樹莓果油抑制UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞光老化的作用研究

王學(xué)紅,尹星星,陸 杰,晁 沐,楊永晶

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院,西寧 810016;2.青海樹莓農(nóng)林產(chǎn)業(yè)化有限公司,青海 湟源 812199)

【研究意義】皮膚癌是常見的惡性腫瘤之一。近年來,由于受到環(huán)境污染和臭氧層破壞的影響,全球皮膚癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。研究表明,紫外線中的中波紫外線(Ultraviolet B,UVB)是誘發(fā)皮膚癌的重要因素之一[3]。UVB能量較強(qiáng),穿透能力較淺,主要影響皮膚表皮細(xì)胞,其引起皮膚老化的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面:①破壞皮膚細(xì)胞外基質(zhì)組成,產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶。在皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)中,I型膠原蛋白是含量最高的一種功能蛋白,對于維持皮膚彈性具有重要意義,且其含量可作為判斷皮膚老化程度的標(biāo)準(zhǔn)[4-5]。當(dāng)皮膚受到紫外線刺激時(shí),基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)被激活并影響細(xì)胞外基質(zhì)成分[6]。其中,基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3,MMP-3)會協(xié)同基質(zhì)金屬蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)降解膠原蛋白,最終導(dǎo)致皮膚中細(xì)胞外相關(guān)基質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)改變和功能喪失,使皮膚失去彈性、形成皺紋,過早老化[7]。②引起皮膚炎癥。UVB能誘導(dǎo)皮膚角質(zhì)層中白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的生成,引起皮膚炎癥。這些炎性細(xì)胞因子促使生成過多的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),加劇皮膚細(xì)胞的氧化應(yīng)激,而過多的ROS進(jìn)一步介導(dǎo)炎性因子分泌,加劇皮膚光老化[8]。此外,炎癥因子還能加快MMPs的活化,加快皮膚膠原蛋白的降解,從而加速皮膚老化[9]。③加劇皮膚細(xì)胞氧化應(yīng)激。長期暴露在UVB下,會導(dǎo)致皮膚細(xì)胞中自由基的過度產(chǎn)生和抗氧化物的缺乏,最終導(dǎo)致皮膚細(xì)胞的氧化損傷[10]。而維持體內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)有賴于由抗氧化酶和非酶類抗氧化物組成的抗氧化系統(tǒng)[11]。由此可見,防止皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)降解、緩解炎癥反應(yīng)和對抗氧化應(yīng)激是抑制UVB造成皮膚光老化的有效途徑。【前人研究進(jìn)展】傳統(tǒng)防曬劑包括化學(xué)吸收劑和物理防曬劑?；瘜W(xué)吸收劑對人體存在潛在危害,也對環(huán)境有著很大的負(fù)面影響。物理防曬劑亦存在口鼻吸入和光催化活性等安全隱患[12]。因此,尋找安全有效、綠色環(huán)保的天然防光老化物質(zhì)是防曬技術(shù)領(lǐng)域的重要關(guān)注點(diǎn)[13]?，F(xiàn)今,多種天然新型植物油脂被人們廣泛地開發(fā)和利用,這些植物油脂在滿足人體營養(yǎng)和健康所需的同時(shí)在心腦血管疾病的預(yù)防、血脂的降低、癌癥的抑制和抗氧化等方面也有明顯的作用[14]。此外,很多天然植物油脂具有確切的抗光老化活性,如沙棘籽油可有效防止角質(zhì)形成細(xì)胞中由紫外線引起的氧化還原平衡紊亂和脂質(zhì)代謝異常[15];紅花籽油在UVB誘導(dǎo)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(Human keratinocytes,HaCaT)細(xì)胞中能從蛋白和mRNA水平降低MMP-1的表達(dá)[16];紫蘇籽油因其較強(qiáng)的紫外吸收能力可添加在防曬護(hù)膚品中[17]等。【本研究切入點(diǎn)】樹莓(RubusideausL.)為薔薇科懸鉤子屬漿果,富含維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、多酚、甾體、黃酮、萜類等多種營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分[18]。前期研究發(fā)現(xiàn),樹莓果油的不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的95%以上[19],是一種極具開發(fā)前景的新型天然植物油脂。目前,關(guān)于樹莓果油的活性研究主要有抗氧化和抗疲勞[19-20],而關(guān)于其抗光老化活性的研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)提取樹莓果油,并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析其化學(xué)成分,進(jìn)一步明確其活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。在HaCaT細(xì)胞UVB光老化模型中,通過檢測UVB光損傷HaCaT細(xì)胞的存活率以及細(xì)胞中炎癥因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分和抗氧化因子的含量來評價(jià)樹莓果油的抗光老化活性,旨在為研發(fā)新的抗UVB天然活性物質(zhì)提供參考,為樹莓果油的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HaCaT細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,樹莓冷凍果由青海樹莓農(nóng)林產(chǎn)業(yè)化有限公司提供。

