活血通絡(luò)湯對(duì)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎患者內(nèi)皮祖細(xì)胞功能及血管內(nèi)皮損傷因子的影響

尹千璐 ，周小莉 ，王淼 ，熊川 ，鄭宇航 ，廖為翔 ，王卓君

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴州 貴陽 550025；2.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）是一種全身性自身免疫性疾病，以血管炎癥、內(nèi)皮損傷和組織損傷為特點(diǎn)，遷延難愈，且容易復(fù)發(fā)[1]。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）在維持內(nèi)皮功能完整性及修復(fù)內(nèi)皮損傷方面具有重要作用，其數(shù)量及功能受損可導(dǎo)致血管內(nèi)皮修復(fù)功能下降，并可能導(dǎo)致AAV早期復(fù)發(fā)及反復(fù)發(fā)作[2]。

根據(jù)其病變部位及臨床表現(xiàn)，AAV可歸屬中醫(yī)學(xué)“脈痹”“絡(luò)痹”范疇。瘀阻絡(luò)損是AVV核心病機(jī)，貫穿AAV發(fā)展及演變過程?；钛ńj(luò)湯由重慶市名老中醫(yī)張嗣蘭擬定，現(xiàn)為重慶市中醫(yī)院周圍血管（創(chuàng)面修復(fù)）科臨床治療AAV緩解期常用方。本研究觀察活血通絡(luò)湯對(duì)AAV患者外周血EPCs功能的影響，初步探討其治療AAV的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

外周血EPCs來自2020年7月－2022年6月重慶市中醫(yī)院符合AAV診斷標(biāo)準(zhǔn)[3-5]的患者及健康志愿者。

患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～70歲，性別不限；②近4周糖皮質(zhì)激素用量≤5 mg/d，服用免疫抑制劑不超過1種；③符合系統(tǒng)性小血管炎低活動(dòng)度，伯明翰系統(tǒng)性血管炎活動(dòng)評(píng)分（BVAS）<15分。④知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他結(jié)締組織疾病者；②原發(fā)造血系統(tǒng)疾病患者；③近期行外科手術(shù)、受外傷、重癥感染等患者；④合并嚴(yán)重高血壓病、糖尿病、高血脂、腫瘤等疾病。

共入選患者30例，其中男性13例、女性17例，平均年齡（48.93±16.90）歲，包含顯微鏡下多血管炎、肉芽腫性多血管炎、嗜酸性肉芽腫性多血管炎。同時(shí)，招募年齡相近的健康志愿者10名，其中男性4名、女性6名，平均年齡（45.60±15.78）歲。本研究經(jīng)重慶市中醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（2020-ky-64）。

1.2 動(dòng)物

雄性成年清潔型SD大鼠10只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2019-004。飼養(yǎng)于重慶市中醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度（23±2）℃，濕度45%～55%，自由攝食飲水。

1.3 藥物及制備

活血通絡(luò)湯（當(dāng)歸尾15 g，赤芍10 g，川芎10 g，桃仁10 g，紅花10 g，香附10 g，青皮10 g，王不留行10 g，牡丹皮10 g，牛膝10 g），飲片購(gòu)于重慶市中醫(yī)院中藥房，加水常規(guī)煎煮2次，過濾，合并濾液，加熱濃縮至原藥材濃度為2.0 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要試劑與儀器

Optiprep淋巴細(xì)胞分離液，北京索萊寶，批號(hào)07820；胎牛血清，上海李記生物科技公司，批號(hào)1050B0802；胰蛋白酶，美國(guó)HyClone公司，批號(hào)H120711；M199培養(yǎng)基，美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SH30253.01；Dil-ac-LDL，廣州奕源生物科技公司，批號(hào)YB-0013；FITC-UEA-1，上海復(fù)申生物科技公司，批號(hào)FS1109-1000μg；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒，廣州科聯(lián)生物技術(shù)公司，批號(hào)70-MTT002；Transwell嵌套（24孔，8 μm），美國(guó)康寧生物科技公司，批號(hào)3422；PVDF膜，德國(guó)Amersham，批號(hào)10600023；β-actin，美國(guó)Abclonal公司，批號(hào)AC026；可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白（sTM）抗體，美國(guó)Abclonal公司，批號(hào)A1235；血管性假性血友病因子（vWF）抗體，美國(guó)Abclonal公司，批號(hào)A12357；10%PAGE凝膠快速制備試劑盒，上海雅酶生物科技公司，批號(hào)PG112；蛋白預(yù)染Marker，上海雅酶生物科技公司，批號(hào)WJ103；蛋白上樣緩沖液，上海雅酶生物科技公司，批號(hào)LT101S。1384型超凈工作臺(tái)，美國(guó)Thermo公司；-20 ℃低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司；311型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；EVOS M5000熒光顯微鏡，美國(guó)Thermo公司；ST16型高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；Synergy HTX型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；Universal Hood Ⅱ型核酸蛋白凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

抽取入選患者及健康志愿者空腹肘正中靜脈血10 mL，以8∶1比例加入Optiprep淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，每次1 000 r/min離心5 min，用M199完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、10 μg/L血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）重懸，以5×105個(gè)/mL密度接種于12孔板，每隔2 d換液1次。

培養(yǎng)7 d后，用PBS清洗未貼壁及死亡的細(xì)胞2次，避光條件下加入含10 mg/L Dil-ac-LDL的M199培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育3 h，4%多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗，避光條件下加入2.4 mg/L FITC-UEA-1，放入培養(yǎng)箱孵育3 h。封片，熒光顯微鏡下觀察，鑒定EPCs。

