SKA3在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

林思彤,陳罡,羅文奇,陳肖瑜,潘如冰,張鳳友

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,廣西南寧 530021;2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科,廣西南寧 530021)

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一。在2020年全球癌癥統(tǒng)計中顯示,食管癌新發(fā)病例約為60萬,死亡病例約54萬[1],而中國是全球食管癌發(fā)病率較高的國家之一[2]。因此,深入探討食管癌的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。紡錘體與著絲粒相關(guān)蛋白3(spindle and kinetochore associated protein 3,SKA3/C13orf3)是SKA蛋白復(fù)合體的重要組成部分,是一種促進腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的新基因,其過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。SKA3生物功能主要是參與調(diào)節(jié)染色體的分離以及有絲分裂過程中著絲粒的定位[5]。在前期研究中,我們首次報道了甲狀腺乳頭狀癌中SKA3蛋白的表達(dá)及臨床意義[6]。然而目前在食管癌相關(guān)文獻(xiàn)中尚無SKA3基因的研究報道。本研究通過大數(shù)據(jù)隊列研究及免疫組織化學(xué)染色實驗,分析了SKA3基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)意義及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集本研究收集了廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2018年6月至2022年3月期間行食管癌根治術(shù)切除的手術(shù)標(biāo)本,其中包含75例食管鱗狀細(xì)胞癌和配對的20例正常食管組織。本研究經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批,所有患者均已簽署知情同意書(LW20222092)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色免疫組織化學(xué)染色采用通用SP試劑盒(鏈霉卵白素-生物素法檢測系統(tǒng))(北京中杉金橋公司,#SP-9000型);一抗：SKA3抗體(北京博奧森公司,#bs-7848R,1∶400稀釋)。免疫組化實驗步驟按照SP-9000試劑盒說明書執(zhí)行,采用枸櫞酸抗原修復(fù)液直接水浴修復(fù),采用DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司,ZLI-9017)顯色。免疫組化染色結(jié)果判讀：根據(jù)陽性染色的腫瘤細(xì)胞百分?jǐn)?shù)打分：“0%”代表0分,“<10%”代表0分,“11%～25%”代表1分,“26%～50%”代表2分,“51%～75%”代表3分,“76%～100%”代表4分。染色強度：“0”(陰性),“1”(細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色),“2”(細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色),“3”(細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色)。免疫組化染色最終得分根據(jù)腫瘤細(xì)胞陽性表達(dá)百分?jǐn)?shù)和染色強度的乘積計算得出。樣本得分大于4分為高表達(dá),小于等于4分為低表達(dá)。

1.3 樣本隊列數(shù)據(jù)來源公共隊列樣本數(shù)據(jù)來自腫瘤基因組圖譜(TCGA) (https：//portal.gdc.cancer.gov) 的食管鱗狀細(xì)胞癌隊列數(shù)據(jù),該隊列包含109例(腫瘤96例、正常對照13例)的mRNA測序數(shù)據(jù)和患者臨床參數(shù)數(shù)據(jù)?；蛐酒珿SE23400(腫瘤51例、正常樣本51例)、GSE45670(腫瘤28例、正常樣本10例)及GSE161533(腫瘤28例、正常樣本28例)的隊列數(shù)據(jù)來自(GEO)數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)(27008011)。

1.4 數(shù)據(jù)分析通過卡方檢驗分析SKA3蛋白在ESCC中表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Linkedomics(http：//www.linkedomics.org/login.php)軟件篩選與SKA3共表達(dá)的正或負(fù)相關(guān)基因。DAVID軟件對共表達(dá)基因進行基因本體論(Gene Ontology,GO) 富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)通路分析。GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn) (28407145)軟件分析SKA3 mRNA在多種常見惡性腫瘤中的表達(dá)以及在食管癌中表達(dá)與細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)控蛋白CCND1、CDK1及CDK4的相關(guān)關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法利用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,卡方檢驗分析免疫組化SKA3蛋白在食管癌中高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的統(tǒng)計學(xué)意義。t檢驗分析SKA3基因的表達(dá)在TCGA-ESCA隊列和GEO高通量芯片隊列中腫瘤組和正常對照組間的統(tǒng)計學(xué)意義。Spearman法篩選SKA3的共表達(dá)正負(fù)相關(guān)基因,篩選標(biāo)準(zhǔn)為：P<0.05,r>0.4或<-0.4。Spearman法分析SKA3與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 SKA3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)免疫組化染色顯示SKA3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色,如圖1所示。相較于正常食管組織,SKA3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中顯著高表達(dá)(χ2=18.424,P<0.001)。見表1。