1.2 試劑

胰蛋白酶、PBS緩沖液、HaCaT專用培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液、DMSO、胎牛血清購于武漢普諾賽生命科技有限公司;增強(qiáng)型細(xì)胞活力檢測試劑盒(Cell counting kit-8,CCK-8)購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;MMP-3、COL1A1(Collagen type 1)、IL-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6(Interleukin-6,IL-6)、TNF-α、Trx(Thioredoxin,Trx)酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked-immuno-sorbent assay,ELISA)試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液購自于武漢博士徳生物工程有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒購自于南京建成生物研究所。

1.3 儀器與設(shè)備

DHG-9240A鼓風(fēng)干燥箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DFY-400A高速萬能粉碎機(jī)購自無錫沃信儀器有限公司;超臨界CO2流體萃取機(jī)購自南通市華安超臨界萃取有限公司;HF100三氣培養(yǎng)箱購自上海力申科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Ti2熒光倒置顯微鏡購自佰泰科技有限公司;Happy-TL21臺式高速冷凍離心機(jī)購自長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;TW23L電子天平購自島津企業(yè)管理(中國)有限公司;L125紫外輻射儀購自深圳市林上科技有限公司;1510酶標(biāo)儀、TSQ8000evo氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀購自賽默飛世爾儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樹莓果油的提取 去除樹莓冷凍果中的雜質(zhì)后于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干(溫度55 ℃)。超微粉碎機(jī)粉碎樹莓干果(轉(zhuǎn)速22 000 r/min,時(shí)間1～2 s)后用80目篩網(wǎng)(孔徑0.2 mm)分離籽和果粉。將樹莓果粉在超臨界CO2萃取設(shè)備上按預(yù)先設(shè)定的萃取條件進(jìn)行油脂萃取。萃取溫度50 ℃,CO2流速3.5 L/min,萃取壓力400 bar,萃取時(shí)間30 min。

1.4.2 樹莓果油GC-MS分析 色譜條件:TG-5SILMS石英毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);載氣:甲烷;流速1.0 mL/min;不分流,進(jìn)樣1 μL;進(jìn)樣溫度280 ℃;升溫程序:60 ℃,保持1 min,以10 ℃/min的速率升溫至180 ℃,以4 ℃/min的速率升溫至280 ℃,保持20 min,再以20 ℃/min的速率升溫至300 ℃,保持2 min。質(zhì)譜條件:EI離子源;離子源溫度:250 ℃;掃描質(zhì)量范圍m/z 40～550;圖譜檢索:NIST質(zhì)譜庫,采用Thermo Xcalibur3.1軟件分析數(shù)據(jù),峰面積歸一法確定各化學(xué)成分的相對含量。

1.4.3 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) 采用含15% FBS的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。定期更換培養(yǎng)液,待細(xì)胞融合度至80%以上,以1×104個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中。

1.4.4 樹莓果油對HaCaT細(xì)胞存活率的影響 待96孔板中的HaCaT細(xì)胞融合至60%左右時(shí),棄除96孔板中原有的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基,加入用無血清MEM培養(yǎng)基配制的樹莓果油(15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000 μg/mL,以0.5% DMSO為溶劑)和0.5% DMSO孵育,每個(gè)劑量設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。4 h后將樹莓果油和0.5% DMSO更換為無血清MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。測定細(xì)胞存活率時(shí)每孔加入10 μL CCK-8,在三氣培養(yǎng)箱中孵育1 h,于450 nm處測定吸光值。

