植物病原菌氧化固醇結(jié)合蛋白的功能及其靶向抑制劑研究進(jìn)展

劉 靜, 郝 楠, 張芷萌, 劉曉飛, 劉穎超, 趙 斌, 董金皋

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

綠色新農(nóng)藥的開發(fā)和利用有利于農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收和可持續(xù)發(fā)展，而基于靶標(biāo)蛋白的合理分子設(shè)計(jì)是新農(nóng)藥創(chuàng)制中最為活躍的研究領(lǐng)域[1-2]。目前的新農(nóng)藥小分子設(shè)計(jì)還依賴于已知的農(nóng)藥靶標(biāo)蛋白，但大量、多次、重復(fù)使用單一靶標(biāo)農(nóng)藥，無疑會增大有害生物的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，即使輪換使用靶標(biāo)相同或近似的農(nóng)藥也會增加有害生物的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)。因此，基于新的作用靶標(biāo)開發(fā)與環(huán)境相容的綠色新農(nóng)藥，不僅可以從根本上解決有害生物的抗性問題，而且更具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[3]。

氧化固醇結(jié)合蛋白 (oxysterol-binding protein,OSBP) 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型卵菌抑制劑作用靶標(biāo)，并且在不同物種中擁有自己特異的底物，這就為農(nóng)藥的選擇性提供了最佳設(shè)計(jì)方案。杜邦公司開發(fā)的超高效卵菌抑制劑氟噻唑吡乙酮目前已成為氧化固醇結(jié)合蛋白抑制劑的成功典范[4]，但是氟噻唑吡乙酮的超高活性僅限于針對卵菌，對植物病原真菌的活性較差，因此，如何有效利用氧化固醇結(jié)合蛋白新靶標(biāo)來開發(fā)超高效廣譜抗菌化合物，將是未來農(nóng)藥設(shè)計(jì)的熱點(diǎn)。本文將詳細(xì)闡述氧化固醇結(jié)合蛋白家族在植物病原菌中的功能，并探討其晶體結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)合特征，為靶向殺菌劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 氧化固醇結(jié)合相關(guān)蛋白在植物病原菌中廣泛存在

氧化固醇結(jié)合相關(guān)蛋白 (oxysterol binding protein-related proteins, ORPs；在卵菌中被稱為OSBP) 包含一個保守的脂質(zhì)結(jié)合蛋白家族，從屬于脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (lipid transfer proteins, LTPs) 超家族[5-8]，在酵母、植物和哺乳動物中高度同源。ORPs/OSBP 的核心功能是在細(xì)胞膜之間對脂質(zhì)分子進(jìn)行非囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，但對膜間的磷脂酰肌醇四磷酸 (phosphatidylinositol 4-phosphate, PI(4)P) 濃度梯度具有嚴(yán)重依賴性；除此之外，它在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝等過程中也發(fā)揮重要作用[9]。近年來，隨著研究人員對氧化固醇結(jié)合蛋白研究的不斷深入，該蛋白家族各成員間的生物學(xué)功能也將日益清晰，特別是在人類和酵母中的相關(guān)研究 (例如ORP5/8、Osh3/4 等)。

1.1 氧化固醇結(jié)合相關(guān)蛋白家族在植物病原菌中的同源性

氧化固醇結(jié)合相關(guān)蛋白在植物病原菌中分布廣泛。目前關(guān)于氧化固醇結(jié)合蛋白的研究主要集中在構(gòu)巢曲霉、黃曲霉和卵菌中，植物病原菌中常見的成員及其大小見表1。在卵菌中僅僅存在1～2 個成員，但在真菌中存在7 個及以上并形成了5 個亞家族，且與卵菌氧化固醇結(jié)合蛋白家族親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表1 常見植物病原菌中的氧化固醇結(jié)合蛋白Table 1 Oxysterol-binding proteins in some common plant pathogens

1.2 氧化固醇結(jié)合蛋白家族的結(jié)構(gòu)

