臨床分離糞腸球菌的毒力基因和耐藥基因檢測(cè)及其耐藥性研究

王 昕，韓 語，潘紀(jì)汶，楊 諾，鄭立新，曾紀(jì)鋒，郭桂英，鄭繼平

（1.海南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海口 570228; 2.海南大學(xué) 校醫(yī)院 ，海口 570228;3.海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，海口 570228; 4.海南大學(xué) 理學(xué)院，?？?570228）

女性陰道正常狀態(tài)下存在大量的菌群，這些陰道微生物與宿主之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，而平衡的打破則會(huì)導(dǎo)致各種條件致病菌滋生，繼而引發(fā)感染，如陰道炎、宮頸炎。在不同的報(bào)道中，陰道炎患者的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）檢出率都處于較高的水平[1-2]，且隨著抗生素的廣泛使用，耐藥性糞腸球菌也在不斷增加。目前，腸球菌（Eenterococcus）在臨床上是作為僅次于金黃色葡萄球菌的第二大類革蘭氏陽性病原菌[3]，而糞腸球菌則是腸球菌中檢出率校高的菌種之一。腸球菌除了對(duì)一些臨床常用抗生素如β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素等固有耐藥外，還可通過交換質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等方式對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、糖肽類、四環(huán)素類等產(chǎn)生新的獲得性耐藥，這將對(duì)使用抗生素進(jìn)行臨床治療帶來很大的困難。除此以外，腸球菌本身還具備多種毒力基因，如：（1）cylA 是具有殺菌活性的雙肽抗生素，是激活細(xì)胞溶素的必要條件之一，可裂解大量真核細(xì)胞和革蘭氏陽性細(xì)胞；（2）gelE 是細(xì)胞外金屬肽酶，可水解明膠酶，膠原蛋白，血紅蛋白和其他生物活性化合物，fsr雙組分系統(tǒng)可調(diào)控其基因表達(dá)；（3）esp是參與免疫逃避的膜結(jié)合表面蛋白，其分子量在腸球菌表面最大，與感染有關(guān)；（4）efaA 是一種細(xì)胞壁粘附素；（5）cpd是一種性信息素，對(duì)人類白細(xì)胞有趨化作用；（6）asa1 是一種具有凝集作用的蛋白，可起到增強(qiáng)粘附的作用；（7）ace和acm是一種膠原結(jié)合蛋白，其可使腸球菌結(jié)合在宿主細(xì)胞的膠原蛋白上，完成定植，引發(fā)致?。唬?）hyl可產(chǎn)生具有侵襲性作用的透明質(zhì)酸酶[4-8]。這些毒力基因可使糞腸球菌通過黏附、定植以及逃避宿主免疫應(yīng)答等引起一系列的感染[4]。因此，本研究對(duì)從女性陰道分離的糞腸球菌進(jìn)行毒力基因、耐藥基因及其耐藥性等方面的研究，以便為糞腸球菌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陰 道 拭子 樣 品收 集2017 年3 月 至2018年1 月海南大學(xué)校醫(yī)院婦科門診188 名臨床女性患者陰道分泌物拭子（一次性使用無菌拭子）。

1.2 培養(yǎng)基腦心浸出液（Brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、法國科瑪嘉鏈球菌顯色培養(yǎng)基。

1.3 藥敏紙片萬古霉素、青霉素、氨芐西林、紅霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、利奈唑胺、替考拉寧、呋喃妥因、氯霉素，均購于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.4 試劑革蘭氏染色試劑盒購于南京建成科技 有 限 公 司；2×F8 Fast Long PCR Master mix、2×A8 Fast HiFi PCR Master Mix、PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒、DL2000 DNA Marker 均購于北京艾德萊生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（Bacterial DNA Isolation Kit）購于北京華越洋生物科技有限公司。