1.4.5 HaCaT細(xì)胞UVB光老化模型的建立 待96孔板中的HaCaT細(xì)胞融合至60%左右時(shí),將原有的HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基更換為無血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。UVB照射前用適量PBS替換MEM培養(yǎng)基,UVB照射劑量為0、30、60、90、120和150 mJ/cm2,每個(gè)劑量設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。照射結(jié)束后將PBS更換為無血清MEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的三氣培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,細(xì)胞存活率測定操作同1.4.4。選擇細(xì)胞存活率為未經(jīng)UVB照射細(xì)胞50%左右的UVB照射劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.6 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響 實(shí)驗(yàn)分為空白組、模型組和樹莓果油處理組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉MHaCaT細(xì)胞既不進(jìn)行UVB輻射處理,也不加入樹莓果油;模型組細(xì)胞只進(jìn)行UVB照射,不加入樹莓果油;樹莓果油處理組用不同濃度的樹莓果油孵育4 h后再進(jìn)行UVB照射;UVB照射操作同1.4.5。UVB輻射結(jié)束后,空白組將HaCaT細(xì)胞專用培養(yǎng)基更換為無血清MEM培養(yǎng)基,模型組和樹莓果油處理組將PBS更換為無血清MEM培養(yǎng)基,細(xì)胞存活率測定同1.4.4。

1.4.7 HaCaT細(xì)胞外基質(zhì)成分和基質(zhì)金屬蛋白酶含量測定 收集空白組、模型組、樹莓果油處理組HaCaT細(xì)胞上清液,按照ELISA檢測試劑盒操作說明書測定COL1A1和MMP-3含量,于450 nm處測定吸光值。

1.4.8 HaCaT細(xì)胞中炎癥因子含量測定 按ELISA檢測試劑盒操作說明書分別測定空白組、模型組、樹莓果油處理各組HaCaT細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,于450 nm處測定吸光值。

1.4.9 HaCaT細(xì)胞中抗氧化因子含量測定 棄去空白組、模型組、樹莓果油處理組HaCaT細(xì)胞上清液,加入適量預(yù)冷的PBS潤洗后每孔加入100 μL RIPA細(xì)胞裂解液,冰上孵育30 min,離心收集HaCaT細(xì)胞裂解液。按照ELISA檢測試劑盒說明書操作,測定Trx的含量,于450 nm處測定吸光值;用試劑盒(微板法)測定SOD的含量,在405 nm處測定吸光值。采用BCA試劑盒測定各孔蛋白濃度,于562 nm處測定吸光值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS結(jié)果分析

通過質(zhì)譜庫檢索,從樹莓果油中共鑒定出53種化學(xué)成分,主要為烷烴類、酯類、脂肪酸類和維生素。其中脂肪酸主要有棕櫚酸(1.21%)、油酸(0.34%)和亞油酸(0.73%);脂肪酸酯有Z-9-油酸乙酯(0.34%);生育酚包括?-生育酚(0.88%)、?-生育酚(1.04%)和維生素E(0.19%);α-谷甾醇為0.86%(圖1)。

圖1 樹莓果油GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion-flow chromatogram of raspberry pulp oil

2.2 不同濃度樹莓果油和0.5% DMSO對HaCaT細(xì)胞存活率的影響

如圖2所示,與空白組相比,經(jīng)15.6～1000.0 μg/mL樹莓果油以及0.5% DMSO處理后的HaCaT細(xì)胞存活率無顯著差異。說明0.5% DMSO和15.6～1000 μg/mL濃度范圍的樹莓果油對HaCaT細(xì)胞存活率無明顯影響。因此,可繼續(xù)使用0.5% DMSO來溶解樹莓果油,并以濃度為15.6、31.3、62.5、125 和250 μg/mL的樹莓果油進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同濃度樹莓果油和0.5% DMSO對HaCaT細(xì)胞存活率的影響Fig.2 The effect of different concentrations of raspberry pulp oil and 0.5% DMSO on the cell viability of HaCaT cells

