三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇在橡膠樹植株中的遷移富集行為

盧泓瑋, 邱煜榮, 張善英, 任賽豪, 張 宇, 王 萌, 梁曉宇*,

(1.海南大學(xué) 植物保護學(xué)院，?？?570228；2.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海口 570228)

橡膠樹Hevea brasiliensis作為一種特種經(jīng)濟作物，其產(chǎn)出的天然橡膠是我國重要的戰(zhàn)略物資和工業(yè)原料[1]。近年來，橡膠樹白粉病大爆發(fā)時有發(fā)生，導(dǎo)致橡膠樹大面積落葉，膠乳產(chǎn)量大幅下降，嚴(yán)重阻礙了我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因橡膠樹體型高大、冠層茂密，在橡膠樹白粉病的化學(xué)防治過程中存在施藥困難、防治效率低等問題?，F(xiàn)階段通常采用高揚程噴粉機噴施粉劑和熱力噴霧機噴送熱霧劑兩種施藥方式進行防治[2]，這兩種方式對施藥時的氣象環(huán)境有著較高的要求，容易造成防治不及時、藥劑靶向沉積附著能力差等問題，在噴施時藥劑大量飄散在空中，對周圍環(huán)境及非靶標(biāo)生物帶來一定影響[3]。因此，明確農(nóng)藥在橡膠樹中的遷移富集及代謝行為，探索高效便捷、環(huán)境友好的施藥方式將成為橡膠樹白粉病化學(xué)防控的新趨勢。

三唑酮 (triadimefon) 是一種三唑類殺菌劑，因其殺菌譜廣，且具有良好的內(nèi)吸性，自上市以來廣泛用于防治水果、蔬菜、小麥等農(nóng)作物上的白粉病、銹病等真菌性病害[4-5]。三唑酮對橡膠樹白粉菌有良好的生物活性 ，在20 世紀(jì)80 年代開始使用熱霧機噴撒三唑酮，以防止橡膠樹白粉病爆發(fā)[6]。三唑酮在我國已登記使用多年，研究人員根據(jù)其在作物上的遷移富集行為并結(jié)合實際防治需求，開發(fā)出了如種子處理劑、水分散粒劑、煙霧劑、熱霧劑等多種劑型[7-8]，不僅豐富了防治手段，還大幅提升了防治效果。研究表明，三唑酮的羰基可在小麥、煙草、黃瓜等作物體內(nèi)被還原成羥基，繼而生成三唑醇 (triadimenol)[9-11]。由于三唑醇抑菌活性良好，其也被作為一種單獨的藥劑在多種作物上登記使用。三唑酮在橡膠樹上已應(yīng)用多年，但有關(guān)其在橡膠樹植株中的代謝行為尚未見研究報道。

農(nóng)藥在作物中的遷移富集行為是農(nóng)藥學(xué)領(lǐng)域的重點研究內(nèi)容之一，其研究方法主要包括殘留分析法、放射性示蹤法、生物測定法、熒光示蹤法和質(zhì)譜成像法等[12]。殘留分析法可以準(zhǔn)確檢測植株各組織中農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物的含量，已有大量研究者通過QuEChERS 提取方法與分析儀器結(jié)合的方式探索了農(nóng)藥在小麥、水稻和玉米等大宗作物中的遷移富集行為[13-15]，并根據(jù)這些研究開發(fā)出了相應(yīng)的施藥策略，顯著提高了農(nóng)藥的靶標(biāo)利用率[16-17]。當(dāng)前，開發(fā)針對橡膠樹的高效施藥方式還處于起步階段，農(nóng)藥在橡膠樹等高大喬木中的遷移富集行為尚不明確。因此，本研究選用橡膠白粉病防治中常用的三唑酮作為研究藥劑，探明植株通過根部及葉部吸收后藥劑的遷移富集及代謝行為，旨在為開發(fā)適宜的施藥方式提供技術(shù)指導(dǎo)，為高效防治橡膠樹病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、植物與試劑

Trace1300-TSQ 9000 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國Thermo Fisher Scientific 公司)、T25 digital ULTRA-TURRAX?均質(zhì)機 (德國IKA 公司)、BUCHI B-100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (瑞士BUCHI 公司) 和Milli-Q 超純水器 (美國Millipore 公司)。