氧化固醇結(jié)合蛋白家族存在兩種分類系統(tǒng)。一種是根據(jù)氧化固醇結(jié)合蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)域 (OSBPrelated domain，ORD 結(jié)構(gòu)域) 和PH 結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homolgy domain, PH domain) 序列差異進(jìn)行分類，例如人類中的12 個ORP 成員可分成6 個亞家族：亞家族Ⅰ (OSBP 和ORP4)、亞家族Ⅱ (ORP1 和ORP2)、亞家族Ⅲ (ORP3、ORP6、ORP7)、亞家族Ⅳ (ORP5 和ORP8)、家族Ⅴ(ORP9) 和亞家族Ⅵ (ORP10 和ORP11)。在每個亞家族間ORD 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似性高達(dá)70%以上，而在不同的亞家族間ORD 序列的相似性較低。在釀酒酵母中含有7 個Osh 蛋白，它們被分為3 個亞家族：Osh1p(Swh1p) 和Osh2p、Osh4p(Kes1p) 和Osh5p(Hes1p) 以及Osh6p 和Osh7p (圖1)[15]。另外一種是目前較為通用的分類方式，它根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的差異將氧化固醇結(jié)合蛋白家族分為2 個亞家族：一類只含有ORD 結(jié)構(gòu)域，被稱作短鏈O R P s；另一類除了含有ORD 外，還含有N 末端結(jié)構(gòu)域，這種被稱作長鏈ORPs。Osh1-Osh3 3 個Osh 蛋白為長鏈ORPs，它們除了含有ORD 結(jié)構(gòu)域外，都還包含1 個PH 結(jié)構(gòu)域，其中Osh1 和Osh2 還分別含有2 個ANK 重復(fù)結(jié)構(gòu)域，Osh3 含有一個GOLD 結(jié)構(gòu)域。Osh4-Osh7 這4 個成員只含有ORD 結(jié)構(gòu)域，可歸為短鏈ORPs。在大多數(shù)真核生物中，N 末端結(jié)構(gòu)域包含多個不同部分，分別行使不同功能，比如ORD 結(jié)構(gòu)域、PH 結(jié)構(gòu)域、FFAT 基序、錨蛋白重復(fù)序列和GOLD 結(jié)構(gòu)域等。

圖1 人和釀酒酵母中的ORPs 家族結(jié)構(gòu)分析[15]Fig.1 The human and yeast ORPs families[15]

ORPs 蛋白都含有一個調(diào)節(jié)脂質(zhì)結(jié)合的C 端ORD 結(jié)構(gòu)域，而在ORD 結(jié)構(gòu)域N 端還存在一個類似桶狀結(jié)構(gòu)的標(biāo)志性保守序列“EQVSHHPP”，它在所有ORPs 蛋白家族中都存在[16-17]。例如，Osh3 的ORD 結(jié)構(gòu)域的N 端形成了一個β-桶狀結(jié)構(gòu)，固醇分子通過這個桶狀結(jié)構(gòu)被運(yùn)輸?shù)狡渌?xì)胞組分[18]。大多數(shù)真核生物氧化固醇結(jié)合蛋白家族的N 端都包含一些重要的功能結(jié)構(gòu)域[19]，比如PH 結(jié)構(gòu)域、FFAT 基序 (FFAT motif)、錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域 (ankyrin repeats domain，ANK) 以及黃金結(jié)構(gòu)域 (GOLD domain) 等，這些結(jié)構(gòu)域在甾醇運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)代謝等方面執(zhí)行不同的功能。