2.3 不同UVB輻射劑量對HaCaT細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響

未經(jīng)UVB照射(0 mJ/cm2)的HaCaT細(xì)胞性狀規(guī)則、形態(tài)飽滿、邊緣清晰(圖3-A)。經(jīng)不同劑量UVB照射后的HaCaT細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)較為明顯的改變,且隨著UVB照射劑量增大細(xì)胞形態(tài)改變程度加劇,很多細(xì)胞出現(xiàn)輪廓不清晰、皺縮變圓、間隙增大、甚至破裂并產(chǎn)生碎片。UVB對HaCaT細(xì)胞存活率有極大影響(圖3-B),與未經(jīng)UVB照射的空白組相比,各UVB照射組的細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01),且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。30 mJ/cm2UVB照射后細(xì)胞存活率約為空白組細(xì)胞的80%,120和150 mJ/cm2UVB照射組的細(xì)胞存活率不足40%,經(jīng)60和90 mJ/cm2的UVB處理后細(xì)胞存活率為正常細(xì)胞的50%左右。為保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行,兼顧實(shí)驗(yàn)效率,選擇60 mJ/cm2作為UVB照射劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響

由圖4可知,對HaCaT細(xì)胞進(jìn)行60 mJ/cm2UVB輻射后,細(xì)胞形態(tài)明顯改變,出現(xiàn)細(xì)胞形狀不規(guī)則和破裂溶解現(xiàn)象,細(xì)胞存活率較空白組極顯著降低(P<0.01),僅為正常細(xì)胞的50%左右;經(jīng)樹莓果油處理后,受損的細(xì)胞有明顯的恢復(fù)與改善,正常形態(tài)的細(xì)胞隨樹莓果油濃度的升高逐漸增多,且細(xì)胞存活率與模型組相比極顯著升高并呈出明顯的劑量依賴性。說明濃度為15.6～250 μg/mL的樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光老化具有顯著的抑制作用。

A.不同UVB照射劑量對HaCaT細(xì)胞形態(tài)的影響(×100);B.不同UVB照射劑量對HaCaT細(xì)胞存活率的影響;##同空白組相比P<0.01。A.The effect of different UVB irradiation doses on the morphology of HaCaT cells (×100);B.The effect of different UVB irradiation doses on the cell viability of HaCaT cells;##means extremely significant difference compared with the blank group (P<0.01).圖3 不同UVB照射劑量對HaCaT細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響Fig.3 The effect of different UVB irradiation doses on the morphology and cell viability of HaCaT cells

A.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞形態(tài)的影響(×100);B.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞存活率的影響;##同空白組相比P<0.01;**同模型組相比P<0.01。A.The effect of raspberry pulp oil on morphology of UVB-induced photoaging HaCaT cells (×100);B.The effect of raspberry pulp oil on cell viability of UVB-induced photoaging HaCaT cells;##means extremely significant difference compared with the blank group (P<0.01);**means extremely significant difference compared with the model group (P<0.01).圖4 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞形態(tài)和存活率的影響Fig.4 The effect of raspberry pulp oil on morphology and cell viability of UVB-induced photoaging HaCaT cells

2.5 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞外基質(zhì)成分和基質(zhì)金屬蛋白酶含量的影響

對HaCaT細(xì)胞中COL1A1含量的測定結(jié)果表明,經(jīng)UVB輻照損傷建模處理的HaCaT細(xì)胞與空白組相比,其含量極顯著降低(P<0.01),經(jīng)樹莓果油處理后,15.6、62.5、125 μg/mL的樹莓果油能極顯著升高光老化HaCaT細(xì)胞中COL1A1含量,31.3 μg/mL的樹莓果油能顯著升高COL1A1含量(P<0.05,圖5-A);由圖5-B顯示,與空白組相比,模型組HaCaT細(xì)胞中MMP-3含量極顯著升高(P<0.01),與模型組相比,樹莓果油濃度為15.6 μg/mL時(shí),光老化HaCaT細(xì)胞中MMP-3含量顯著降低(P<0.05)。根據(jù)以上結(jié)果推測,樹莓果油能夠升高光老化HaCaT細(xì)胞中COL1A1含量,降低MMP-3含量,進(jìn)而改善光老化皮膚的彈性。

