基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量分析氧固醇的研究進(jìn)展

陳麗姍， 韓曉菲

(遼寧省糖脂代謝研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116622)

1 概述

氧固醇(Oxysterols)是膽固醇及其前體的氧化形式[1 - 2]。氧固醇家族有眾多成員，它們可通過酶催化、活性氧氧化或體外自氧化過程，在膽固醇碳環(huán)或側(cè)鏈上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入含氧官能團(tuán)，例如羥基、酮基、和環(huán)氧基等[3]。最早關(guān)于氧固醇的研究可以追溯到二十世紀(jì)四十年代，Bergstr?m等人[4]研究體液中膽固醇代謝物時(shí)，發(fā)現(xiàn)膽固醇存在體外非酶促自氧化現(xiàn)象，并指出膽固醇7位相比于其余位點(diǎn)更容易被分子氧氧化。隨后，Smith等[5]人的研究工作進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了膽固醇易于自氧化的特點(diǎn)。Kudo等[6]人提出生物樣品中大多數(shù)氧固醇，如7β-HC(7β-Hydroxycholesterol)、7-KC(7-Ketocholesterol)、CT(Cholestane-3β,5α,6β-triol)、5,6-EC(5,6-Epoxycholesterol)和25-HC(25-Hydroxycholesterol)可能為膽固醇自氧化產(chǎn)物，同時(shí)也提出25-HC、7-KC和7β-HC也可通過酶促反應(yīng)形成[7]。氧固醇研究中的關(guān)鍵問題是如何區(qū)分其是通過體內(nèi)酶催化產(chǎn)生還是在樣品儲(chǔ)存和制備過程中形成的。盡管近現(xiàn)代色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速，氧固醇分子全面識(shí)別與精確定量分析依舊困擾著研究人員。

近年來氧固醇的生物學(xué)功能得到廣泛關(guān)注，其主要生理活性是在體內(nèi)膽固醇平衡中起調(diào)節(jié)作用[8 - 9]；氧固醇也可作為核受體的激動(dòng)劑或反向激動(dòng)劑，例如它可作為肝X受體α、β的激動(dòng)劑[10 - 11]和視黃酸相關(guān)孤兒核受體α、γ的反向激動(dòng)劑[12]；也可作為G蛋白偶聯(lián)受體(如EB病毒誘導(dǎo)基因2)的配體[13 - 14]；同時(shí)氧固醇在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用，它可通過B細(xì)胞抑制IgA的產(chǎn)生，指導(dǎo)生發(fā)型濾泡中活化B細(xì)胞的遷移并控制單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞[15]，巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生25-HC(固醇代謝網(wǎng)絡(luò)的一種成分)經(jīng)由Stat1信號(hào)通路與干擾素反應(yīng)相關(guān)聯(lián)從而發(fā)揮抗病毒作用[16]；此外氧固醇還具有作為神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默癥)標(biāo)志物的潛能[17 - 18]；而且，氧固醇對(duì)腦發(fā)育中神經(jīng)的形成也有重要影響[19]。研究者們希望通過發(fā)展針對(duì)固醇脂類化合物的分析方法，從而更高效、全面的定量分析這些化合物，并且揭示其代謝異常與疾病的相關(guān)性。

氧固醇是一種微量固醇，相比于膽固醇其在生物樣品中的含量極低，通常情況下膽固醇含量至少為任意一種氧固醇含量的1 000倍，這也使氧固醇的高通量定量分析成為難點(diǎn)。Dzeletovic等人[20]提出了溫和酯水解條件，并建立了適合于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析固醇的分離與衍生化方法，使自氧化形成的氧固醇含量減少。氧固醇定量分析方法的優(yōu)化建立，包括前處理方法、儀器分析方法及數(shù)據(jù)處理方法等,是進(jìn)行全面準(zhǔn)確分析氧固醇、闡明其生物學(xué)功能和獲取其代謝過程與疾病相關(guān)性信息的先決條件。本文將對(duì)近年來針對(duì)氧固醇檢測(cè)分析方法的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)與展望。