1.5 細(xì)菌的分離與鑒定醫(yī)院用無菌拭子采集女性患者陰道后穹窿內(nèi)分泌物，立即放入無菌管-4 ℃保存，隨即轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室。利用顯色培養(yǎng)基接種菌株，將顏色顯深藍(lán)、淺紫色且鏡檢為鏈球狀的單菌落接種于5 mL BHI 液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。以DNA 為模板用PCR 的方法進(jìn)行16S rRNA 鑒定，16S rRNA 引物序列為：F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；R: CGGTTACCT TGTTACGACTT。反應(yīng)體系見表1。PCR 結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，送往北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，同源性＞96%的結(jié)果判定為該菌株的鑒定結(jié)果。利用MEGA X 軟件，通過1 000 個(gè)重復(fù)計(jì)算Bootstrap值，用鄰接法制備了系統(tǒng)發(fā)育樹，并與代表物種進(jìn)行了比較。從NCBI 獲得以下菌株的參考基因序列：E.faecalis2358 (MT604811.1)、E.faecalisGX26(KU937389.1)、E.faecalis4358 (MT544896.1)、Enterococcus durans98D (NR_036922.1)、Enterococcus hiraeR (NR_037082.1)、Enterococcus raffinosus1789-79 (NR_026499.1)、Enterococcus pseudoavium47-16 (NR_028705.1)、Enterococcus faeciumLMG-11423 (NR_0 42054.1)、Enterococcus aviumE6844(NR_028748.1)、Enterococcus casseliflavusNBRC 100478 (NR_104560.1)、Staphylococcus aureusATCC12600 (NR_118997.2)、Streptococcus agalactiaeATCC13813 (NR_040821.1)。最終對(duì)分離到的糞腸球菌進(jìn)行編號(hào)，對(duì)菌株分離時(shí)間、分離地點(diǎn)等信息進(jìn)行記錄。然后菌液與30%的甘油以1∶1 的比例存放于-80℃。

表1 16S rRNA 反應(yīng)體系

1.6 毒力基因的檢測(cè)參考文獻(xiàn)[9 - 12]，對(duì)分離到的糞腸球菌進(jìn)行10 種毒力基因[腸球菌表面蛋白基因（enterococcus surface protein,esp）、輔助定植因子基因（accessory colonization factor,ace）、膠原蛋白結(jié)合粘附素基因（adhesion of collagen,acm）、明膠酶基因（gelatinase,gelE）、聚集性物質(zhì)基因（aggregation substance,asa1）、細(xì)胞溶素基因（cytolysin,cylA）、雙分子調(diào)控系統(tǒng)基因（fsr）、透明質(zhì)酸酶基因（Hyalronidase,hyl）、心內(nèi)膜炎抗原基因（endocarditis antigen,efaA）、性 信 息 素（sex pheromones,cpd）] 的PCR 擴(kuò)增，引物詳見表2。

表2 毒力基因引物序列

1.7 藥敏試驗(yàn)按照Kirby-Bauer (K-B)紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。以金黃色葡萄球（S.aureus）ATCC25923為藥敏質(zhì)控菌株，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）最新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.8 耐藥基因的檢測(cè)參考文獻(xiàn)[5,13]對(duì)分離到的糞腸球菌進(jìn)行9 種耐藥基因[包括糖肽類耐藥基因vanA、vanB、vanC；氨基糖苷類藥物耐藥基因aac(6')/aph(2')、ant(6)-1；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)基因ermB、mefA；四環(huán)素類藥物耐藥基因tetM，β-內(nèi)酰胺酶基因tem] 的PCR 擴(kuò)增，引物序列見表3。

表3 耐藥基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定從188 名女性陰道分泌物拭子分離出157 株菌，通過顏色（藍(lán)色、淺紫色）、鏡檢（鏈球狀）挑選符合糞腸球菌特征的57 株菌進(jìn)行16S rRNA 鑒定。從57 株臨床標(biāo)本菌株中得到22 株糞腸球菌，排除同一患者分離的相同菌株。以16S rRNA 構(gòu)建的支序圖如圖1所示。

圖1 糞腸球菌支序圖

2.2 臨床標(biāo)本分布情況在22 株糞腸球菌中，10 株來自陰道炎患者，5 株來自膀胱炎患者，2 株來自尖銳濕龐患者，1 株來自膀胱刺激癥患者，1 株來自白塞氏病患者，1 株來自子宮內(nèi)膜息肉患者，1 株來自備孕人員，1 株來自人流術(shù)后人員。這些菌株在這些人體內(nèi)并沒有交叉存在的情況。