ORPs 家族蛋白主要位于胞漿中，它通過特定的靶向結(jié)構(gòu)域 (如PH 結(jié)構(gòu)域) 與膜室相關(guān)聯(lián)[18]。PH 結(jié)構(gòu)域由100～120 個氨基酸組成，它們都具有由7 股兩個反平行β折疊和C 端兩性螺旋組成的共同結(jié)構(gòu)[20]。由于PH 結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵殘基和連接β折疊的長度變化，不同PH 域之間的序列保守性較低，僅具有7%～30%的一致性[21-22]，但在大多數(shù)已知的ORP 家族蛋白晶體結(jié)構(gòu)中，PH 結(jié)構(gòu)域卻顯示出高度的結(jié)構(gòu)相似性[23]。不同物種的磷脂酰肌醇磷酸 (phosphatidylino-sitol phosphates,PIPs) 富集在不同的細(xì)胞膜上，PH 結(jié)構(gòu)域與高爾基體或細(xì)胞膜相互作用將PIPs 進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。除此之外，PH 結(jié)構(gòu)域與特定PIPs 結(jié)合還可以促進(jìn)這些脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白與細(xì)胞器內(nèi)膜的相互作用，這種雙向的生物學(xué)功能在ORPs[24-28]、CERT[29]和FAPP2(Four-phosphate adaptor protein 2) 中較為常見。OSBP 和ORP9L 的PH 結(jié)構(gòu)域通過與PI(4)P 相互作用將蛋白質(zhì)招募于高爾基體[30]。同樣，Osh1 的PH 結(jié)構(gòu)域也與PI(4)P 相互作用，并靶向高爾基體[24]。ORP1L 的PH 結(jié)構(gòu)域靶向細(xì)胞核，而ORP3 的PH 結(jié)構(gòu)域[31-32]、ORP6 和ORP7 的PH結(jié)構(gòu)域定位于質(zhì)膜 (plasma membrane, PM)[33]。ORP的膜靶向性也與其它結(jié)構(gòu)域相關(guān)，如FFAT 基序和ANK 重復(fù)序列。ANK 區(qū)域和ORP1L的PH 結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，將蛋白質(zhì)定位于核體附近[34]。通過PH 結(jié)構(gòu)域?qū)I(4)P 和Arf-GTP 的檢測，對反式高爾基網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（trans-Golgi network，TGN）上的OSBP 進(jìn)行了精確定位[35-36]。經(jīng)蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，人類和酵母中的所有長鏈ORPs 都包含PH 結(jié)構(gòu)域、FFAT 基序、錨蛋白重復(fù)序列、跨膜區(qū)和GOLD結(jié)構(gòu)域等多個靶向結(jié)構(gòu)域。

FFAT 基序具有保守的“EFFDAXE”序列，可作為靶向信號將蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum，ER) 表面和核膜上[37-38]。許多含有F F A T 基序的長鏈O R P s (包括人的O S B P、ORP1、ORP2、ORP3、ORP4、ORP5、ORP6、ORP7 和ORP9) 被招募到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表面[32-33]。FFAT 基序與囊泡膜蛋白 (vesicle associated membrane protein，VAMP) 相關(guān)蛋白 (VAMP associated proteins，VAPs) 結(jié)合后，VAPs 通過C 末端跨膜結(jié)構(gòu)固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。Scs2 是酵母VAP 同系物，它可與包括Osh1、Osh2 和Osh3 在內(nèi)的多個含有FFAT 基序的ORPs 結(jié)合[39]。Scs2缺失后，酵母將錯誤的FFAT 定位到細(xì)胞質(zhì)[32-33]。缺少FFAT 基序的長鏈ORP8 在其C 末端形成一個跨膜螺旋，這一跨膜區(qū)域會將ORPs錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，從而取代FFAT 基序的作用[40]。

ANK 是由33 個氨基酸組成的串聯(lián)重復(fù)模塊，折疊成兩個由β-折疊分隔的反平行α-螺旋結(jié)構(gòu)[41]。例如ORP1L、Osh1 和Osh2 等一些OPRs 蛋白均含有該結(jié)構(gòu)域，它在蛋白質(zhì)間的相互作用中執(zhí)行重要功能[42-43]。酵母Osh1 中的錨蛋白結(jié)構(gòu)域與Nvj1 (nucleus-vacuole junction，Nvj) 相互作用，Nvj1 是核膜外的一種完整膜蛋白，是Osh1定位到核-液泡連接處所必需的。這對于Osh1 在細(xì)胞核膜與液泡之間通過ORD 結(jié)構(gòu)域運(yùn)輸固醇(例如膽固醇、麥角甾醇及其它氧化固醇) 和PIPs具有重要作用。ORP1L 中的錨蛋白重復(fù)序列與PH結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，通過與內(nèi)質(zhì)體GTPase-Rab7 相互作用，有助于該蛋白定位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和膜接觸位點(diǎn)中，并執(zhí)行調(diào)控脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ躘44-45]。

GOLD 結(jié)構(gòu)域是在真核高爾基體和脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)鞍字邪l(fā)現(xiàn)的，它通常介于90～150 個氨基酸之間。在酵母長鏈ORPs (Osh3) 的N 端，存在一個與其它蛋白質(zhì)結(jié)合的GOLD 結(jié)構(gòu)域[46]。通過生物信息學(xué)分析可知GOLD 結(jié)構(gòu)域可形成一個緊湊的β-折疊[47]，但目前還沒有發(fā)現(xiàn)與Osh3 同源的GOLD 結(jié)構(gòu)域及其生物學(xué)功能。