2.6 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中炎癥因子含量的影響

由圖6-A可知,經(jīng)60 mJ/cm2的UVB輻射后,HaCaT細(xì)胞中IL-1β含量與空白組相比極顯著升高(P<0.01),而預(yù)先添加樹莓果油時(shí),HaCaT細(xì)胞中UVB照射引起的IL-1β含量升高受到抑制,與模型組比,樹莓果油濃度為62.5 和125 μg/mL時(shí),光老化HaCaT細(xì)胞中IL-1β含量極顯著降低(P<0.01);由圖6-B可知,經(jīng)UVB照射后HaCaT細(xì)胞中IL-6含量與空白組相比極顯著升高(P<0.01)。不同濃度樹莓果油處理后,相比模型組,樹莓果油濃度為125和250 μg/mL時(shí),光老化HaCaT細(xì)胞中IL-6含量極顯著降低(P<0.01),樹莓果油濃度為31.3和62.5 μg/mL時(shí),IL-6含量顯著降低(P<0.05);由圖6-C可知,與空白組相比,60 mJ/cm2的UVB輻射后HaCaT細(xì)胞中TNF-α含量極顯著升高(P<0.01),而經(jīng)15.6～250 μg/mL樹莓果油預(yù)先處理后,可以看出HaCaT細(xì)胞中TNF-α含量與模型組相比極顯著降低。結(jié)果表明,樹莓果油可降低IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,從而減少光老化HaCaT細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的程度。

A.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中COL1A1含量的影響;B.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中MMP-3含量的影響;##同空白組相比P<0.01;*同模型組相比P<0.05;**同模型組相比P<0.01。A.The effect of raspberry pulp oil on the content of COL1A1 in UVB-induced photoaging HaCaT cells;B.The effect of raspberry pulp oil on the content of MMP-3 in UVB-induced photoaging HaCaT cells;##means extremely significant difference compared with the blank group (P<0.01);*means significant difference compared with the model group(P<0.05);**means extremely significant difference compared with the model group (P<0.01).圖5 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞外基質(zhì)成分和基質(zhì)金屬蛋白酶含量的影響Fig.5 The effect of raspberry pulp oil on the content of extracellular matrix component and matrix metalloproteinase in UVB-induced photoaging HaCaT cells

2.7 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中抗氧化因子含量的影響

由圖7-A可知,模型組HaCaT細(xì)胞中Trx含量相比空白組極顯著降低(P<0.01),當(dāng)用不同濃度樹莓果油處理之后發(fā)現(xiàn),樹莓果油濃度為62.5和125 μg/mL時(shí),光老化HaCaT細(xì)胞中Trx含量與模型組相比極顯著升高(P<0.01),樹莓果油濃度為250 μg/mL時(shí)Trx含量顯著升高(P<0.05);由圖7-B可知,與空白組比較,經(jīng)60 mJ/cm2UVB輻射的HaCaT細(xì)胞中SOD含量極顯著降低(P<0.01),采用不同濃度樹莓果油處理后光老化HaCaT細(xì)胞中SOD含量相比模型組極顯著升高(P<0.01)且呈劑量依賴關(guān)系?？梢?樹莓果油能有效增加UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中抗氧化因子Trx、SOD含量來提高光老化HaCaT細(xì)胞的抗氧化水平。

A.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中IL-1β含量的影響;B.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中IL-6含量的影響;C.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中TNF-α含量的影響;##同空白組相比P <0.01;*同模型組相比P <0.05;**同模型組相比P <0.01。A.The effect of raspberry pulp oil on the content of IL-1β in UVB-induced photoaging HaCaT cells;B.The effect of raspberry pulp oil on the content of IL-6 in UVB-induced photoaging HaCaT cells;C.The effect of raspberry pulp oil on the content of TNF-α in UVB-induced photoaging HaCaT cells;##means significant difference compared with the blank group (P <0.01),*means significant difference compared with the model group(P<0.05);**means extremely significant difference compared with the model group (P<0.01).圖6 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中炎癥因子含量的影響Fig.6 The effect of raspberry pulp oil on the content of inflammatory factors in UVB-induced photoaging HaCaT cells