A：SKA3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá),細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色(IHC);B：SKA3蛋白在正常食管上皮組織幾乎不表達(dá)(IHC)

表1 SKA3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌與癌旁正常組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 SKA3 蛋白與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系SKA3蛋白在食管低分化癌中表達(dá)增高(P<0.05)。比較不同特征 ESCC 患者 SKA3 高表達(dá)率,即神經(jīng)侵犯患者SKA3 高表達(dá)率高于無神經(jīng)侵犯患者(P<0.05)。在臨床分期Ⅲ～Ⅳ期組中SKA3 表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期組(P<0.05)。不同年齡、性別、腫物大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌栓浸潤及腫瘤位置的 ESCC 患者 SKA3 蛋白高表達(dá)率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 SKA3蛋白的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表2

2.3 SKA3 mRNA在食管癌中的表達(dá)從TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO中獲取4個隊列共 203例食管鱗狀細(xì)胞癌及102例正常對照組織的SKA3 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù),分別為TCGA-ESCC[癌(2.752±0.071),正常(0.991±0.238)]、GSE23400[癌(2.828±0.007),正常(2.775±0.008)]、GSE45670[癌(8.642±0.064),正常(7.628±0.326)]、GSE161533[癌(5.899±0.055),正常(5.561±0.042)]。結(jié)果顯示,與正常食管組織相比,SKA3 mRNA在食管鱗狀細(xì)胞癌均表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)。見圖2。

A：TCGA數(shù)據(jù)庫隊列;B：GEO數(shù)據(jù)庫GSE23400;C：GEO數(shù)據(jù)庫GSE45670;D：GEO數(shù)據(jù)庫GSE161533

2.4 食管癌中SKA3基因的共表達(dá)基因及其功能分析通過Linkedomics在線軟件篩選食管癌中與SKA3基因共表達(dá)的相關(guān)基因。獲得與SKA3共表達(dá)的基因772個,其中正相關(guān)基因567個(P<0.05,r>0.4) ,負(fù)相關(guān)基因205個(P<0.05,r<0.4)。GO富集分析顯示,以上正相關(guān)共表達(dá)基因參與：細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期、有絲分裂等生物學(xué)過程(biological process, BP);細(xì)胞成分(cellular component, CC)主要富集于細(xì)胞漿、細(xì)胞核形成、著絲粒組成等;分子機制(molecular function,MF)方面主要參與結(jié)合蛋白質(zhì)、poly(A) RNA 結(jié)合、ATP結(jié)合等。KEGG通路分析顯示這些基因主要富集在：DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、范科尼貧血(Fanconi anemia)通路、基因錯配修復(fù)、核酸剪接體等路徑。

2.5 食管癌中SKA3基因表達(dá)與細(xì)胞周期調(diào)控基因的關(guān)系如圖3示：在食管癌中SKA3基因的表達(dá)與細(xì)胞周期調(diào)控基因CCND1(r=0.17,P=0.015)、CDK1(r=0.71,P<0.001)及CDK4(r=0.52,P<0.001)均呈正相關(guān),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