供試植物為“熱研73397”組培苗和芽接苗購自海南天然橡膠新型種植材料創(chuàng)新基地。

97%三唑酮 (triadimefon) 標(biāo)準(zhǔn)品和97%三唑醇 (triadimenol) 標(biāo)準(zhǔn)品 (廣州佳途科技股份有限公司)；20%三唑酮乳油制劑 (triadimefon 20% EC，江蘇建農(nóng)農(nóng)藥化工有限公司)。乙腈和乙酸乙酯(色譜級，西隴科學(xué)股份有限公司)；無水硫酸鎂和氯化鈉 (分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；十八烷基硅烷鍵合硅膠 (C18) 和石墨化碳黑 (GCB)(上海安譜實驗科技股份有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理方法 橡膠樹植株根、莖和葉樣品處理方法：將植株樣品剪碎，準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.01 g) 至50 mL 離心管中，加入10 mL乙腈均質(zhì)1 min；加入1 g 氯化鈉渦旋1 min 后，于5000 r/min 下離心5 min；取2 mL 上清液至5 mL 離心管中，分別加入200 mg 無水硫酸鎂、50 mg C18和50 mg GCB (根樣品中不加GCB)，渦旋振蕩1 min，于5000 r/min 下離心2 min；取凈化后的上清液1 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用1 mL 乙酸乙酯定容，過0.22 μm 濾膜，待氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS) 檢測。

營養(yǎng)液樣品處理方法：取營養(yǎng)液樣品1 mL 置于10 mL 離心管中，加入4 mL 乙酸乙酯后渦旋2 min，加入1 g 氯化鈉后繼續(xù)渦旋1 min，于3000 r/min 下離心5 min。取1 mL 上清液過0.22 μm 濾膜，待GC-MS/MS 檢測。

1.2.2 檢測條件 色譜：TG-5ILMS 型毛細管色譜柱 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；載氣為氦氣；恒流模式；柱流量1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；進樣體積1 μL；不分流進樣；程序升溫：初始溫度為150 ℃，保持1 min，以40 ℃/min 升至230 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 升至250 ℃，保持 1 min，再以30 ℃升至280 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜：電子轟擊離子源 (EI) 電壓70 eV；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲時間3 min；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 模式掃描；碰撞氣為氬氣。表1 為MRM 模式下，三唑酮及三唑醇的GC-MS/MS 參數(shù)。

表1 三唑酮和三唑醇的GC-MS/MS 參數(shù)Table 1 GC-MS/MS parameters of triadimefon and triadimenol

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別準(zhǔn)確稱取0.01 g (精確至0.0001 g) 三唑酮和三唑醇的標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯溶解并定容于10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用時用乙酸乙酯稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。所有標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均于 -20 ℃保存，備用。用未處理的橡膠樹植株按1.2.1 節(jié)提取方法得到的空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 添加回收試驗 分別準(zhǔn)確稱取0.05 g 三唑酮和三唑醇標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并共同定容于10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為5000 mg/L 三唑酮和三唑醇混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用時進行相應(yīng)稀釋。取未經(jīng)藥劑處理的橡膠樹植株根、莖和葉各1 g，分別加入0.1、1、500 mg/L 的三唑酮和三唑醇標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL，使其添加水平分別為0.01、0.1 和50 mg/kg；取未含藥的空白營養(yǎng)液5 mL，分別加入0.5、5、2500 mg/L 的三唑酮和三唑醇標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL，使其添加水平與上述相同。按照

1.2.1 節(jié)的提取方法進行樣品前處理后采用GC-MS/MS 檢測，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

1.2.5 水培條件下植株根部施藥 將高約40～50 cm 的橡膠樹組培苗從沙床轉(zhuǎn)移至霍格蘭營養(yǎng)液(營養(yǎng)液A、B、C 液的體積比為1∶1∶1，使用時混合，稀釋100 倍后使用) 中培育，待幼苗出現(xiàn)生長點后，修剪葉片以增強植株均一性，繼續(xù)培育約21 d 后將幼苗置于含有1、5、10、15、20 mg/kg三唑酮的霍格蘭營養(yǎng)液中進行水培暴露試驗。以有藥無苗組作為對照。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。處理組和對照組均置于培養(yǎng)箱 (光周期L/D = 16 h/8 h，光照強度10 000 lx，溫度25～28 ℃) 中培養(yǎng)，期間每日稱重補充消耗的營養(yǎng)液。分別在暴露6、12、24、48、72、96、120、144、168、240 和360 h 時采集樣品，用純水反復(fù)沖洗根表面的殘留藥劑，經(jīng)濾紙吸干后，置于-20 ℃冰箱保存待測。