A.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中Trx含量的影響;B.樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中SOD含量的影響;##同空白組相比P<0.01;*同模型組相比P<0.05;**同模型組相比P<0.01。A.The effect of raspberry pulp oil on the content of Trx in UVB-induced photoaging HaCaT cells;B.The effect of raspberry pulp oil on the content of SOD in UVB-induced photoaging HaCaT cells;##means extremely significant difference compared with the blank group (P<0.01);*means significant difference compared with the model group(P<0.05);**means extremely significant difference compared with the model group (P<0.01).圖7 樹莓果油對UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中抗氧化因子含量的影響Fig.7 The effect of raspberry pulp oil on the content of antioxidant factors in UVB-induced photoaging HaCaT cells

3 討 論

植物油脂中的重要活性成分主要有脂肪酸、維生素和甾醇等[21],它們在對抗皮膚光老化中具有舉足輕重的作用。研究表明,不飽和脂肪酸在皮膚生理中扮演著重要的角色。油酸是一種單不飽和脂肪酸,具有滋養(yǎng)皮膚、吸收UVB的功能,是制作天然防曬劑的優(yōu)質(zhì)原料[22];另一種不飽和脂肪酸亞油酸,可通過降低炎癥反應(yīng)來預(yù)防和降低紫外線導(dǎo)致的皮膚紅斑損傷[23];Z-9-油酸乙酯是一種不飽和脂肪酸乙酯,它能升高HaCaT細(xì)胞存活率,并對UVB輻射具有顯著的抵抗作用,在天然抗紫外領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值[24]。維生素E是人體最主要的親脂非酶類抗氧化劑,它可以上調(diào)機(jī)體的抗氧化水平并抑制蛋白激酶C的活性,進(jìn)而減少膠原酶的表達(dá),抑制膠原降解,預(yù)防皮膚的光老化[25]。此外,谷甾醇對皮膚有很高的滲透性,其乳劑在一定濃度范圍內(nèi)能降低脂蛋白,增強(qiáng)脂肪酶活性,具有減少皮膚紅斑形成、緩解炎癥發(fā)生,防止皮膚衰老等功效,在化妝品中常作為皮膚營養(yǎng)劑使用[26]。GC-MS分析顯示,樹莓果油中油酸、亞油酸、Z-9-油酸乙酯、維生素E和α-谷甾醇的含量分別為0.83%、0.73%、0.34%、0.19%和0.86%,為其抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光老化提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

COL1A1是人體細(xì)胞外基質(zhì)中含量最豐富的蛋白質(zhì),占正常人皮膚中膠原的70%以上。它除了在皮膚組織結(jié)構(gòu)中起到支撐作用和維持皮膚彈性外,還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移以及特定基因的表達(dá)[27]。MMPs是細(xì)胞中的一種能降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶,正常細(xì)胞中含量極少。研究發(fā)現(xiàn),UVB可激活細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,引起細(xì)胞內(nèi)MMPs含量增多,減少膠原的產(chǎn)生并加速膠原的溶解,使膠原纖維變細(xì)、變直,數(shù)量減少,從而使角質(zhì)形成細(xì)胞聚集異常變性的膠原蛋白,導(dǎo)致皮膚無法維持正常的彈性發(fā)生光老化[28-30]。因此,減少M(fèi)MPs的生成可以增加膠原蛋白的合成,緊致皮膚,對抗UVB輻射。本研究中,樹莓果油能顯著降低光老化HaCaT細(xì)胞中MMP-3含量,提高COL1A1含量,表明樹莓果油能通過減少M(fèi)MP-3的生成緩解膠原蛋白的降解,對維持光老化皮膚的彈性具有一定作用。魯晶晶等[31]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌提取物可促進(jìn)UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT細(xì)胞中COL1A1的產(chǎn)生,抑制MMP-3的表達(dá)。Han等[32]研究發(fā)現(xiàn),粗齒繡球可下調(diào)經(jīng)UVB照射的HR-1無毛小鼠皮膚組織中MMP-3的表達(dá)并上調(diào)COL1A1的表達(dá)。這些研究結(jié)果[31-32]與本研究類似。

