HPLC-MS/MS 同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定水產(chǎn)品中6 種喹諾酮藥物殘留量

常 波

（營(yíng)口市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合發(fā)展服務(wù)中心（營(yíng)口市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心），遼寧營(yíng)口 115004）

水產(chǎn)養(yǎng)殖是一個(gè)不斷增長(zhǎng)的全球性行業(yè)，隨著產(chǎn)量提高而不斷增加的獸藥使用量已成為全球關(guān)注的問題。其中喹諾酮類藥物是水產(chǎn)品殘留的主要獸藥之一，具有抗菌效果好、抗菌譜廣等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被大量應(yīng)用防治疾病[1]。如果長(zhǎng)期食用喹諾酮類的食品可造成慢性中毒，引起細(xì)菌耐藥性等后果[2]。

從2015 年開始我國(guó)在動(dòng)物源食品中禁止使用的喹諾酮類藥物有4 種，分別是諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星和培氟沙星4 種獸藥鹽類、酯類及其他制劑，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）[3]中魚（皮+肉）中恩諾沙星和環(huán)丙沙星之和殘留限量為100 μg·kg-1。雖然針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥和非處方抗生素的使用有相應(yīng)的控制和監(jiān)管措施，但在養(yǎng)殖過程中仍會(huì)有過度使用導(dǎo)致藥物在動(dòng)物食品中富集，通過生物鏈進(jìn)入人體內(nèi)，從而對(duì)人體健康造成危害[4]。

目前，喹諾酮類藥物常用檢測(cè)方法主要有液相色譜法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）[5-7]，而液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將超高效液相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)有效結(jié)合起來，具有專屬性高、靈敏度高，適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分分析優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)下獸藥殘留檢測(cè)的主要手段。農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008[8]是目前檢測(cè)水產(chǎn)品中喹諾酮類殘留的UPLC-MS/MS 方法，但實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)該方法基質(zhì)效應(yīng)大，因此本實(shí)驗(yàn)在此方法基礎(chǔ)上用固相萃取柱C18進(jìn)行凈化，有效改善基質(zhì)效應(yīng)的影響，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯉魚，購(gòu)買于遼寧省營(yíng)口市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；諾氟沙星（純度98.8%）、環(huán)丙沙星（純度99.3%）、氧氟沙星（純度99.8%）、培氟沙星（純度99.8%）、洛美沙星（純度99.7%）、恩諾沙星（純度99.3%）、氘代諾氟沙星（諾氟沙星-D5，純度99.3%）、氘代恩諾沙星（恩諾沙星-D5，純度99.6%）和氘代環(huán)丙沙星（環(huán)丙沙星-D8，純度99.6%），均購(gòu)自ANPEL；甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Meker 公司）；乙酸、甲酸（色譜純，中國(guó)安譜有限公司）；C18固相萃取柱（500 mg，6 mL，Aglient）；試驗(yàn)用水均為超純水。

Aglient 超高效液相色譜-質(zhì)譜三重四極桿聯(lián)用儀6460（配有EI 離子源）；分析天平（感量0.01 g、0.000 01 g，瑞士Mettle Toledo 公司）；渦旋振蕩器（德國(guó)Heidolph）；1 000 μL 移液槍（德國(guó)艾本德）；冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；全自動(dòng)氮吹濃縮儀N1（上海屹堯Preekem）；Milli-Q Advamtage 超純水器（美國(guó)Millipore）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取培氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、洛美沙星和恩諾沙星對(duì)照品10 mg（精確至±0.000 01 g），分別置于10 mL 棕色容量瓶中，先加甲酸200 μL 使其完全溶解，再用甲醇定容，混勻配制成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精確移取喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋配制成0.1 μg·mL-1、1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品諾氟沙星-D5、恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D85.0 mg、10.0 mg、2.5 mg（精確至±0.000 01 g），分別置于10 mL、10 mL、5 mL棕色容量瓶中，先加甲酸200 μL 使其完全溶解，再用甲醇定容，混勻配制成0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密移取上述內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋配成1.0 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理