2 分析方法

2.1 基于氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)

經(jīng)典的氧固醇定量分析方法是利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，已成功應(yīng)用于腦脊液(CSF)樣本[23]、腦組織樣本[26]和細(xì)胞樣本[27]中氧固醇的定量分析。其中，定量分析0.5 mL腦脊液樣品中氧固醇含量時(shí)，分析靈敏度約為1 ng·mL-1，相同體積血清的靈敏度則小于0.5 ng·mL-1。該方法測(cè)得的結(jié)果是游離氧固醇和氧固醇脂肪酸酯的總和，局限性為它不適合用于氧固醇偶聯(lián)物的定量。Bj?rkhem[28]研究小組改進(jìn)了GC-MS方法使其適用于膽固醇酸的分析，主要研究對(duì)象為腦脊液中的7-HOCA(7-Hydroxy-3-oxo-4-cholestenoic Acid)，此方法可定量1 mL腦脊液中ng級(jí)的7-HOCA。該過程需要注意的是，含3-oxo-4-en-7-ol基團(tuán)固醇的羥基在酸、堿條件下均不穩(wěn)定。

2.2 基于液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)

2.2.1無衍生化的LC-MS聯(lián)用技術(shù)McDonald等人[30 - 31]發(fā)展了一種針對(duì)氧固醇高通量分析的LC-MS方法。該方法可檢測(cè)出200 μL血漿中1 ng級(jí)的氧固醇。McDonald和Russell等利用此方法分析了來自NIST的血漿樣品，并且定量了10種氧固醇的濃度。之后他們?cè)俅卫么朔椒z測(cè)3 230例血清樣品，分析其中60余種固醇及維他命D代謝物，他們成功定量了血清中29種固醇，其中含15種氧固醇[31]。相比于其他LC-MS定量氧固醇的方法，該方法已被應(yīng)用到最多數(shù)量的實(shí)際生物樣品檢測(cè)中。

2.2.2衍生化的LC-MS聯(lián)用技術(shù)Honda等人[32]報(bào)道了一種將氧固醇衍生化為吡啶基酯，且靈敏度較高的LC-MS/MS分析方法。隨后，Ikegami等人[33]利用這種方法分析了丙肝患者(n=55)和正常人(n=113)血清樣本中氧固醇，測(cè)定了血清中6種氧固醇的濃度，結(jié)果顯示7α-HC(7α-Hydroxycholesterol)、4β-HC(4β-Hydroxycholesterol)和25-HC在疾病組中的含量較高，當(dāng)經(jīng)過抗病毒治療后檢測(cè)結(jié)果顯示這些氧固醇的含量下降。24S-HC(24S-Hydroxycholesterol)，26-HC(26-Hydroxycholesterol)和7α-HCO(7α-Hydroxycholestenone)的濃度在疾病與健康對(duì)照組間無明顯差異。

尼古丁酸(吡啶-3-羧酸)與吡啶甲酸(吡啶-2-羧酸)有極其相似的結(jié)構(gòu)，Sidhu人等[34]用尼古丁酸代替吡啶甲酸測(cè)定血漿和腦脊液中游離24S-HC的含量，檢測(cè)50 μL血漿和200 μL腦脊液樣品中24S-HC含量，檢出限分別可達(dá)1 ng·mL-1和0.025 ng·mL-1。

Jiang等人[35 - 36]嘗試采用衍生化手段改進(jìn)基于LC-MS/MS的氧固醇分析方法。他們將此方法應(yīng)用于尼曼-匹克氏C1病(NCP1)病人的血漿樣品，采用MRM模式分別定量正常對(duì)照(n=89)、父母或兄弟姐妹患病的基因攜帶者(n=45)和NPCI患者(n=109)血漿中7-KC和CT兩種氧固醇。在對(duì)照組、NPC1患者組和攜帶者組中7-KC含量的平均值分別為29.0 ng·mL-1、229 ng·mL-1和43.8 ng·mL-1，其中NPC1患者組7-KC含量與其他兩組相比有顯著差異。CT含量也有類似差異，在NPC1患者中含量最多，但其在三組間含量差異沒有7-KC顯著。

