海南4 個地區(qū)犬體表蜱種鑒定及其無形體攜帶情況

周 颯，林 洋，祖海月，王金花

（海南大學 動物科技學院，?？?570228）

蜱蟲是一種專性吸血的體外寄生蟲，它們可以從包括人類在內的哺乳動物、鳥類和爬行動物身上吸血，從而傳播各種疾病，被認為是僅次于蚊子的重要傳播媒介。它們傳播的病原體種類很廣，包括病毒、細菌、立克次體、原蟲，甚至某些蠕蟲（微絲蚴）[1-2]。無形體（Anaplasma）是經由蜱媒傳播的一種革蘭氏陰性菌，隸屬于立克次體目（Rickettsiales）無形體科（Anaplasmataceae），目前常見的無形體有7 種，分別是嗜吞噬細胞無形體（Anaplasma pagocytophilum）、牛無形體（Anaplasma bovis）、綿羊無形體（Anaplasma ovis）、山羊無形體（Anaplasma capra）、扁平無形體（Anaplasma platys）、邊緣無形體（Anaplasma marginale）及中央無形體（Anaplasma centrale）。

20 世紀90 年代初，在美國首次發(fā)現了人粒細胞無形體病的確診病例[3]。2006 年在我國安徽省

也出現了該病例，并發(fā)現該病原可通過HGA 患者血液或呼吸道分泌物進行傳播[4]。牛無形體主要分布在非洲、亞洲和南美洲。牛和水牛被認為是牛無形體的主要宿主，但在我國的犬中也發(fā)現了牛無形體的存在[5]。扁平無形體主要侵染犬的血小板，引起犬傳染性循環(huán)血小板減少癥。1978 年Harvey 和他的同事在美國佛羅里達州的一例犬感染中首次描述了這種疾病[6]。有研究表明血紅扇頭蜱（Rhipicephalus sanguineus）是扁平無形體的生物媒介[7]。扁平無形體在血蜱和犬中廣泛流行，美國、阿根廷、巴西、格林納達、智利、海地、意大利、葡萄牙、馬來西亞等國家和中國臺灣省均有報道[8-19]；在阿爾及利亞的家畜中[20]、中國的山羊[21]和貓[22]中也檢測到了扁平無形體；一些南美和加勒比國家[23-24]也有報道人被扁平無形體感染的案例。由此可見，扁平無形體對包括人類在內的廣泛宿主物種構成威脅。

無形體病是一種蜱傳疾病，主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)流行，不僅會對家畜的健康和生產力造成嚴重的影響，還會威脅到人類的健康。該病已被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為B 類動物傳染病，也被我國農業(yè)部列為進出口動物檢疫項目之一[25]。海南全年暖熱，雨量充沛，植被豐富，適合蜱類生長，目前海南省硬蜱有6 屬20 種，并且是斑點熱的疫源地[26]。但迄今為止，海南省乃至中國對于犬寄生蜱及其攜帶的病原報道較少。另外，隨著寵物數量的劇增，寵物蜱傳人獸共患病的發(fā)病率也不斷升高，有研究發(fā)現，養(yǎng)寵物的人被蜱叮咬的可能性約為不養(yǎng)寵物的人的1.5 倍[27]，因此，探究海南犬寄生蜱種類及其攜帶扁平無形體的情況，有助于進一步了解海南犬蜱的分類組成，可為動物寄生蜱種類分布及預防蜱傳疾病提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及其處理樣本從海南省白沙、樂東、定安、屯昌4 個地區(qū)的犬體表獲得，主要使用宿主體表檢查法，著重檢查犬只易被蜱蟲叮咬的部位，如犬耳、頸部、腋窩、胸部、腹股溝、肛周、腿跟等易感染部位，發(fā)現蜱蟲后，使用鑷子夾住蜱蟲的頭部并將其放入干凈的離心管中。共采集犬體表寄生蜱蟲546 只。將采集到的蜱蟲用75%酒精漂洗3～5 次，洗去表面雜質，再用滅菌蒸餾水沖洗3 次后放入75%酒精的樣本管中保存。

1.2 試劑及儀器主要試劑：2×TaqPlus Master MixII(Dye Plus)購自南京諾維贊生物科技股份有限公司；Goldview 染料購自蘇州金唯智生物科技有限公司；瓊脂糖、動物基因組DNA 提取試劑盒；DNA Marker 購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

主 要 儀 器：PCR 儀（TProfessional）購 自 德 國Biometra 公司，小型臺式高速冷凍離心機（5415R）購自Eppendorf 公司，體視顯微鏡購自Saike Digital 公司，瓊脂糖水平電泳儀（Mini-PROTEAN Tetra）購自北京六一儀器廠，凝膠成像分析系統(tǒng)（GEL DOC XR+）購自美國 Bio-Rad 公司。