稱取勻漿樣品5.0 g（準(zhǔn)確至±0.02 g），置于50 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL 諾氟沙星-D5、恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混勻30 s，避光放置10 min，加入10 mL 1%乙酸乙腈，渦旋混合1 min，超聲提取5 min，10 000 r·min-1，離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)50 mL 離心管中，向殘?jiān)屑尤?0 mL 1%乙酸乙腈重復(fù)提取1 次，合并兩次提取液，于40 水浴中氮吹至近干，用5 mL 10%甲醇水溶解殘?jiān)瑴u旋混勻備用。用6 mL 甲醇和6 mL 水依次活化凈化柱C18，取5 mL 備用液上樣，加水6 mL 淋洗，每次3 mL，棄去流出液，用6 mL 甲醇洗脫，將洗脫液在40 水浴中氮吹至近干，1 mL流動(dòng)相定容；過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜至進(jìn)樣瓶，LC-MS/MS 待測(cè)定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

采用空白樣品所得溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液制得空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。取空白樣品按照“1.2.2”的方法處理，在經(jīng)提取凈化氮吹后的殘余物中加入流動(dòng)相制得空白基質(zhì)，添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制得濃度分別為0.01 μg·mL-1、0.02 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1和0.20 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)濃度為0.05 μg·mL-1，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。以測(cè)得定量離子峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ，進(jìn)樣量：5.0 μL，流速：0.3 mL·min-1。流動(dòng)相：0.1%甲酸水-甲醇（0.1%甲酸），梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序表

（2）質(zhì)譜MS 條件。負(fù)離子電噴霧ESI-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，掃描方式：負(fù)離子；毛細(xì)管電壓：4 000 V；霧化氣壓力：40 psi；氣流溫度：325 ；鞘氣流速：10 L·min-1。

1.2.5 樣品的回收率和精密度

取空白魚肉樣品中添加5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、50.0 μg·kg-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按“1.2.2”方法處理，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品制備3 個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取劑優(yōu)化

本方法研究了水產(chǎn)品前處理中加入甲醇、乙腈、乙腈（1%甲酸）、乙腈（1%乙酸）對(duì)喹諾酮類藥物的提取率的影響，其中乙腈（1%乙酸）的提取效果要大于乙腈（1%甲酸），這6 種喹諾酮對(duì)乙腈（1%乙酸）更敏感，切斷化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，更容易溶于乙腈（1%乙酸），提取率會(huì)更高。因此，本實(shí)驗(yàn)方法采用乙腈（1%乙酸）作為提取劑。而單獨(dú)的甲醇和乙腈提取率不佳，可能由于魚肉基質(zhì)復(fù)雜，導(dǎo)致喹諾酮與雜質(zhì)復(fù)合沉淀，影響提取效果。

2.2 工作曲線線性范圍

為了減少基質(zhì)干擾，本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在0.01 ～0.20 μg·mL-1線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好，滿足測(cè)定要求。線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3 方法的回收率和精密度

在5.0 g 空白鯉魚肉中添加低、中、高3 個(gè)濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度分別為0.1 μg·mL-1喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液250 μL，1 μg·mL-1喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，1 μg·mL-1喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液250 μL，添加濃度水平分別為5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、50.0 μg·kg-1，添加的混合物內(nèi)標(biāo)濃度為0.05 μg·mL-1，每個(gè)添加水平做6 個(gè)平行，按照1.2.2 前處理的方法進(jìn)行處理，測(cè)定喹諾酮峰響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）（%），計(jì)算方法的回收率和精密度。結(jié)果顯示，3 個(gè)添加水平的平均回收率為89%～102%，精密度為3.9%～5.2%（表3），滿足測(cè)定要求。

表3 方法回收率和精密度RSD 結(jié)果表（n=6）

3 結(jié)論

本方法建立了同時(shí)測(cè)定鯉魚中6 種喹諾酮類獸藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。試樣經(jīng)酸化乙腈提取，固相萃取柱C18凈化，能有效去除基質(zhì)中大部分雜質(zhì)，UPLC-MS/MS 分析檢測(cè)。采用同位素內(nèi)標(biāo)法和空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正，能有效改善基質(zhì)效應(yīng)的影響，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。