部分氧固醇含有羰基，例如7α-HCO和7α,12α-diHCO等，羰基可與羥胺溶劑作用形成肟類化合物，在十幾年來這一反應(yīng)常應(yīng)用于含氧固醇的GC-MS和LC-MS分析[37]。Debarber等人[38-29]利用含氧季銨鹽(QAO)試劑(O-(3-Trimethylammonium-propyl)hydroxylamine)衍生含羰基的氧固醇，并應(yīng)用此方法對(duì)腦腱性黃瘤癥(CTX)患者進(jìn)行診斷，此方法對(duì)于4 μL血漿中氧固醇的檢出限為20 ng·mL-1。研究結(jié)果表明7α,12α-diHCO可作為CTX特征性診斷物，其含量在患病成年人中高于正常人的3 000倍，新生兒中超過10倍。

基于LC-MS/MS的氧固醇分析中最常用的衍生化方法是將氧固醇衍生化為吉拉德腙類化合物[40 - 46]，吉拉德試劑經(jīng)常被用于固醇類分析。許多氧固醇含有3β-羥基-5-烯基團(tuán)，利用膽固醇氧化酶將其氧化后產(chǎn)生的3-氧-4-烯基團(tuán)[47]可快速與吉拉德試劑發(fā)生衍生化。含有3β-羥基-5α-氫的氧固醇也可被氧化為3-氧化合物，這一3-氧化合物與吉拉德試劑的反應(yīng)速度較3-氧-4-烯慢[48]。通常使用的兩種吉拉德試劑為吉拉德試劑T(GT)和吉拉德試劑P(GP)。

酶催化氧化和GP試劑衍生化并用的方法稱為酶輔助衍生化的固醇分析(EADSA)[49 - 52]。GP試劑衍生化的一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是氧固醇衍生化產(chǎn)物產(chǎn)生不同的碎片，從而能區(qū)分同分異構(gòu)體。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以應(yīng)用于膽酸等氧固醇的下游代謝物。此方法能檢測(cè)到100 μL血漿中ng含量水平和250 μL腦脊液中30 pg·mL-1含量水平的氧固醇。這一方法也曾應(yīng)用于維他命D分析[53]。Roberg-Larsen等人[40 - 41]采用上述類似方法，使用GT試劑和單一離子阱，并在進(jìn)入色譜柱前加入去除多余衍生化試劑的步驟。他們同時(shí)采用micro-LC和nano-LC以提高靈敏度，使用nano-LC-ESI-MS/MS可達(dá)到fg數(shù)量級(jí)檢出限，也可檢測(cè)從10 000 個(gè)細(xì)胞中提取到的氧固醇輪廓譜。蛻皮類固醇是從昆蟲中發(fā)現(xiàn)的一種多羥基固醇，Shevchenko等人[43]對(duì)這種分子的分析也選用了GT衍生化和LC-ESI-MS/MS進(jìn)行pg數(shù)量級(jí)的檢測(cè)。