1.3 氧化固醇結(jié)合蛋白家族的晶體結(jié)構(gòu)

氧化固醇結(jié)合蛋白中解析的第1 個晶體結(jié)構(gòu)是酵母Osh4 (也稱為Kes1)，也是目前研究最為深入和廣泛的。Osh4 含有434 個氨基酸，包含核心ORD 結(jié)構(gòu)域，可與膽固醇、麥角甾醇和其他含氧甾醇等配體結(jié)合。Osh4 在由頂部封閉的內(nèi)腔中結(jié)合單個甾醇，甾醇的3β-羥基朝向疏水通道的底部，與口袋底部的極性殘基直接接觸，但氧化固醇中的羥基并不直接與蛋白質(zhì)間相互作用，表明Osh4 可以容納結(jié)構(gòu)類似的多種甾醇，甾醇的疏水側(cè)鏈與頂部結(jié)構(gòu)相連，形成閉合構(gòu)象 (圖2A)；頂部的開關(guān)通過“打開和關(guān)閉”的方式來吸收或釋放配體，當(dāng)Osh4 空載時，N 末端蓋子容易發(fā)生蛋白質(zhì)水解，這時頂部開關(guān)是打開的，便于配體攝取(圖2B)[48]；但Osh3 的ORD 疏水空腔很小，不會與甾醇結(jié)合 (圖2C)[16,48]；通過Osh 同系物與PI(4)P的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)可以看到，PI(4)P 結(jié)合Osh3、Osh4 和Osh6 的結(jié)構(gòu)是相同的，均是競爭性結(jié)合與甾醇相同的內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn) (圖2D)；Osh4 通過酰基鏈來調(diào)節(jié)PI(4)P 與其空腔的結(jié)合 (圖2E)，使PI(4)P 的?；溑c疏水通道發(fā)生松散的非特異性相互作用 (圖2F)[48]。Kes1/Osh4 結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)未知，后續(xù)通過對其深入研究將有助于確定Kes1/Osh4 調(diào)節(jié)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制。

圖2 ORD 與配體結(jié)合模式[55]Fig.2 The binding model of ligand with ORDs[55]

目前已經(jīng)研究報(bào)道的OSBP/ORPs 的脂質(zhì)配體主要是PI(4)P 和磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserine，PS)，其中PI(4)P 是所有ORPs 的共同配體[49-51]，ORP10 的配體PI(4)P 和PS 在體外脂質(zhì)體之間以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其它細(xì)胞器之間表現(xiàn)出脂質(zhì)交換活性[52]；缺乏ORD 結(jié)構(gòu)域的ORP6 突變體可導(dǎo)致PS 標(biāo)記的偏移，影響PI4P 和PS 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜接觸位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)[53]。酵母和人類ORPs 中保守的基本功能是由ORD 結(jié)構(gòu)域的PI(4)P 結(jié)合介導(dǎo)的，說明非囊泡性PI(4)P 轉(zhuǎn)運(yùn)是真核生物中ORPs 的基本功能[54]。

2 氧化固醇結(jié)合蛋白在植物病原菌中執(zhí)行重要生物學(xué)功能

2.1 甾醇分子由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的動態(tài)機(jī)制

盡管特定的脂質(zhì)合成反應(yīng)發(fā)生在許多不同的細(xì)胞器中，但細(xì)胞脂質(zhì)合成的主要部位是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。蛋白質(zhì)在細(xì)胞器中的分布由特定的蛋白質(zhì)基序介導(dǎo)，并通過化學(xué)修飾或構(gòu)象變化進(jìn)行調(diào)節(jié)。每個細(xì)胞器都有其特有的脂質(zhì)成分，從而確保膜相關(guān)生化反應(yīng)的進(jìn)行，如離子運(yùn)輸、各種底物的代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[56]。