1.2.6 土培條件下植株葉部施藥 挑選長勢相對均一、有上、中、下層葉片的橡膠樹芽接苗，將配制的160 mg/L 三唑酮乳油用毛筆均勻地涂抹在芽接苗中層葉片正面。涂抹處理時用鋁箔紙遮擋未處理部分，每處理3 個重復(fù)。在涂藥后0 (涂藥后2 h)、1、3、5、7、10 和15 d 分別取標(biāo)記位、標(biāo)記上位及標(biāo)記下位的葉片，置于 -20 ℃冰箱保存待測。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇在橡膠樹植株體內(nèi)的遷移能力用轉(zhuǎn)運因子 (translocation factors,TFs) 表示，根到莖的轉(zhuǎn)運因子 (TF莖/根) 和莖到葉的轉(zhuǎn)運因子 (TF葉/莖) 分別按(1)和(2)式計算。

橡膠樹植株從營養(yǎng)液中吸收富集農(nóng)藥的能力用生物富集因子 (bioconcentration factors，BCFs)表示，根部生物富集因子 (root bioconcentration factors，RCF)、莖部生物富集因子 (stem bioconcentration factors，SCF) 和葉部生物富集因子 (leaf bioconcentration factors，LCF) 分別按(3)～(5)式計算。

(1)～(5)式中：C營養(yǎng)液為營養(yǎng)液中三唑酮和三唑醇質(zhì)量濃度總和，mg/L；C根、C莖、C葉分別為植株根、莖和葉中三唑酮和三唑醇含量總和，mg/kg。

采用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)處理，并用Origin 2022 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法確證

在0.001～5 mg/L 范圍內(nèi)，三唑酮和三唑醇在營養(yǎng)液的質(zhì)量濃度及其在植株根、莖、葉中的含量與其峰面積間呈良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)(R2) 均大于0.99 (表2)。

表2 三唑酮和三唑醇在營養(yǎng)液和橡膠樹植株根、莖、葉中的線性方程與決定系數(shù)Table 2 Linear equations and coefficients ofdetermination of triadimefon and triadimenol in nutrientsolution and root, stem and leaf of rubber tree plants

在0.01、0.1 和50 mg/kg 3 個添加水平下的添加回收試驗結(jié)果 (表3) 表明，三唑酮和三唑醇在營養(yǎng)液和橡膠樹植株根、莖、葉中的回收率介于86%～107%之間，RSD 介于2.8%～11%之間，表明建立的方法適用于檢測營養(yǎng)液和橡膠樹植株中的三唑酮和三唑醇含量。采用添加回收試驗中的最低添加水平作為定量限，三唑酮和三唑醇在營養(yǎng)液和橡膠樹植株根、莖、葉中的方法定量限均為0.01 mg/kg。

表3 三唑酮和三唑醇在營養(yǎng)液和橡膠樹植株根、莖、葉中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery and relative standard deviations of triadimefon and triadimenol in nutrient solution and root,stem and leaf of rubber tree plants (n = 5)

2.2 根部施藥條件下三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇的遷移富集行為

2.2.1 三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇在營養(yǎng)液和植株各部的含量變化 水培條件下植株對農(nóng)藥的暴露試驗是研究農(nóng)藥在植株中內(nèi)吸、傳導(dǎo)和富集行為的有效方法之一[13-15]。本研究測定了水培條件下根部施用三唑酮后營養(yǎng)液和橡膠樹植株中的藥劑含量。當(dāng)三唑酮水培添加質(zhì)量濃度為10 mg/L時，植株營養(yǎng)液中大量的三唑酮代謝成三唑醇，168 h 時二者質(zhì)量濃度達到一致，240 h 起營養(yǎng)液中三唑醇的含量大于三唑酮 (圖1a)。由圖1b 可以看出，施藥6 h 后植株根部三唑酮含量迅速上升至33.67 mg/kg，三唑醇含量為3.06 mg/kg，72 h后根部對外源添加的藥劑基本達到吸收平衡，168 h 時三唑酮與三唑醇含量相當(dāng)，之后三唑醇含量均大于三唑酮。由圖1c 看出，施藥72 h 后莖部三唑醇含量即超過三唑酮，并隨暴露時間的增加含量差不斷增大。藥劑從根部轉(zhuǎn)運至葉部需要一定時間，48 h之前未檢出2 種藥劑，在120 h 時葉片檢測出少量三唑酮，隨著暴露時間增長其含量無明顯增加；葉部三唑醇含量隨著暴露時間增加而顯著升高，360 h 時達到6.50 mg/kg (表4)。

