即時、定量黃曲霉毒素M1熒光淬滅免疫層析檢測法建立和評價

孔凡虹，劉 麗，董成亞，何 露，王 丹，劉 穎，王雅杰，3

（1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050；2．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實驗室，北京100050；3．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科，北京100050）

·方法研究·

即時、定量黃曲霉毒素M1熒光淬滅免疫層析檢測法建立和評價

孔凡虹1，劉 麗2，董成亞2，何 露1，王 丹1，劉 穎1，王雅杰2，3

（1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050；2．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實驗室，北京100050；3．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科，北京100050）

目的利用原創(chuàng)性熒光淬滅免疫層析技術(shù)進行黃曲霉毒素M1（AFM1）快速、定量檢測方法的探索。方法對原創(chuàng)性AFM1檢測試紙條從靈敏度、重復(fù)性與準(zhǔn)確性方面進行性能驗證，同酶聯(lián)免疫吸附法原理的AFM1檢測試劑進行比對研究。結(jié)果熒光淬滅免疫層析AFM1檢測試紙條最低檢測下限為0．075ng／mL，批內(nèi)變異系數(shù)≤7．3%，回收率為65．8%～94．1%。AFM1熒光淬滅免疫層析檢測試紙條與酶聯(lián)免疫法檢測試劑具有良好的相關(guān)性（R2＝0．9659）。結(jié)論熒光淬滅免疫層析AFM1檢測試紙條可靈敏、準(zhǔn)確、定量檢測牛乳中的AFM1。

熒光淬滅； 免疫層析； 黃曲霉毒素M1； 即時檢測

世界糧農(nóng)組織報告，每年大約有25%的農(nóng)作物受到真菌和真菌毒素的污染，其中最常見的真菌毒素為黃曲霉毒素[1]。黃曲霉毒素屬于I類致癌物。其中，黃曲霉毒素B1毒性比氰化鉀大10倍，比砒霜大68倍，是毒性極強的劇毒物質(zhì)[2]。黃曲霉毒素是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，均為二氫呋喃香豆素的衍生物，主要是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。它們存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麥等糧油產(chǎn)品。目前已分離鑒定出的黃曲霉毒素有20種，主要是黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2以及M1、M2[3-4]。其中AFM1為動物攝入AFB1后在體內(nèi)經(jīng)過羥基化形成的產(chǎn)物，可隨動物尿液、乳汁排出。乳品中黃曲霉毒素主要存在形式為AFM1，AFM1在乳制品的加工處理過程中可長期穩(wěn)定存在，并且有強烈的損害肝和致癌作用[5]。對食品中的黃曲霉毒素進行檢測對于食品安全具有十分重要的意義，本文利用原創(chuàng)性熒光淬滅免疫層析技術(shù)（background fluorescence quenching immunochromatographic assay，bFQICA）[6]進行牛奶中AFM1快速、定量檢測方法的探索。

材料和方法

1 實驗材料

試劑：熒光淬滅免疫層析AFM1檢測試紙條購自上海容暉生物科技有限公司（試劑批號14121501）；AFM1酶聯(lián)免疫法快速檢測試劑盒購自奧地利（試劑批號20140819，AgraQuant?）；生鮮牛乳購自北京三元食品有限公司。儀器：Simp1型熒光淬滅免疫層析分析儀（上海鑫譜生物科技有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（IC412C，日本 yamato）；微型離心機（sorvall legend micro17，Thermo Fisher）。

2 實驗步驟

檢測牛奶中AFM1的實驗步驟（見圖1）：①取生鮮牛乳樣本離心，取下層液體200μL置于淬滅抗體試劑杯中，恒溫箱中30℃孵育5min，使樣本中的AFM1與淬滅抗體充分結(jié)合。取60μL樣本滴加于熒光淬滅免疫層析AFM1檢測試紙條加樣孔中，并于恒溫箱中30℃孵育12min。②整張測試膜預(yù)先包被熒光物質(zhì)，牛乳樣本加入樣品孔后，在毛細作用下沿硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC膜）向吸水墊方向移動。當(dāng)樣本流動至檢測線（test line，T線）時，游離的淬滅抗體與固定在T線處的AFM1-BSA結(jié)合，形成淬滅抗體-AFM1-BSA復(fù)合物，并使T線處背景熒光發(fā)生淬滅。③過量的游離淬滅抗體繼續(xù)遷移，與固定在質(zhì)控線（control line，C線）的對照劑（抗淬滅抗體的抗體）反應(yīng)，并使C線處背景熒光發(fā)生淬滅，提示檢測體系有效。④定量結(jié)果通過記錄檢測試紙條窗口熒光信號變化來進行定量計算。采用Simp1型熒光淬滅免疫層析分析儀測量NC膜上T線處的背景熒光（F2）和NC膜其他位置背景熒光（F1），取F2／F1作為AFM1濃度的效應(yīng)值，AFM1標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其對應(yīng)的效應(yīng)值可擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2），讀取檢測試紙條上二維碼中包含的該標(biāo)準(zhǔn)曲線信息，即可獲得AFM1濃度。

