23%；最 低 的 為Rb3和Rd，均 為33.33%。

表5 福星牛與福星2號(hào)、大馬牙生物學(xué)性狀變異分析Tab.5 Variation analysis of biological characters of Fuxingniu，F(xiàn)uxing 2 and Damaya

續(xù)表5 福星牛與福星2號(hào)、大馬牙生物學(xué)性狀變異分析Tab.5（Continued）Variation analysis of biological characters of Fuxingniu，F(xiàn)uxing 2 and Damaya

2.7 福星牛與對(duì)照品種的SSR鑒定

重復(fù)性好、多態(tài)性高的SSR 核心引物可以用于品種資源鑒定，為了篩選出多態(tài)性高的SSR 引物，從50對(duì)SSR 引物中篩選出條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物6 對(duì)（表6）。其中，引物Pg83678 可用于快速鑒別福星牛與對(duì)照品種，引物Pg83678 對(duì)3 個(gè)參試品種擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。由圖2可知，福星牛條帶與2個(gè)對(duì)照品種存在明顯差異。

圖2 特異引物Pg83678對(duì)3個(gè)參試品種PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR results of three tested varieties amplified by specific primer Pg83678

表6 SSR適宜引物序列Tab.6 Sequences of SSR suitable primers

3 結(jié)論與討論

人參的繁殖依賴(lài)于種子，種子的大小對(duì)下一代人參的根部產(chǎn)量有直接影響。王桂郁[18]的研究表明，大種子的種胚更大，胚原基發(fā)育良好，但小種子胚長(zhǎng)值小，裂口率低。ZHANG 等[19]的研究表明，大種子表現(xiàn)出顯著的出苗率，種子越大，主根長(zhǎng)、單株根鮮質(zhì)量和3年生人參根部產(chǎn)量越大。這可能是因?yàn)檩^大的種子含有更多的營(yíng)養(yǎng)和能量，可在子葉獨(dú)立光合作用之前分配更多的資源用于早期生長(zhǎng)。本研究中，福星牛種子長(zhǎng)度和種子寬度顯著高于其他品種（P＜0.05），為大粒人參種子。在后續(xù)的品種推廣中，可以有針對(duì)性地進(jìn)行推廣。

人參的商品性很強(qiáng)，其經(jīng)濟(jì)效益直接取決于根部產(chǎn)量，在中國(guó)人參品種中，吉參1號(hào)[20]、福星2號(hào)是高產(chǎn)代表。本研究3 個(gè)品種中，福星牛根部產(chǎn)量可達(dá)3.12 kg/m2。人參銹腐病和人參紅皮病是常見(jiàn)的人參根部病害，對(duì)人參的根部產(chǎn)量和品質(zhì)均有影響，中國(guó)人參品種中，中農(nóng)皇封參對(duì)連作常見(jiàn)的人參銹腐病和人參紅皮病具有很強(qiáng)的抗性[21-22]。本研究中的3 個(gè)品種中，福星牛的銹腐病病情指數(shù)和紅皮病病情顯著低于2個(gè)對(duì)照品種（P＜0.05）。

根部人參皂苷含量的高低是衡量人參品質(zhì)的重要指標(biāo)。Rb1具有抑制中樞神經(jīng)、催眠、鎮(zhèn)痛、解熱、促進(jìn)血清蛋白合成等作用，抑制中性脂肪的分解及促進(jìn)膽固醇的合成[23]；Rb2具有促進(jìn)腦中樞調(diào)節(jié)、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消除體內(nèi)自由基、改善心肌缺血再灌注損傷的功效[24]；Rb3具有修復(fù)高血壓患者受損的動(dòng)脈血管內(nèi)皮的功效[25]；Rc 是甾體分子，抑制癌細(xì)胞的增殖，可增加精子的運(yùn)動(dòng)能力；Rd 可增強(qiáng)免疫受抑小鼠的細(xì)胞功能；Re 抑制中樞神經(jīng)，促進(jìn)RNA、DNA 合成；Rg1具有興奮中樞神經(jīng)、促進(jìn)疲勞恢復(fù)、促進(jìn)RNA 和DNA 合成的功效；Rg2有抑制血小板凝集的作用；Rf 具有鎮(zhèn)痛和抗炎的作用[26]。本研究首次對(duì)福星牛、福星2 號(hào)和大馬牙根部9 種主要皂苷含量進(jìn)行了對(duì)比，其中福星牛Re含量顯著高于2個(gè)對(duì)照品種（P＜0.05）。

性狀的變異頻率是性狀遺傳多樣性量化指標(biāo)，變異系數(shù)越大，優(yōu)良資源選擇的余地越大。3個(gè)參試品種間莖、葉、果實(shí)、根部和人參皂苷含量的部分性狀變異系數(shù)超過(guò)10%，說(shuō)明3 個(gè)參試品種間表型存在差異。表型性狀易受外界環(huán)境等因素的影響，僅通過(guò)表型性狀對(duì)其鑒定區(qū)分難度較大。因此，育種工作中需要結(jié)合DNA 分子標(biāo)記進(jìn)行快速精準(zhǔn)鑒定，選育優(yōu)良人參品種。SSR具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、較表型鑒定更準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在其他作物品種鑒定中應(yīng)用較多，然而利用SSR 進(jìn)行人參品種鑒定的研究鮮有報(bào)道。本研究中，共篩選出6 條條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性好的適宜引物，其中，引物Pg83678可用于快速鑒別福星牛與對(duì)照品種。

人參育種較其他作物起步晚，目前，人參育種主要采用集團(tuán)選育[27]。但集團(tuán)選育需要對(duì)現(xiàn)有遺傳資源進(jìn)行收集和篩選，并不能將不同品種的優(yōu)良基因進(jìn)行組合，且育種周期長(zhǎng)，在品種優(yōu)化上難以有較大的創(chuàng)新與突破。隨著生物技術(shù)手段的不斷進(jìn)步和研究的不斷深入，在后續(xù)的品種改良和品種選育工作中，應(yīng)加大雜交育種和分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的研究力度，在利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建人參遺傳連鎖圖譜的同時(shí)，挖掘更多人參資源的遺傳信息，開(kāi)發(fā)優(yōu)良性狀的分子標(biāo)記，在培育高產(chǎn)、抗病、優(yōu)質(zhì)人參新品種的同時(shí)，為推進(jìn)人參育種進(jìn)程做出貢獻(xiàn)。