圖1 藥劑在營養(yǎng)液 (a) 和橡膠樹植株根部 (b)、莖部 (c) 中的含量變化 (n = 3)Fig.1 Concentration of pesticides in nutrient solution (a) and the roots (b) and stems (c) of rubber tree plants (n = 3)

表4 三唑酮和三唑醇在橡膠樹植株葉片中的含量(mg/kg，n = 3)Table 4 Content of triadimefon and triadimenol in rubber tree leaves (mg/kg，n = 3)

另外，隨著三唑酮處理濃度的升高，植株根部三唑酮含量占比也相應(yīng)增加。當(dāng)處理質(zhì)量濃度為1 mg/L 時，三唑酮在根部的占比約為11.69%；當(dāng)處理質(zhì)量濃度為20 mg/L 時，占比約為39.85%(圖2a)。隨著暴露時間的增長，三唑醇在植株組織中的占比逐漸升高。這一現(xiàn)象在根部尤為明顯，7 d 時三唑醇在根部的平均占比為73.89%，15 d 時約為91.54%。三唑醇含量占比在植株各組織間表現(xiàn)為葉部 ＞ 莖部 ＞ 根部，且葉部含量占比始終高于90%，表明了三唑酮在橡膠樹植株中遷移和代謝同時進行，且三唑酮可快速代謝為三唑醇。

圖2 兩種農(nóng)藥的含量在橡膠樹植株根 (a)、莖 (b) 和葉(c)中的占比 (n = 3)Fig.2 Proportion of the two pesticides in the root (a), stem (b) and leaf (c) of rubber tree plants (n = 3)

2.2.2 三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇在橡膠樹植株中的轉(zhuǎn)運系數(shù)和富集系數(shù) 農(nóng)藥在植株不同部位的遷移富集能力可由TFs 和BCFs 來表征[14]。不同添加濃度下植株對藥劑的遷移富集行為相似，均表現(xiàn)為根部含量大于莖部和葉部含量，且莖部和葉部轉(zhuǎn)運系數(shù)均小于1 (輔助材料附表1、2)。當(dāng)添加質(zhì)量濃度為10 mg/L 時，隨暴露時間的增加，三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇在橡膠樹植株中的TF 和RCF 值不斷增大 (表5)。TF葉/莖＞ TF莖/根，說明三唑酮和三唑醇從莖部轉(zhuǎn)運到葉部易于從根部轉(zhuǎn)運至莖部，且莖部和葉部轉(zhuǎn)運系數(shù)均小于1，表明2 種藥劑不易于從橡膠樹植株根部轉(zhuǎn)運到葉部。在施藥6 h 時兩種藥劑的根部富集系數(shù)即大于1，120 h 時莖部富集系數(shù)大于1，240 h 時葉部富集系數(shù)才大于1，且相同時間下RCF ＞ SCF ＞ LCF，表明根部最易于富集2 種藥劑，莖部其次，葉部富集能力最弱。

2.3 葉部施藥條件下三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇的遷移富集行為

在橡膠樹病害防治應(yīng)用中，三唑酮多以噴霧或熱霧施藥方式進行葉部施藥。本研究測定了土培條件下葉部施用三唑酮后橡膠樹植株葉片中的藥劑含量 (圖3)。隨施藥時間增加，三唑酮含量逐漸降低，三唑醇則呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。施藥2 h 時葉片三唑酮起始含量為10.10 mg/kg，有少量三唑醇生成；1 d 時三唑酮含量迅速降至4.54 mg/kg，三唑醇則迅速升至3.93 mg/kg；3 d時三唑醇含量超過三唑酮，達最大值6.08 mg/kg。另外，本研究同時檢測了施藥葉片上方和下方枝條葉片中藥劑含量，發(fā)現(xiàn)僅有少量藥劑遷移到這兩部分葉片中，三唑酮和三唑醇的檢出量均低于0.08 mg/kg，說明在對橡膠樹植株葉部施藥時，三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇在植株不同部位的葉片間遷移能力較差。

3 結(jié)論與討論

目前尚未有橡膠樹植株中的農(nóng)藥殘留分析方法報道，本研究基于QuEChERS 法，采用GCMS/MS 首次建立了三唑酮和三唑醇在橡膠植株根、莖、葉中的殘留分析方法，方法定量限均為0.01 mg/kg，與傳統(tǒng)的固相萃取法相比，簡化了樣品前處理步驟，提高了分析效率，可為今后研究其他農(nóng)藥在橡膠樹植株中的遷移富集行為提供技術(shù)參考。