上述EADSA分析方法的缺點(diǎn)是：某些氧固醇和膽酸本身具有3-oxo-4-ene基團(tuán)，這使它們與通過膽固醇氧化酶氧化產(chǎn)生3-oxo-4-ene基團(tuán)的分子難以區(qū)分，例如7α-HC和7α-diHCA。為解決這一難題，Griffiths等將第一次過固相萃取柱洗脫下來的氧固醇分為A和B兩部分，A中加入膽固醇氧化酶而B中不加。B可顯示本身含有Oxo基團(tuán)的分子信息，A既能顯示本身擁有3-OXO基團(tuán)也可顯示氧化產(chǎn)生3-OXO基團(tuán)的分子信息。從A中的信息除去B中也含有的則可得到因氧化產(chǎn)生3-OXO基團(tuán)的分子的含量。這一過程需要運(yùn)行兩次獨(dú)立但連續(xù)的LC-MS分析，為簡(jiǎn)化分析過程，需使用同位素編碼的衍生化試劑或定量電荷標(biāo)記[54]。GP試劑可直接合成為同位素標(biāo)記的形式，例如通過[2H5]吡啶與溴乙酸乙酯反應(yīng)生成酰肼，從而得到[2H5]GP試劑。在EADSA方法中，Griffiths等利用[2H5]GP試劑將A衍生化，B的衍生化則用[2H0]GP試劑進(jìn)行，由于[2H5]GP和[2H0]GP具有相同的質(zhì)量數(shù)但經(jīng)過MS/MS后產(chǎn)生不同m/z的離子碎片，這樣便可以被應(yīng)用于A和B部分的相對(duì)定量。在進(jìn)樣LC-MS分析前立即將兩部分混合，A中的分析物比B中相同分析物的多5道爾頓，因此在一次運(yùn)行的LC-MS分析中A和B兩部分可輕松區(qū)別。

表1總結(jié)了文獻(xiàn)中所報(bào)道的相應(yīng)氧固醇的分析方法。

表1 氧固醇分析方法

a7-OC(7-oxocholesterol);7α,27-DC(7α,27-dihydroxycholesterol);24-OC(24-oxocholesterol);24(S),25-EC(24(S),25-epoxycholesterol);22-OC(22-oxocholesterol);20R,22R-DC(20R,22R-dihydroxycholesterol);7α,25-DC(7α,25-dihydroxycholesterol);7β,25-DC(7β,25-dihydroxycholesterol);7α,27-DC(7α,27-dihydroxycholesterol);7α,12α-DC(7α,12α-dihydroxycholesterol).

3 結(jié)論與展望

樣品儲(chǔ)存和制備過程中膽固醇自氧化是氧固醇分析過程的關(guān)鍵，同時(shí)氧固醇既可內(nèi)源性合成也可以通過酶催化氧化或自由基反應(yīng)形成，這與在空氣中氧化形成的氧固醇具有完全一樣的結(jié)構(gòu)，對(duì)于容易在空氣中通過自氧化形成的7α-HC、7β-HC、7-KC、CT和5,6-EC尤為重要。針對(duì)這些可能有必要采取防止自氧化的措施，例如使用抗氧化劑(BHT)和金屬螯合劑(EDTA)，在惰性氣體(氬氣或氮?dú)?下進(jìn)行樣品前處理步驟，避免過高的溫度和盡量除去樣品中的膽固醇等。

氧固醇最佳分析方法的選擇取決于所研究的目標(biāo)氧固醇以及擁有的實(shí)驗(yàn)條件。目前已建立的LC-MS和GC-MS方法適合應(yīng)用于診斷膽固醇生物合成和代謝的單基因遺傳病，例如腦腱黃瘤病(CTX)在診斷時(shí)通常會(huì)檢測(cè)出血漿中(25R)26-HC的含量極低或缺乏和7α,12α-diHCO含量增多，當(dāng)血漿中含大量(25R)26-HC和3β-HCA時(shí)可被推測(cè)為7α羥化酶缺失。值得注意的是，歐洲氧固醇研究網(wǎng)(http://oxysterols.com/)組織的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部間調(diào)查結(jié)果反饋出膽固醇體外自氧化會(huì)使7α-HC、7β-HC和7-KC檢測(cè)濃度的變異系數(shù)增高，代表性側(cè)鏈氧固醇，例如24-HC和(25R)26-HC)在不同實(shí)驗(yàn)室間的變異系數(shù)大約為60%，此結(jié)果說明利用這些代謝物用于診斷目的時(shí)仍存在不確定性，需要進(jìn)行大量工作規(guī)范分析方法，降低變異系數(shù)，從而提高定量及診斷的精確性。