ORPs 在細(xì)胞內(nèi)參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的證據(jù)最初是從酵母Osh 蛋白的研究中獲得的。在釀酒酵母中，單獨(dú)敲除7 個Osh 基因后其表型未發(fā)生顯著變化，而當(dāng)其全部敲除后則不能正常生長，這表明Osh 蛋白在維持生存能力的核心功能中是相互協(xié)同的[57]。Drin 團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，Osh4 以相互排斥的方式結(jié)合麥角甾醇和PI(4)P，并在不同膜之間對甾醇和PI(4)P 進(jìn)行反交換[58]。因此，他們提出了一個模型，即以O(shè)sh4 作為PI(4)P 和甾醇交換劑，以PI(4)P 梯度作為能量源，對脂質(zhì)分子進(jìn)行濃度梯度運(yùn)輸，并在體外得到了試驗(yàn)證實(shí) (圖3)[55,59]。PI(4)P 在反式高爾基體和質(zhì)膜的胞質(zhì)表面富集，但不存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，這意味著膜室之間存在巨大的PI(4)P 濃度梯度。在酵母中，這種梯度由磷脂酰肌醇激酶4 (phosphatidy linositol 4 kinase)Pik1 和Stt4 維持，分別通過反式高爾基體和質(zhì)膜中磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol，PI) 的磷酸化生成PI(4)P[60]；相反，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的主要磷酸酶Sac1 會將PI(4)P 降解為PI；同時，Osh4 通過攝取PI(4)P 來下調(diào)細(xì)胞PI(4)P 水平[61]，并將從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中提取的甾醇轉(zhuǎn)移到反式高爾基體和質(zhì)膜中[62]。Osh4 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中攝取甾醇，然后在高爾基體中對甾醇和PI(4)P 進(jìn)行反交換，隨后將PI(4)P 轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Sac1 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中將PI(4)P 轉(zhuǎn)化為PI，從而維持甾醇/PI(4)P 轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)[6,55]。酵母Osh 蛋白的研究為其它真核生物ORPs 的脂質(zhì)分子轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了證據(jù)，Du 等通過原核表達(dá)獲得ORPs 家族重組蛋白，并通過甾醇轉(zhuǎn)移試驗(yàn)證明OSBP、ORP9L和ORP5 的ORD 結(jié)構(gòu)具有體外甾醇轉(zhuǎn)移活性[63]。此外，細(xì)胞內(nèi)ORPs 表達(dá)水平的調(diào)控也會影響細(xì)胞內(nèi)甾醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。綜上，ORPs 的一個共同特征是結(jié)合PI(4)P 和甾醇分子并將其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與質(zhì)膜或反式高爾基體之間進(jìn)行反向運(yùn)輸[64]。

圖3 膜接觸位點(diǎn)中ORP 脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)模型[55]Fig.3 Structural model of lipid transport by ORP homologues in a membrane contacts site[55]

2.2 非囊泡運(yùn)輸

在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的運(yùn)輸分為2 種形式：囊泡運(yùn)輸和非囊泡運(yùn)輸。一直以來，囊泡運(yùn)輸被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕问健Ｈ欢?，近期的研究表明，非囊泡運(yùn)輸也在脂質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮著重要作用[65-67]。在非囊泡運(yùn)輸過程中，膜接觸位點(diǎn)起著關(guān)鍵作用[68-69]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是脂質(zhì)代謝最重要的單細(xì)胞器，并且大多數(shù)脂質(zhì)生物合成酶定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一些脂質(zhì)運(yùn)輸是由膜結(jié)合的囊泡介導(dǎo)的，但對于不參與囊泡運(yùn)輸?shù)募?xì)胞器 (例如線粒體) 和繞過囊泡的脂質(zhì)，都需要重要的非囊泡運(yùn)輸途徑[70-71]。這些脂質(zhì)被直接輸送到分泌途徑的后期，在那里發(fā)揮作用[72-73]，或者它們必須快速地選擇性地被替換[74]。