3 檢測試紙條性能的評價

3．1 最低檢測限 對原料乳樣本（AFM1零值樣本）進行10次平行檢測，將F2／F1平均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差的值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到最低檢測限。

3．2 分析內(nèi)精密度 取AFM1標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入原料乳中，配制成3個濃度點，分別為0．30、0．45、0．60ng／mL，每組樣本平行測定10次，根據(jù)結(jié)果計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），測試檢測試紙條精密度。

3．3 回收率 取AFM1標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入原料乳中，配置成0．35ng／mL的樣本，平行檢測10次，取均值得到本底數(shù)據(jù)。向上述加標(biāo)回收本底樣本中繼續(xù)添加AFM1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到兩個理論添加濃度分別為0．094、0．472ng／mL的樣本，每個樣本平行測定3次，取均值扣除本底數(shù)據(jù)后計算加標(biāo)回收率。

3．4 對比實驗 因陽性樣本很難獲取，故用AFM1標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為0．00、0．05、0．10、0．15、0．20、0．30ng／mL的樣本，用熒光淬滅免疫層析AFM1檢測檢測試紙條與酶聯(lián)免疫法的黃曲霉毒素檢測試劑盒，分別進行檢測，每種濃度的樣本平行測定3次，取3次測定的平均值計算相關(guān)系數(shù)，評估兩種方法的相關(guān)性。

結(jié) 果

1 熒光淬滅免疫層析檢測試紙條的靈敏度、精密度與準(zhǔn)確性

對AFM1熒光淬滅免疫層析檢測試紙條的靈敏度、重復(fù)性與準(zhǔn)確性進行驗證，結(jié)果提示，AFM1熒光淬滅免疫層析檢測試紙條的最低檢測限、分析內(nèi)精密度和回收率均符合國標(biāo)要求。

表1 熒光淬滅免疫層析檢測試紙條的靈敏度、精密度與準(zhǔn)確性

表2 最低檢測限實驗結(jié)果

表3 精密度實驗結(jié)果

表4 加標(biāo)回收本底樣本檢測結(jié)果

表5 回收率實驗結(jié)果

2 AFM1熒光淬滅免疫層析檢測試紙條與酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑對比結(jié)果

結(jié)果提示，熒光淬滅免疫層析AFM1檢測試紙條與酶聯(lián)免疫吸附法原理的黃曲霉毒素檢測試劑具有良好的相關(guān)性（R2＝0．9659）。見圖3。

討 論

用于黃曲霉毒素檢測的技術(shù)有很多，這些技術(shù)按定量與否可分為定性分析和定量分析；按照檢測原理不同可分為分離類技術(shù)和免疫化學(xué)類技術(shù)。常用的分離類技術(shù)包括薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）、液相色譜 法（liquid chromatography，LC）、微柱篩選法等，可定性或定量檢測黃曲霉毒素。TLC自1990年被美國官方農(nóng)業(yè)化學(xué)家協(xié)會 （Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）列為標(biāo)準(zhǔn)方法[7]，該方法同時具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能。

免疫層析技術(shù)是一種新型的快速免疫分析技術(shù)，是以微孔膜作為固相載體，利用液體可以流過微孔膜也可以通過毛細作用在膜上向前移行的特性，以酶或者各種有色微粒子標(biāo)記抗體或抗原作為標(biāo)記物，通過抗原抗體反應(yīng)進行抗原抗體檢測的快速檢驗方法[8]。其中膠體金因其帶有肉眼可見的顏色變化、價廉、與生物分子易于結(jié)合、穩(wěn)定等特點，仍然是應(yīng)用最廣的標(biāo)記物。但在大多數(shù)的實驗中膠體金免疫層析法為通過肉眼觀察T線顏色改變的定性或半定量實驗[8-9]。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是免疫學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們已創(chuàng)建了不少快速、簡便、特異、敏感、低耗且適用的黃曲霉毒素檢測方法，尤其是以金標(biāo)試紙為代表的各種方法已經(jīng)被先進國家所廣泛使用，可在5～10分鐘完成對樣品中黃曲霉毒素的定性測定。

本實驗在原創(chuàng)性熒光淬滅免疫層析法[6]基礎(chǔ)上進行黃曲霉毒素檢測嘗試。熒光淬滅免疫分析技術(shù)中膠體金標(biāo)記的待測物抗體提供受體熒光分子，NC膜上的熒光素提供供體熒光分子，兩種分子在10nm范圍之內(nèi)可產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）現(xiàn)象，當(dāng)膠體金標(biāo)記的淬滅抗體結(jié)合在T線處時，使T線處NC膜的背景熒光發(fā)生淬滅。本技術(shù)的特點在于，將整張硝酸纖維素膜均勻地標(biāo)記熒光物質(zhì)，加入待測物發(fā)生層析反應(yīng)后，以樣本中已知和未知的內(nèi)在熒光物質(zhì)產(chǎn)生的背景熒光作為熒光基線，利用變化的比值進行計算，可較好去除背景干擾，且可不受儀器隨著時間延長讀取熒光信號衰減或不同儀器之間讀數(shù)差異的影響。同一樣本在不同儀器上盡管原始熒光信號讀數(shù)不同，但F2與F1的比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在前期實驗中，我們用AFP作為待測物進行了反應(yīng)體系的測試，結(jié)果與臨床已使用的化學(xué)發(fā)光免疫分析法差異無統(tǒng)計學(xué)意義，并且檢測結(jié)果不受黃疸的干擾[6]。