1.3 蜱的形態(tài)學鑒定參照中國畜禽外寄生蟲形態(tài)分類彩色圖譜，用體視顯微鏡對蜱蟲進行初步的形態(tài)學鑒定，主要觀察蜱蟲的假頭基、盾板、氣門板、生殖孔、肛側板、肛溝和基節(jié)等具有形態(tài)學鑒定意義的部位，最終確定蜱蟲種類并拍攝相應的圖片。

1.4 DNA 提取取出上述經過形態(tài)學鑒定的蜱蟲，每只放入1.5 mL 離心管中，再用ddH2O 反復沖洗，去除表面雜質，干燥后將蜱蟲磨碎，再參照動物基因組DNA 提取試劑盒說明書提取蜱蟲DNA，并于-20 ℃保存。

1.5 PCR 檢測查找蜱種鑒定及無形體檢測相關的引物序列送至廣州天一輝遠基因科技有限公司合成，本研究使用的引物信息見表1。嗜吞噬細胞無形體和牛無形體使用巢氏PCR 進行擴增。扁平無形體和牛無形體使用常規(guī)PCR 進行擴增。PCR 反應體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上游引物（濃度10 pmol·μL-1）0.5 μL，下游引物（濃度10 pmol·μL-1）0.5 μL，基因組DNA（～20 ng）1 μL。PCR 反應擴增條件見表2。反應結束后，取5μL PCR 產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察是否有目的條帶，并拍照保存。將所獲得的陽性產物送往廣州天一輝遠基因科技有限公司進行測序。

表1 引物信息

表2 PCR 擴增條件

1.6 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建使用NCBI中BLAST 在線比對工具將蜱種鑒定及扁平無形體的測序結果與GenBank 中已知序列進行比對分析，利用DNAMAN 8.0 基因分析軟件進行同源性分析，使用Mega X 軟件，選擇Neighbor-joining（NJ）算 法 中 的Kimura-2-parameter 參 數 模 型，Bootstrop 值選擇1 000 進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建。

2 結果與分析

2.1 蜱的形態(tài)學鑒定經形態(tài)學鑒定，546 只犬寄生蜱均屬于扇頭蜱屬中的血紅扇頭蜱，其中雌蜱265 只，雄蜱281 只。蜱蟲外部形態(tài)觀察結果見圖1。

圖1 血紅扇頭蜱外部形態(tài)

2.2 蜱的分子生物學鑒定及種系發(fā)育分析犬寄生蜱的16SrDNA基因PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳見圖2，擴增片段為460 bp，與預期片段長度一致。通過序列比對之后，發(fā)現本實驗中所有蜱蟲均為血紅扇頭蜱，與Genbank 中已有的蜱種參考株Rhipicephalus sanguineus（登錄號為MG651947）的同源性為100%，與形態(tài)學鑒定結果相符。用MEGA-X 軟件選擇本實驗中獲得的代表性血紅扇頭蜱線粒體16SrDNA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），分析結果表明序列HN-01 和HN-02 處于不同的遺傳進化分支，HN-01 與已知的來自美國的血紅扇頭蜱(MH018842)處于同一分支，HN-02 與來自泰國的血紅扇頭蜱（KC170744）處于同一分支，與我國甘肅省、北京市所獲得的血紅扇頭蜱（JF979377、KC203362）序列親緣關系較遠。

圖2 16S rDNA 基因PCR 擴增結果電泳圖

圖3 基于16S rDNA 基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 犬蜱攜帶無形體的PCR 檢測結果筆者在犬體表蜱中未檢測到嗜吞噬細胞無形體和牛無形體，只發(fā)現了犬蜱中攜帶有扁平無形體。犬體表蜱3 種無形體感染率見表3。犬蜱攜帶扁平無形體gltA基因的PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳見圖4，結果顯示擴增產物在580 bp 處出現目的片段，與預期片段大小相符。擴增序列測序后經Blast 比對后與GenBank 上已有的扁平無形體序列同源性為100%。