膜接觸位點(diǎn) (membrane contact site, MCS) 是細(xì)胞內(nèi)膜隔室之間形成的緊密區(qū)域，并且膜間存在10～30 nm 的間隙[75-76]。此外，還富含一些對高爾基體功能和結(jié)構(gòu)具有重要作用的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，例如氧化固醇結(jié)合蛋白、神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜磷脂轉(zhuǎn)移蛋白等[77-78]。不同氧化固醇結(jié)合蛋白家族的膜接觸位點(diǎn)有所差異但卻具有相似的功能，主要在MCS 處進(jìn)行脂質(zhì)代謝與物質(zhì)運(yùn)輸。雖然這種運(yùn)輸機(jī)制尚不清楚，但也表明了MCS 的作用。MCS 蛋白質(zhì)可能分為兩類：一類是使兩個膜接觸的蛋白質(zhì)。在這一結(jié)構(gòu)類別中，除了細(xì)胞核與液泡之間的橋聯(lián)功能外，其余大部分功能都已明確[79]。另一類蛋白質(zhì)是脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白，它們在MCS處與供體和受體膜相互作用發(fā)揮功能 (圖4)。脂質(zhì)結(jié)合蛋白與其配體結(jié)合并穿過MCS 的狹窄間隙。具有雙特異性靶向的脂質(zhì)結(jié)合蛋白可以引導(dǎo)兩種特定膜之間的擴(kuò)散，如果它能夠同時結(jié)合兩個受體，那么其對膜的親和力將增加很多倍，對MCS也具有了更強(qiáng)的靶向性。大多數(shù)ORPs 向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和反式高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)，并在膜接觸位點(diǎn)附近聚集，進(jìn)而在非囊泡運(yùn)輸中起重要作用。

圖4 作用于膜接觸部位的脂質(zhì)結(jié)合蛋白[80]Fig.4 Lipid-binding proteins acting at membrane contact sites[80]

2.3 氧化固醇結(jié)合蛋白在病菌致病力中的作用

氧化固醇結(jié)合蛋白廣泛存在于真核生物中，但其底物在不同物種中是不同的。在哺乳動物中為膽固醇，在真菌中為麥角甾醇，而在植物中則為β-谷甾醇 (圖5)[81]。麥角甾醇主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上從頭合成，并轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜[82-83]，其中氧化固醇結(jié)合蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜之間的甾醇轉(zhuǎn)運(yùn)中起直接作用。絲狀真菌是通過連續(xù)的頂端伸長和分枝生長形成菌絲和菌絲體，而麥角甾醇在這一過程中扮演著十分重要的角色，氧化固醇結(jié)合蛋白則負(fù)責(zé)麥角甾醇的連續(xù)運(yùn)輸[84]，也在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞極性生長中發(fā)揮重要作用[61]。當(dāng)麥角甾醇合成和轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制時，菌絲就會產(chǎn)生頂端膨大、分枝畸形等癥狀從而致使生長受到抑制[85]。

圖5 不同物種中的甾醇結(jié)構(gòu)Fig.5 Sterol structure in different species

氧化固醇結(jié)合蛋白在絲狀真菌中廣泛存在，并且是特異保守的[86]。例如在構(gòu)巢曲霉中存在5 個編碼Osh 基因，AnoshA、AnoshB、AnoshC、AnoshD 和AnoshE，它們在細(xì)胞內(nèi)定位不同，從而在不同的細(xì)胞器之間行使運(yùn)輸磷脂和固醇的功能。它們都具有一個ORD 結(jié)構(gòu)域，并且AnoshC在真菌生長和發(fā)育中扮演重要角色，該結(jié)構(gòu)域敲除后生長受到嚴(yán)重抑制。研究人員通過缺失AnoshE，發(fā)現(xiàn)突變型與野生型相比分生孢子有明顯降低，說明Osh 蛋白能夠促進(jìn)分生孢子的生成[10]。在稻瘟病菌中存在6 個ORPs 成員，范軍課題組研究發(fā)現(xiàn)，MoORPs 可以增強(qiáng)病原體毒力并激活植物免疫。同時敲除MoORP1 和MoORP3，可消除真菌菌落徑向生長；而同時敲除MoORP1 和MoORP2，則會損害真菌對大麥和水稻的毒力[14]。