2.3 毒 力基因檢測(cè)結(jié)果以DNA 為 模 板 用PCR 的方法進(jìn)行毒力基因檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。10 種毒力基因在糞腸球菌中有著很高的檢出率，除hyl未被檢出外，其余9 種基因的檢出率都在50%以上。依檢出率由高到低依次是efaA（100%，22/22）、asa1（90.9%，20/22）、cylA（90.9%，20/22）、fsr（90.9%，20/22）、cpd（90.9%，20/22）、acm（86.4%，19/22）、gelE（81.8%，18/22）、esp（68.2%，15/22）、ace（54.5%，12/22）。

圖2 糞腸球菌毒力基因結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果13 種抗生素的藥敏紙片結(jié)果顯示，糞腸球菌對(duì)萬古霉素、呋喃妥因、利奈唑胺、替考拉寧敏感性好，對(duì)其他抗菌藥物則均表現(xiàn)不同程度的耐藥，其中對(duì)鏈霉素和四環(huán)素的耐藥率較高，具體耐藥率見表4。

表4 糞腸球菌藥敏紙片耐藥率結(jié)果

2.5 耐 藥基因檢測(cè)結(jié)果以DNA 為 模 板 用PCR 的方法進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，9 種耐藥基因在糞腸球菌中的檢出結(jié)果如圖3 所示，除了vanA（0%）、vanB（0%）和vanC（18.2%）有著較低的檢出率外，其余6 種基因的檢出率分別為aac(6')/aph(2')（40.9%）、ant(6)-1（59.1%）、ermB（68.2%）、mefA（54.5%）、tetM（72.2%）和tem（81.8%），其中四環(huán)素類耐藥基因和β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因都有著很高的檢出率。

圖3 糞腸球菌耐藥基因結(jié)果

3 討 論

糞腸球菌是女性陰道中正常菌群之一，但當(dāng)陰道黏膜受損時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致這些條件致病菌群比例失調(diào)引起感染。由于在生理構(gòu)造上十分接近，增強(qiáng)了細(xì)菌從陰道轉(zhuǎn)移到泌尿道的可能，因此陰道炎的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)引起泌尿生殖系統(tǒng)疾病，尤其是尿路感染（UTI）[14]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，糞腸球菌是引起尿路感染的主要病原菌[15]。因此，研究該菌毒力基因、耐藥基因及其耐藥性的關(guān)系十分重要，可以為臨床用藥提供參考。近年來腸球菌毒力基因或潛在的毒力基因在糞腸球菌中的分布研究較多，不同來源、不同種糞腸球菌毒力基因檢出率存在較大差異，可能是地區(qū)、人群、標(biāo)本等不同造成的。22 株來自海南大學(xué)校醫(yī)院分離的菌株中，其9 種毒力基因的檢出率均大于50%，僅有hyl基因未檢出。22 株糞腸球菌攜帶多重毒力基因，所有糞腸球菌可同時(shí)表達(dá)5 種以上毒力，其中同時(shí)含8 種毒力基因的糞腸球菌最多占40.9%，含5 種毒力基因的菌株最少占9.1%，這個(gè)結(jié)果與祝進(jìn)[16]的研究結(jié)果相同。esp的檢出率與許婧[4]的研究結(jié)果相符，均在65%左右，且同樣的hyl未被檢出。gelE具有較高的檢出率，這與Sharifi[17]等的研究結(jié)果相同。cylA 的檢出率一般為40%，而本研究含cylA 的糞腸球菌高達(dá)90.9%。祝進(jìn)[16]的研究樣本來自浙江，cylA、esp和gelE 的檢出率分別為38.9%、52.2%和47.8%。白耀霞[9]等的研究樣本來自江蘇，cylA、esp和gelE 的檢出率分別為30.77%、56.41%和58.97%。祝進(jìn)[16]與白耀霞[9]等的研究相比，其毒力基因檢出率很是接近。而本研究樣本來源于海南，cylA 和gelE 的檢出率比文獻(xiàn)[9,16]的檢出率有較大的上升幅度，其他基因如asa1、acm、cpd和efaA 和文獻(xiàn)[9,16]相比差別也很大。由此可以反映出，不同地區(qū)糞腸球菌毒力因子的檢出率有較大的差異。cpd基因的存在有助于獲得相關(guān)的性信息素質(zhì)粒，可以獲得相關(guān)的毒力和耐藥決定因素。因此，筆者推測(cè)在本研究的分離株中存在多重耐藥可能與cpd基因的高攜帶率有關(guān)[6]。在本研究中efaA 的檢出率高達(dá)100%，這與Creti等[5]的研究結(jié)果一致。Eaton[7]等的研究表明，efaA 基因始終存在于醫(yī)學(xué)糞腸球菌分離物中，并且大多數(shù)（89%）來自食品的糞腸球菌菌株具有efaA 決定因子，因此，以efaA 為基因靶，可用于對(duì)糞腸球菌的分子檢測(cè)。