表3 3 種無形體感染率

圖4 gltA 基因PCR 擴增結果電泳圖

3 討 論

3.1 犬體表蜱種蜱蟲是犬只常見的外寄生蟲，研究報道，有多種蜱類可以寄生在犬的體表，如血紅扇頭蜱(Rhipicephalus sanguineus)、長角血蜱(Haemaphysalis Iongicornis)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、草 原 血 蜱(Haemaphysalis verticalis)、圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalus turanicus)、鈴頭血蜱(Haemaphysalis campanulata)等，但由于各地地理環(huán)境不同，其優(yōu)勢蜱種也不同。宋勝男等[32]在2021 年通過PCR 檢測的方法鑒定出石河子地區(qū)寵物犬體表436 只圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalus turanicus)，它也是新疆地區(qū)的優(yōu)勢蜱種。張艷等[33]在2021 年通過PCR 的方法鑒定出河南犬體表2 只長角血蜱(Haemaphysalis Iongicornis)，1 只褐黃血蜱(Haemaphysalis flava)。張儉偉等[34]在2017 年統(tǒng)計了我國中東地區(qū)20 個城市寵物犬體表蜱蟲種類，其中杭州、福州、廣州、廈門、深圳、南寧、青島、太原和長沙地區(qū)為血紅扇頭蜱；鄭州、石家莊、濟南和重慶地區(qū)為長角血蜱；上海、北京、天津、西安和寧波地區(qū)則均存在血紅扇頭蜱與長角血蜱。陳紹基等[35]在2020 年通過PCR 檢測出重慶市榮昌區(qū)中華田園犬體表有長角血蜱。本研究通過形態(tài)學和分子生物學相結合的方法鑒定出犬體表寄生蜱均為血紅扇頭蜱，與國內大部分地區(qū)犬體表蜱蟲鑒定結果一致[36-38]。血紅扇頭蜱對環(huán)境適應性強，廣泛分布于世界各地[39]，它也是犬最常見的寄生蜱種。本次調查結果顯示蜱種種類分布較為單一，這也證明了血紅扇頭蜱是犬的優(yōu)勢蜱種，這一方面是因為血紅扇頭蜱本身屬于熱帶物種，海南島炎熱的氣候條件為其提供了良好的生存環(huán)境；另一方面可能是由于采樣點的局限性造就了單一蜱種，因此，要獲得更豐富的犬寄生蜱種類資料，還需要擴大采樣范圍及樣本數量。

基于蜱蟲16SrDNA基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，本試驗中所得到的HN-01 和HN-02 序列處于同一大的分支上，但分別聚集在不同的小分支上，HN-01 序列與美國所得到的血紅扇頭蜱同源性較高，HN-02 序列與泰國的血紅扇頭蜱同源性較高，然而2 個序列與國內甘肅、河北等地的血紅扇頭蜱親緣關系較遠。這可能是由于海南獨特的地理位置造成蜱種地域差異性。

3.2 犬體表蜱攜帶無形體在國內外，關于蜱蟲感染無形體的報道有很多。Hosseini 等[40]在伊朗不同的地理區(qū)域分別鑒定出亞洲璃眼蜱(Hyalomma asiaticum)、單峰駝璃眼蜱(H.dromedarii)、血紅扇頭蜱(Rhipicephalus sanguineus)和牛蜱(Boophilus)，并在牛蜱中獲得一條邊緣無形體序列和在血紅扇頭蜱中獲得2 條綿羊無形體序列。Qin 等[41]調查了我國山東省膠南市長角血蜱中無形體的感染率，結果發(fā)現嗜吞噬細胞無形體、牛無形體和山羊無形體的感染率分別為0.10%、1.55%和0.33%。然而，在我國集中于犬體表寄生蜱攜帶無形體的調查研究較少。本試驗通過對采集的所有犬體表蜱蟲進行無形體16SrRNA和gltA基因的PCR 檢測結果發(fā)現扁平無形體陽性率為1.1%（6/546），未檢測到嗜吞噬細胞無形體和牛無形體。2018 年韓宏曉等[36]通過PCR 的方法鑒定出上海地區(qū)寵物犬體表的血紅扇頭蜱，并對蜱蟲攜帶嗜吞噬細胞無形體的情況進行了調查，結果也未檢測到，與本試驗結果一致。Yuasa[19]在2017 年用PCR 檢測的方法調查了臺灣省犬體表寄生血紅扇頭蜱攜帶扁平無形體的陽性率為3.6% (11/306），這一結果高于本實驗調查得到的扁平無形體陽性率。盡管本試驗中檢測到的犬蜱感染扁平無形體的陽性率較低，但是這也間接反應了犬只本身感染扁平無形體的情況，這也需要后續(xù)對犬只進行更加深入的調查。

此外，我國養(yǎng)寵家庭逐年上升，犬作為一種伴侶動物并且與人類的活動息息相關，二者均存在被蜱叮咬并感染蜱傳疾病的危險。雖然扁平無形體還未被公認為是一種人獸共患病原，但已有感染人的記錄。據報道，在委內瑞拉的2 名女性患者中檢測到扁平無形體的病原[23]。為了避免蜱蟲叮咬及感染蜱傳疾病的危險，犬主應加強對犬只的行為約束，避免帶犬只去野外或草地玩耍，另外也應定期對犬只進行衛(wèi)生管理，定期驅蟲，做好防蜱滅蜱工作。

4 結 論

本試驗對海南部分地區(qū)犬體表寄生蜱進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，結果全為血紅扇頭蜱。并通過PCR 的方法對蜱蟲進行了無形體的檢測，結果表明犬體表蜱攜帶扁平無形體的陽性率為1.1%（6/546），沒有檢測到嗜吞噬細胞無形體和牛無形體。