ORPs 基因在真核生物中具有廣泛的保守性，其基因組中編碼多個同源ORPs 基因。有人認(rèn)為釀酒酵母的Osh 基因具有重疊的基本功能[87]，缺乏Osh 蛋白家族會導(dǎo)致細(xì)胞失去正常極化，生長異常[88]。任何一個家族成員都在保持細(xì)胞活力方面發(fā)揮著作用，例如僅Osh4p 就足以維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞極化[89]。此外，研究證明哺乳動物和酵母中的ORPs 的一個亞群在體外脂質(zhì)體之間運(yùn)輸固醇[90]，酵母Osh6 和Osh7 以及哺乳動物ORP5 和ORP8介導(dǎo)著磷脂酰絲氨酸 (PS) 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到質(zhì)膜的運(yùn)輸[91]。據(jù)報(bào)道，Osh6、Osh7 和ORP5 不與固醇結(jié)合[44]。然而，Osh6 和Osh7 被認(rèn)為在體外脂質(zhì)體之間運(yùn)輸膽固醇，盡管比Osh4 和Osh5 慢[92]。此外，ORP5 和ORP8 被認(rèn)為在體外結(jié)合或運(yùn)輸固醇[93]?？紤]到ORPs 家族內(nèi)分子和功能的多樣性[94]，以及ORP 在細(xì)胞周期和發(fā)育中具有不同的作用[95]，我們認(rèn)為僅將一種功能歸于該蛋白質(zhì)家族過于簡單。從大量膜脂的運(yùn)輸?shù)叫盘栔|(zhì)的調(diào)節(jié)反應(yīng)，ORPs 的功能將根據(jù)其配體的性質(zhì)而變化。為全面了解這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞生理學(xué)中的作用，首先需要確定ORPs 家族成員的結(jié)構(gòu)，確定其在細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白，進(jìn)而闡明ORPs 在細(xì)胞中的功能。

3 基于植物病原菌氧化固醇結(jié)合蛋白的靶向殺菌劑設(shè)計(jì)合成研究初探

新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)是農(nóng)藥創(chuàng)制的開始，此階段工作內(nèi)容主要有靶標(biāo)識別和結(jié)構(gòu)解析、靶向活性化合物的篩選以及先導(dǎo)化合物的識別優(yōu)化等3 方面[96]。靶標(biāo)識別和驗(yàn)證是農(nóng)藥創(chuàng)制的第1 步，一旦確定了靶標(biāo)，往往需要通過基因敲除或RNA 干擾等研究手段進(jìn)行確認(rèn)，證實(shí)靶標(biāo)蛋白的活性及其在致病過程中的作用。當(dāng)靶標(biāo)被發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)后，通常會通過蛋白晶體解析的方法獲得其靶酶結(jié)構(gòu)，進(jìn)而利用基于蛋白結(jié)構(gòu)和基于藥效團(tuán)的虛擬篩選方法，從數(shù)以百萬計(jì)的小分子化學(xué)庫中高通量篩選活性化合物，通過聚類分析進(jìn)行化合物的分類，并通過結(jié)合能的比較確定先導(dǎo)化合物，得到高效先導(dǎo)化合物后即可進(jìn)入到合成優(yōu)化階段[97]。

在醫(yī)藥開發(fā)領(lǐng)域中，目前已存在多種以氧化固醇結(jié)合蛋白為靶標(biāo)的抗白血病和抗病毒藥物。例如ORP4 是一個與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)密切相關(guān)的氧化固醇結(jié)合蛋白成員。研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪雙甾體類天然產(chǎn)物Ritterazine B 正是一種以O(shè)RP4 為靶標(biāo)的白血病抑制劑[98]；腸道病毒復(fù)制天然產(chǎn)物抑制劑OSW-1 和TTP-8307 都能夠通過抑制氧化固醇結(jié)合蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮作用[99-100]。