A：SKA3與CCND1呈正關(guān)性;B：SKA3與CDK1呈正關(guān)性;C：SKA3與CDK4呈正關(guān)性

3 討 論

許多研究證實,SKA3在細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用,在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[7-10]。基于TCGA數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)SKA3在諸如乳腺癌、肺腺癌、胃腺癌、結(jié)腸腺癌及腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等中均為高表達(dá)。在本研究中,我們首次通過TCGA及GEO大樣本的生物信息數(shù)據(jù)庫,提取了4組獨立的ESCC的隊列數(shù)據(jù),分析SKA3 mRNA在食管鱗狀細(xì)胞癌及食管正常組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)SKA3 mRNA在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)。進一步對課題組收集的組織進行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果顯示SKA3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中亦顯著高表達(dá),免疫組化蛋白表達(dá)結(jié)果與我們采集的4個生物信息表達(dá)隊列的結(jié)果一致,支持SKA3在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)的結(jié)論。SKA3蛋白在晚期食管鱗狀細(xì)胞患者中的表達(dá)顯著高于早期患者,且分化越差,有神經(jīng)侵犯的患者中SKA3蛋白表達(dá)越高,這均說明SKA3可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的進展和復(fù)發(fā)有關(guān)。以上結(jié)果提示我們,SKA3基因在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生進展中具有重要作用。

共表達(dá)基因的GO功能富集分析顯示,多種生物學(xué)進程和通路與SKA3基因相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)SKA3基因參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期、有絲分裂等多種重要的生物學(xué)過程。研究表明,SKA3蛋白是紡錘體和著絲粒相關(guān)蛋白復(fù)合體的重要組成亞基,其主要功能是確保有絲分裂中精確的染色體分離和穩(wěn)定微管-動粒的活動,敲除SKA3可激活紡錘體裝配檢查點,姐妹染色單體失去黏附,導(dǎo)致中期有絲分裂停止[11-12]。SKA3通過NDC80復(fù)合物控制和調(diào)控有絲分裂,也調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。SKA3潛在作用介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞周期和進展[13]。HOU等研究者發(fā)現(xiàn),在肝細(xì)胞癌中SKA3可通過激活周期蛋白CDK2/P53磷酸化促進腫瘤細(xì)胞的增殖[14]。此外,SKA3還可以通過阻止PLK1蛋白的降解影響乳腺癌細(xì)胞的生長[10],并通過激活EGFR-PI3K-Akt通路促進肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。更有趣的是,研究還發(fā)現(xiàn)靶向SKA3可影響PLK1-Akt通路軸心調(diào)控糖代謝抑制喉癌的化療抵抗[16]。ZHAO等[17]研究表明,circ-SKA3作為癌基因通過誘騙miR-326增加髓母細(xì)胞瘤的表達(dá),從而促進髓母細(xì)胞瘤的發(fā)展。SKA3可能通過細(xì)胞周期、DNA損傷、激素雄激素受體、激素雌激素受體、PI3K/Akt、Ras/MAPK等因素影響腎乳頭狀細(xì)胞癌預(yù)后不良[18]。我們通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)SKA3主要參與DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、基因錯配修復(fù)等分子通路。相關(guān)分析表明SKA3與細(xì)胞周期調(diào)控因子CCND1、CDK1及CDK4存在正相關(guān)關(guān)系。SKA3與CDK1的磷酸化對于有絲分裂過程中SKA復(fù)合物的著絲點定位至關(guān)重要,基因相互作用通過調(diào)控細(xì)胞周期促進細(xì)胞增殖[14]。綜上結(jié)果表明SKA3作為SKA家族的重要成員,參與了細(xì)胞周期的調(diào)控,可能是通過影響細(xì)胞周期蛋白調(diào)控細(xì)胞周期進程,在腫瘤的形成和增殖中發(fā)揮重要作用。而SKA3在食管鱗狀細(xì)胞癌中的促癌機制研究仍需大量的體內(nèi)外實驗的佐證。

總之,本研究通過大數(shù)據(jù)庫的篩選和免疫組化實驗驗證,證實SKA3在食管鱗狀細(xì)胞癌中顯著高表達(dá),SKA3高表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),并可能通過調(diào)控細(xì)胞周期進程而促進腫瘤的進展,這為食管癌的發(fā)生發(fā)展分子機制研究提供了新思路。