隨著抗生素的出現(xiàn)和使用，腸球菌的耐藥性逐年升高，已成為主要致病菌。在本實(shí)驗(yàn)中，耐藥表型與基因型相符程度很高，且81.8%的糞腸球菌攜帶2 種以上耐藥基因。自2005 年以來，糞腸球菌對(duì)氨芐西林的耐藥率在國內(nèi)呈現(xiàn)逐年下降的趨勢(shì)，且維持在10%以下[18]。在臨床上，β-內(nèi)酰胺類抗生素一直被用于治療各種疾病。本研究中糞腸球菌對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)50%，編碼β-內(nèi)酰胺類的基因tem陽性率達(dá)81.8%，此結(jié)果暗示海南?？诘貐^(qū)存在氨芐西林使用過度問題，導(dǎo)致該地區(qū)的糞腸球菌對(duì)氨芐西林的耐藥性增強(qiáng)。因此，在之后的臨床治療中應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇性使用β-內(nèi)酰胺類抗生素，以防止糞腸球菌選擇性獲得該耐藥基因，給后續(xù)的治療帶來困難。氨基糖苷類抗生素，如慶大霉素整體呈現(xiàn)耐藥率降低的現(xiàn)象[19-21]，本研究中慶大霉素的耐藥率也處于較低的水平。除此以外，其他抗生素的耐藥率都與國內(nèi)現(xiàn)狀基本相同。自1988 年首次報(bào)道耐萬古霉素腸球菌（VRE）后，在世界各地都陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)了耐藥菌[22-23]。VRE 分為9 個(gè)表型,vanA、vanB、vanC（C1, C2, C3）、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM、vanN，其中VanA 和VanB 是臨床上最常見的耐萬古霉素基因型且有重要臨床意義，且以vanA 最常見[24]。高VRE 的存在給人類的健康帶來了嚴(yán)重的威脅，并在部分地區(qū)引起較高的死亡率。在國內(nèi)，除了臺(tái)灣地區(qū)VRE 檢出率較高外，其余地區(qū)與世界水平相比，仍處于較低的水平[18,25]。在本試驗(yàn)中未檢測(cè)到攜有vanA 和vanB 的耐藥基因菌株以及耐萬古霉素和耐替考拉寧的菌株，這與其他人的研究結(jié)果相同[19-20,26]，說明?？诘貐^(qū)的糞腸球菌對(duì)糖肽類抗菌藥物有著高度敏感性。因此，?？诘貐^(qū)可采用萬古霉素對(duì)糞腸球菌進(jìn)行治療，但要注意用量且及時(shí)檢測(cè)，以防出現(xiàn)VRE。

本次研究從臨床分離得到的22 株糞腸球菌，其毒力基因檢出率較高，耐藥基因的檢出與耐藥表型結(jié)果基本符合。22 株糞腸球菌對(duì)氨芐西林的耐藥率與全國水平相比偏高，推測(cè)可能是與當(dāng)?shù)剡^度使用氨芐西林抗生素有關(guān)，應(yīng)引起注意。但22 株糞腸球菌對(duì)萬古霉素、呋喃妥因、利奈唑胺和替考拉寧均無耐藥情況，這為今后的臨床治療提供了一定的科學(xué)用藥參考。