利用原創(chuàng)性熒光淬滅免疫層析法檢測AFM1的最低檢測下限為0．075ng／mL，分析內(nèi)變異系數(shù)≤7．3%，符合國標(biāo)GB451337-2010要求（分別為＜0．1ng／mL、＜10%）；回收率為65．8%～94．1%，符合國標(biāo)GB／T23212-2008（58．8%～97．5%）要求。熒光淬滅免疫層析AFM1檢測試紙條與酶聯(lián)免疫法檢測AFM1具有良好的相關(guān)性（R2＝0．9659）。該技術(shù)繼承了膠體金免疫層析法的特異、快速、便捷、廉價、穩(wěn)定的優(yōu)點，可同時實現(xiàn)定性與定量檢測，不僅具有較高靈敏性，還具有較強的抗背景干擾能力，對于牛奶質(zhì)量檢測具有一定的意義。

[1]Bhat R，Rai R V，Karim A A．Mycotoxins in food and feed：present status and future concerns．Com．Rev．Food Sci．Food Saf，2010，9（1）：57-81．

[2]Li P，Zhang Q，Zhang D，Guan D，et al．Aflatoxin measurement and analysis．Shanghai：InTech，2011：183-208．

[3]Turner P C．The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth．Scientifica（Cairo），2013：152879．

[4]Wu F，Stacy S L，Kensler T W．Global risk assessment of aflatoxins in maize and peanuts：are regulatory standards adequately protective？Toxicol Sci，2013，135（1）：251-259．

[5]Khademi F，Mohammadi M，Kiani A，et al．Efficient conjugation of aflatoxin M1 with bovine serum albumin through aflatoxin M1-（O-carboxymethyl） oximeandproductionofanti-aflatoxinM1 antibodies．Jundishapur J Microbiol．2015，8（4）：e16850．

[6]Chen X，Xu Y，Yu J，et al．Antigen detection based on background fluorescence quenching immunochromatographic assay．Anal Chim Acta，2014，841：44-50．

[7]Wacoo A P，Wendiro D，Vuzi P C，et al．Methods for detection of aflatoxins in agricultural food crops．J Appl Chem，2014：1-15．

[8]Cheng X，Pu X，Jun P，et al．Rapid and quantitative detection of C-reactive protein using quantum dots and immunochromatographic test strips．Int J Nanomedicine，2014，9：5619-5626．

[9]Singh J，Sharma S，Nara S．Evaluation of gold nanoparticle based lateral flow assays for diagnosis of enterobacteriaceae members in food and water．Food Chem，2015，170：470-483．

（檀葉青編輯）

Establishment and Evaluation of Real-time and Quantitative Detection of Aflatoxin M1 Using Background Fluorescence Quenching Immunochromatographic Assay

KONG Fan-hong，LIU Li，DONG Cheng-ya，HE Lu，WANG Dan，LIU Ying，WANG Ya-jie
（Beijing Tiantan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

ObjectiveTo established a rapid，quantitative method by using background fluorescence quenching immunochromatographic assay（bFQICA）to detect aflatoxin M1．MethodsThe sensitivity，repeatability and accuracy of bFQICA strips in detection of aflatoxin M1 were assessed．Meanwhile，the milk samples with aflatoxin M1 were also detected with enzyme-linked immunosorbent detection reagents，and the results were analyzed．ResultsThe LOD of the bFQICA assay was 0．04 ng／mL，and the coefficient of variation of the assay was equal or less than 7．3%．The recovery ratio of the assay was 65．8%to 94．1%．There was good correlation between background fluorescence quenching immunochromatographic assay and enzyme-linked immunosorbent aflatoxin M1 detection reagents（R2＝0．9659）．ConclusionThe background fluorescence quenching immunochromatographic assay could be used to detect aflatoxin M1 in milk with high sensitivity and good accuracy．

Background fluorescence quenching； Immunochromatography； Aflatoxin M1； Point of care test

10．11748／bjmy．issn．1006－1703．2016．03．026

2015-10-20；

2015-11-12

北京市科技新星計劃交叉學(xué)科合作課題（xxhz201409）；首都醫(yī)科大學(xué)校長基金（2015JYY80）；首都醫(yī)科大學(xué)“本科生科研創(chuàng)新”項目（xsky2014104）；北京市留學(xué)人員科技活動擇優(yōu)資助項目（2013）

王雅杰，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。主要研究領(lǐng)域：疾病相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)及實用性實驗室技術(shù)和指標(biāo)研發(fā)