UVB輻射可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α等多種炎性因子[33-34]。TNF-α是最早產(chǎn)生的促炎介質(zhì),主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,它在炎癥反應(yīng)的發(fā)生過程中具有關(guān)鍵作用[35],TNF-α能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,促進(jìn)其他細(xì)胞炎性因子的合成和釋放[36]。IL-1β在角質(zhì)形成細(xì)胞中刺激表皮生長因子受體,導(dǎo)致MMPs表達(dá)水平增加,促進(jìn)膠原蛋白的降解,從而加快皮膚光老化[37]。IL-6則通過自分泌誘導(dǎo)MMPs的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解,進(jìn)而誘導(dǎo)皮膚光老化[38]。本研究發(fā)現(xiàn),樹莓果油能顯著降低UVB光損傷HaCaT細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,表明樹莓果油能有效減少光老化HaCaT細(xì)胞中炎性因子的分泌,減輕皮膚炎癥反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí),由于IL-1β和IL-6對MMPs表達(dá)水平的影響,因此樹莓果油降低表皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的結(jié)論與其減少M(fèi)MP-3的結(jié)論相互印證。Li等[39]以UVB誘導(dǎo)的昆明小鼠為光老化模型,發(fā)現(xiàn)陳皮油可減少光老化昆明小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。蘇牧楠等[40]證明納豆提取物可顯著抑制UVB照射后HaCaT細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。本研究結(jié)果與上述研究證實(shí)的天然植物成分在體內(nèi)與體外均可通過減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮其抗光老化作用一致。

Trx是非酶類抗氧化劑,以硫醇氧化還原作用調(diào)節(jié)酶和轉(zhuǎn)錄因子[41]。其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原水平并清除過多的活性氧減輕UVB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[42]。SOD作為皮膚中內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng),是自由基的天然清除劑,也是人體內(nèi)是唯一以自由基為底物進(jìn)行歧化反應(yīng)的酶,具有抑制氧化應(yīng)激、減緩炎癥的功能[34]。本研究為探究樹莓果油對光老化HaCaT細(xì)胞抗氧化方面的作用,對HaCaT細(xì)胞中Trx和SOD含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明,經(jīng)樹莓果油處理后,UVB光老化HaCaT細(xì)胞中Trx和SOD的含量均明顯升高,說明樹莓果油能夠顯著提高UVB誘導(dǎo)的光老化HaCaT的抗氧化能力,有效對抗UVB對HaCaT細(xì)胞造成的氧化損傷,維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。Agnieszka等[15]證實(shí)沙棘籽油可通過增加Trx和SOD水平進(jìn)而提高經(jīng)UVB輻射后的光老化HaCaT細(xì)胞的氧化穩(wěn)定性。陳海英[43]研究了扇貝多肽對UVB誘導(dǎo)的小鼠胸腺淋巴細(xì)胞中Trx表達(dá)水平的影響,發(fā)現(xiàn)扇貝多肽可明顯提高光老化小鼠胸腺淋巴細(xì)胞中Trx的表達(dá)。謝璟等[44]研究發(fā)現(xiàn)楊梅黃酮可顯著升高UVB誘導(dǎo)的光老化昆明小鼠皮膚組織中SOD的含量。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本相同。

4 結(jié) 論

本研究初步證實(shí)了樹莓果油對UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的光老化具有明顯的抑制作用,可能通過以下途徑實(shí)現(xiàn):①升高UVB光老化HaCaT細(xì)胞中COL1A1的含量,降低MMP-3的含量來減少細(xì)胞外基質(zhì)降解;②降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量減輕炎癥反應(yīng);③升高抗氧化因子Trx和SOD含量緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激。樹莓果油中所含有的油酸、亞油酸、Z-9-油酸乙酯、維生素E和谷甾醇為其抗UVB誘導(dǎo)的光老化提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究為樹莓果油在細(xì)胞光老化防治領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),對樹莓果油的進(jìn)一步開發(fā)和利用具有重要價(jià)值。然而,樹莓果油抑制UVB誘導(dǎo)光老化的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。