在農(nóng)藥開發(fā)領(lǐng)域中，國外農(nóng)藥企業(yè)巨頭正在積極布局氧化固醇結(jié)合蛋白抑制劑開發(fā)。2008 年杜邦公司創(chuàng)制出具有超高活性的卵菌氧化固醇結(jié)合蛋白抑制劑氟噻唑吡乙酮[101-102]，它能顯著抑制霜霉Pseudoperonospora cubensis游動孢子釋放、孢子萌發(fā)和病斑擴(kuò)展等致病過程，還能有效抑制向日葵霜霉病菌P.halstedii、羅勒霜霉病菌Peronospora belbahrii和煙草疫霉P.nicotianae等[103]。杜邦公司基于卵菌氧化固醇結(jié)合蛋白，并在保留噻唑哌啶環(huán)及異噁唑環(huán)的條件下，發(fā)現(xiàn)化合物的1[90]和2[104](圖6) 在40 mg/L 時對葡萄霜霉病和馬鈴薯晚疫病的防效均為100%?；衔? 和4 對根腫菌綱、卵菌綱、壺菌綱、接合菌綱、子囊菌綱、擔(dān)子菌綱和半知菌綱具有較好殺菌活性[105]；化合物5 對致病疫霉P.infestans和軸霜霉Plasmopara.vitcola有較好的保護(hù)活性[106]?；衔? 可控制擔(dān)子菌綱、子囊菌綱、卵菌綱和半知菌綱等廣譜的植物真菌病害[107]。這些化合物在結(jié)構(gòu)上繼承了氟噻唑吡乙酮的骨架結(jié)構(gòu)4-(噻唑-2-基)哌啶 (圖6)，表現(xiàn)出不同程度的殺菌能力。此外，先正達(dá)公司Sulzer 等也開啟了基于氧化固醇結(jié)合蛋白的殺真菌化合物設(shè)計(jì)研究，并在第十四屆IUPAC 農(nóng)藥化學(xué)國際會議上做了相應(yīng)報(bào)告[108]。由此可見，氧化固醇結(jié)合蛋白已成為了國際農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)。此外，我國科學(xué)家也在氧化固醇結(jié)合蛋白抑制劑開發(fā)中做出了較大貢獻(xiàn)，華中師范大學(xué)楊光富團(tuán)隊(duì)和西北農(nóng)林科技大學(xué)劉西莉課題組通過整合分子對接、分子動力學(xué)模擬和分子力場泊松玻爾茲曼表面積 (Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area) 計(jì)算，系統(tǒng)地研究了辣椒疫霉氧化固醇結(jié)合蛋白與氟噻唑吡乙酮的相互作用，并以哌啶基噻唑異噁唑啉為先導(dǎo)，設(shè)計(jì)合成并發(fā)現(xiàn)了對辣椒疫霉高活性的目標(biāo)分子[109]；商品化OSBP 抑制劑氟噻唑吡乙酮登記為卵菌病害防治藥劑，為拓展靶向氧化固醇結(jié)合蛋白類藥劑的殺菌譜，南開大學(xué)范志金課題組基于真菌氧化固醇結(jié)合蛋白和噻唑哌啶類先導(dǎo)結(jié)構(gòu)開展的分子設(shè)計(jì)合成，發(fā)現(xiàn)一類結(jié)構(gòu)更簡單的異噻唑聯(lián)噻唑哌啶類高活性目標(biāo)分子，大部分化合物對立枯絲核病菌Rhizoctonia cerealis、花生褐斑病菌Cercospora arachidicola、黃瓜灰霉病菌Botrytis cinerea和小麥赤霉病菌Fusarium graminearum具有廣譜殺菌活性，且優(yōu)于陽性對照氟噻唑吡乙酮，研究結(jié)果拓展了氧化固醇結(jié)合蛋白從靶向卵菌到真菌病害的新殺菌劑創(chuàng)制[110-111]。

圖6 卵菌氧化固醇結(jié)合蛋白抑制劑開發(fā)Fig.6 Oomycete oxysterol-binding protein inhibitor development

4 總結(jié)和展望

氧化固醇結(jié)合蛋白及其相關(guān)蛋白作為脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白通過運(yùn)輸交換脂質(zhì)，可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間交換PI(4)P 和固醇，促進(jìn)脂質(zhì)的代謝。目前，相對于酵母，一些絲狀真菌中的Osh 蛋白質(zhì)、哺乳動物中的ORPs 家族蛋白質(zhì)的工作環(huán)境更加復(fù)雜，除了ORP5/8 的ORD 結(jié)構(gòu)域之外，其他ORPs 的ORD 結(jié)構(gòu)域都是未解之謎；細(xì)胞內(nèi)的膜接觸位點(diǎn)雖然已被證明對于細(xì)胞的生命活動極為重要，特別是對于氧化固醇結(jié)合蛋白參與脂質(zhì)代謝所提供的環(huán)境支撐作用，但是其具體的生物學(xué)意義仍有待去探索驗(yàn)證；此外，真菌氧化固醇結(jié)合蛋白的高級結(jié)構(gòu)尚未被解析，這極大地制約了以其為靶標(biāo)的真菌抑制劑的開發(fā)。因此，探究植物病原真菌氧化固醇結(jié)合蛋白新靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)與功能，將為靶向殺菌分子的設(shè)計(jì)奠定理論基礎(chǔ)，將對我國綠色農(nóng)藥新品種創(chuàng)制和保障糧食安全做出貢獻(xiàn)。