三唑酮代謝為三唑醇這一現(xiàn)象在作物和土壤中均有報道[18-19]。Li 等發(fā)現(xiàn)了三唑酮在黃瓜、番茄中降解的同時大量代謝生成三唑醇[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在橡膠樹植株營養(yǎng)液中三唑酮大量代謝為三唑醇，這可能與橡膠樹植株根系微生物或根系分泌物發(fā)揮作用有關(guān)[20]。橡膠樹植株根和莖中的三唑酮含量隨著三唑酮處理濃度增大而顯著增加，但這一趨勢在葉部并不明顯，藥劑始終以三唑醇為主，說明橡膠樹植株在吸收三唑酮的同時可快速將其代謝成三唑醇。因此在探究植株對三唑酮的吸收轉(zhuǎn)運規(guī)律時有必要結(jié)合其主要代謝產(chǎn)物三唑醇進行研究。

農(nóng)藥在植物中的遷移富集能力與藥劑的理化性質(zhì)密切有關(guān)[21]，有研究表明辛醇/水分配系數(shù)在0.57～3.7 的農(nóng)藥能夠被玉米植株根系吸收并向上轉(zhuǎn)運[22]。橡膠樹植株對外源藥劑的富集隨著暴露時間的增加而整體升高，在藥劑吸收過程中TF莖/根和TF葉/莖始終小于1，且RCF 遠大于SCF 和LCF，說明三唑酮和三唑醇很難在橡膠樹植株中向上遷移，易被根部富集。這與水稻對三唑酮的吸收轉(zhuǎn)運規(guī)律一致，三唑酮易在水稻根部富集，不易轉(zhuǎn)運至水稻莖葉中[23]。而Yu 等在研究小麥對三唑酮的吸收轉(zhuǎn)運則發(fā)現(xiàn)其易向上轉(zhuǎn)運，吸收穩(wěn)定后莖葉轉(zhuǎn)運系數(shù)均大于1[15]，說明藥劑在不同植株中的遷移富集能力不同，這可能與不同作物的自身特性相關(guān)。因此，針對在不同作物上的農(nóng)藥遷移富集及代謝行為的研究尤為重要。

在葉部施藥的條件下，三唑酮在不同植株中的遷移行為有較大差異，如將三唑酮噴施用辣椒植株莖葉部時，僅有少量藥劑遷移到植株其他未施藥部位[24]；Buchenauer 等通過放射性技術(shù)發(fā)現(xiàn)三唑酮施用于大麥中部葉片4 d 后，其頂層葉片的放射性強度為69.1%，施藥葉片則降至30.1%[25]。本研究通過橡膠樹植株葉部施藥條件下三唑酮及其代謝產(chǎn)物三唑醇的遷移富集行為，發(fā)現(xiàn)2 種藥劑在橡膠樹不同枝條葉片之間的遷移能力較差。另外，橡膠樹植株葉片可將三唑酮快速代謝成三唑醇，而三唑醇對白粉病也具有良好的防治效果，因此推測施用三唑酮防治橡膠樹白粉病時，真正發(fā)揮作用的藥劑很可能是其代謝產(chǎn)物三唑醇。

綜上所述，在常規(guī)背負(fù)式噴霧裝置施藥模式下防治橡膠樹白粉病時，三唑酮向上傳遞困難，葉片之間難遷移，有效利用率低，同時易造成藥劑浪費、環(huán)境污染等問題。本研究發(fā)現(xiàn)莖部易富集三唑酮和三唑醇，且莖、葉部中藥劑含量均隨著處理濃度的升高而增大，因此可嘗試采用自流式注射或高壓注射的方式進行橡膠樹莖部處理，探究三唑酮的遷移行為及防治白粉病效果。另外，納米技術(shù)通過在藥劑與劑型本身水平上進行加工修飾，對于提升藥劑的內(nèi)吸傳導(dǎo)能力具有較大潛力[26]，未來可通過開發(fā)合適三唑酮的納米劑型以增強藥劑遞送至橡膠樹葉部靶點的能力。最后，在防治過程中三唑酮在橡膠樹植株葉片中消解迅速，繼而導(dǎo)致農(nóng)藥使用量大幅增加，未來可開發(fā)合適三唑酮的緩釋劑型，來延長持效期?？偟膩碚f，研究藥劑在橡膠樹上的遷移富集行為，可助力施藥策略的開發(fā)應(yīng)用，為今后橡膠樹病蟲害的高效防治提供方法指導(dǎo)，有助于我國天然橡膠產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。