MAX 固相萃取-UPLC-MS/MS 法測(cè)定肉類(lèi)及其制品中L-谷氨酸鈉含量的方法

李 琳，張作棟，王 丹

（1.濰坊市疾病預(yù)防控制中心，山東濰坊 261061；2.濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊 261000）

谷氨酸鈉（C5H8NNaO4）是一種由鈉離子與谷氨酸根離子形成的鹽[1]。常見(jiàn)的谷氨酸鈉，即日常用作味精等調(diào)味品的主要成分是L-谷氨酸鈉[2]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定谷氨酸鈉的測(cè)定方法是高氯酸非水溶液滴定法、旋光法、酸度計(jì)法，缺乏總膳食中各種食品復(fù)雜基質(zhì)樣品中L-谷氨酸鈉提取、測(cè)定的方法研究[3-4]。

本文擬建立MAX 固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)肉類(lèi)及其制品中L-谷氨酸鈉的含量。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析比較，尋求靈敏度高、準(zhǔn)確度好、易于操作的樣品前處理?xiàng)l件和超高效液相色譜/串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲 醇（ 色 譜 純，F(xiàn)isher）； 乙 腈（ 色 譜 純，F(xiàn)isher）；氯化鈉（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)）；甲酸（色譜純，Thermo）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，Scharlau）；氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)）；氨水（色譜純，F(xiàn)isher）；屈臣氏蒸餾水。

固相萃取柱：MAX 混合型強(qiáng)陰離子交換反相固相萃取柱（Waters Oasis，3 cc/60 mg/30 μm）。標(biāo)準(zhǔn)品：L-谷氨酸鈉[C5H8NO4Na，CAS：142-47-2，≥99%（HPLC），Merk]。

1.2 儀器

超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS，Aglient1290-6460）； 高 速 冷 凍離心機(jī)（LYNX400，Thermo）；氮吹儀（NEVAP，Organomation）；渦旋振蕩器（Heidolph）；電子天平（ARA520，奧豪斯上海有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱2.1 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent poroshell 120 PFP 柱；流動(dòng)相A 相0.2%甲酸水溶液、B 相0.2%甲酸的乙腈；梯度洗脫；流速0.2 mL·min-1；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫40 等。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式；毛細(xì)管電壓4.0 kV；噴嘴電壓0.5 kV；氣體流量3.0 L·min-1；氣體溫度300 ；噴霧器電壓40 psi；鞘氣流量10 L·min-1；鞘氣溫度300 。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）掃描模式；L-谷氨酸鈉定性定量離子對(duì)147.90/84.10、147.90/56.05，碰撞能量16 eV、23 eV。

1.3.3 樣品提取與凈化

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g 均勻均質(zhì)后樣品于10 mL 離心管中，加入1.0 g NaCl，加入5 mL 0.1 mol·L-1HCl 萃取，渦旋2 min，超聲20 min，高速低溫離心10 000 r·min-15 min，取1 mL 上清液待凈化。以1 mL 5% NH3·H2O 活化MAX 柱，抽干，1 mL 上述上清液與1 mL 0.1 mol·L-1NaOH 中和后，以2 mL 中和液上樣，0.5 mL 純水淋洗2 次，0.5 mL 甲醇淋洗2 次后，以0.5 mL 含2%甲酸（v/v）的甲醇溶液洗脫2 次后，洗脫液合并，氮吹吹干并以0.1 mol·L-1HCl 復(fù)溶，以流動(dòng)相初始比例（0.2%甲酸水溶液∶0.2%甲酸的乙腈=60 ∶40）稀釋樣品100 倍，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理?xiàng)l件選擇

肉類(lèi)及其制品種類(lèi)繁多，基質(zhì)復(fù)雜，在前處理方法上要求較高[5]。本方法以純水、鹽酸水溶液、初始比例流動(dòng)相作為提取液[6]，通過(guò)1.3.3 的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)鹽酸水溶液提取回收率較高，重復(fù)性好，滿(mǎn)足樣本測(cè)定要求，最終確定0.1 mol·L-1HCl 為樣品提取液。提取液中除谷氨酸鈉外還含有大量其他物質(zhì)，因此提取和凈化方面選擇吸附力較強(qiáng)MAX 固相萃取柱。

2.2 色譜條件的選擇

Agilent poroshell 120 PFP 柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）由表面多孔填料組成，該填料含有實(shí)心內(nèi)核和多孔外層，這種填料在低壓下柱效高，是快速高分離度分離多種類(lèi)型分析物的理想選擇。用于本方法峰形尖細(xì)對(duì)稱(chēng)，對(duì)目標(biāo)峰干擾小（圖1）。

圖1 谷氨酸鈉總離子流圖

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)待測(cè)物質(zhì)帶正電荷的性質(zhì)，以1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液在ESI 正離子模式下進(jìn)行掃描，確定母離子、子離子，優(yōu)化碰撞能量，優(yōu)化MRM 模式下各部分溫度、電壓、流量等條件，見(jiàn)1.3.2。MRM 特征離子譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 MRM 特征離子譜圖

2.4 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍、檢出限

為提高檢測(cè)的靈敏度，采用147.90/84.10 離子定量，147.90/56.05 離子定性。配制多個(gè)濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，最終確定線性范圍在0.01 ～1.00 mg·L-1。以其峰面積（Y）對(duì)其濃度（X）作線性回歸分析，回歸方程為Y=4 231X+680，R2=0.995 5，R=0.997 7。以產(chǎn)生3 倍信噪比（S/N）時(shí)的濃度為檢出限（LOD），LOD為15 mg·kg-1；以產(chǎn)生10 倍信噪比（S/N）時(shí)濃度為定量限（LOQ），LOQ 為50 mg·kg-1。

2.5 方法的精密度與回收率

稱(chēng)取1.0 g 空白樣品，加入0.10 mg 谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，放置1 h 后，按照1.3.3 方法提取凈化上機(jī)測(cè)定，平行測(cè)定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（表1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的平均加標(biāo)回收率為89.04%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6）為2.28%，符合分析的要求。

表1 谷氨酸鈉回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.6 樣品測(cè)定

用本方法對(duì)本地區(qū)65 份肉類(lèi)及其制品進(jìn)行檢測(cè)，檢出含有谷氨酸鈉樣品42 份，檢出率64.62%。其中生肉制品22 份，檢出1 份，檢出率4.55%，檢出樣品集中在加入腌料的生肉制品中；加工熟肉制品43份，檢出41 份，檢出率95.35%，與實(shí)際情況相符。

3 結(jié)論

本方法建立了MAX 固相萃取-超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法，用于檢測(cè)肉類(lèi)及其制品中L-谷氨酸鈉的含量。該方法具有操作技術(shù)簡(jiǎn)便、快捷、靈敏的特點(diǎn)，同時(shí)具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，可滿(mǎn)足肉類(lèi)及其制品中谷氨酸鈉含量的測(cè)定。