2.2 含藥血清制備

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為空白組和含藥血清組，每組5只。參照Meeh-Rubner公式[6]，根據(jù)體質(zhì)量與體表面積換算方法折算等效劑量，含藥血清組每日予10倍等效劑量（15.75 g/kg）活血通絡(luò)湯灌胃，空白組予等體積生理鹽水灌胃，12 h灌胃1次，連續(xù)7 d。末次灌胃后2 h，5%水合氯醛麻醉大鼠，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，分離血清，同組血清合并，56 ℃水浴30 min滅活，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分組及干預(yù)

設(shè)置正常組、模型組、空白血清組（10%空白血清）和活血通絡(luò)湯低（5%含藥血清）、中（10%含藥血清）、高（20%含藥血清）劑量組，每組3個(gè)復(fù)孔。將鑒定成功的EPCs以2.5×105個(gè)/mL密度接種至24孔板，正常組接種健康志愿者EPCs，其余各組接種AAV患者EPCs，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，次日取出培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)基，分別加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，正常組和模型組加入M199完全培養(yǎng)基。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

干預(yù)48 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，每孔加入MTT溶液100 μL和培養(yǎng)基900 μL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，棄上清液，加入適量二甲基亞砜，水平振蕩10 min后，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm檢測(cè)各孔吸光度（OD值）。

2.4.2 遷移能力檢測(cè)

按“2.3”項(xiàng)下分組干預(yù)，吸取細(xì)胞懸液200 μL，加入24孔板的Transwell小室上室，下室加入對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，用棉簽蘸取PBS去除上室殘留細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，行吉姆薩染色，室溫避光孵育1 h，去除染色液，PBS洗滌3次，顯微鏡下（×200）觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移至下室的細(xì)胞。

2.4.3 黏附能力檢測(cè)

按“2.3”項(xiàng)下分組干預(yù)，吸取細(xì)胞懸液200 μL接種至預(yù)先包被明膠的24孔培養(yǎng)板，每孔加入300 μL培養(yǎng)基（正常組和模型組加入M199完全培養(yǎng)基，其余各組加入含相應(yīng)血清的培養(yǎng)基），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄去上清液和非貼壁細(xì)胞，加入PBS，倒置顯微鏡下（×200）隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞貼壁情況。

2.4.4 Western blot檢測(cè)

干預(yù)48 h后收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液充分裂解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，根據(jù)BCA蛋白濃度定量試劑盒操作說明測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣品上樣量20 μg。SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，血清封閉1 h，滴加vWF、sTM一抗（1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌3次；滴加二抗（1∶2 000），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色，成像儀曝光檢測(cè)。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

分離的EPCs呈較小的圓形，懸浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞接種后開始沉降貼壁，隨著細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，體積逐漸增大。EPCs呈橢圓形、長(zhǎng)梭形、紡錘形等多種形態(tài)，光鏡下可見線性樣（見圖1A）、團(tuán)簇樣（見圖1B）、網(wǎng)格樣（見圖1C）生長(zhǎng)。第10日左右達(dá)到增殖高峰，然后開始逐漸老化、死亡，第28日左右基本完全死亡。健康志愿者和患者EPCs形態(tài)無明顯差異。

圖1 EPCs形態(tài)（×400）

通過免疫熒光雙染進(jìn)行鑒定，熒光顯微鏡下觀察，Dil-ac-LDL（紅色）和FITC-UEA-1（綠色）雙染陽性細(xì)胞可鑒定為EPCs。見圖2。

圖2 EPCs鑒定（免疫熒光染色，×200）

4.2 活血通絡(luò)湯對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力的影響

與正常組比較，模型組EPCs增殖能力顯著降低（P<0.01）；與模型組及空白血清組比較，活血通絡(luò)湯各劑量組EPCs增殖能力顯著升高（P<0.05，P<0.01）。活血通絡(luò)湯促進(jìn)EPCs增殖能力隨劑量增加而升高（P<0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組EPCs增殖能力比較（±s）

表1 各組EPCs增殖能力比較（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與空白血清組比較，▽▽P<0.01；與活血通絡(luò)湯低劑量組比較，▲▲P<0.01；與活血通絡(luò)湯中劑量組比較，▼▼P<0.01

組別正常組模型組空白血清組活血通絡(luò)湯低劑量組活血通絡(luò)湯中劑量組活血通絡(luò)湯高劑量組n3 3 3 3 3 3 OD值0.91±0.08 0.53±0.10**0.50±0.06**0.66±0.05**△▽▽0.79±0.16**△△▽▽▲▲0.96±0.08*△△▽▽▲▲▼▼

4.3 活血通絡(luò)湯對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移能力的影響

與正常組比較，模型組EPCs遷移能力顯著降低（P<0.01）；與模型組及空白血清組比較，活血通絡(luò)湯各劑量組EPCs遷移能力顯著升高（P<0.01），以活血通絡(luò)湯高劑量組促進(jìn)EPCs遷移能力最顯著（P<0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組EPCs遷移能力比較（±s，個(gè)/200倍視野）

表2 各組EPCs遷移能力比較（±s，個(gè)/200倍視野）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與空白血清組比較，▽▽P<0.01；與活血通絡(luò)湯低劑量組比較，▲▲P<0.01；與活血通絡(luò)湯中劑量組比較，▼▼P<0.01

組別正常組模型組空白血清組活血通絡(luò)湯低劑量組活血通絡(luò)湯中劑量組活血通絡(luò)湯高劑量組n3 3 3 3 3 3遷移細(xì)胞數(shù)138.37±9.79 74.17±5.50**75.17±5.76**105.50±8.80**△△▽▽118.03±10.56**△△▽▽▲▲148.70±6.47*△△▽▽▲▲▼▼

4.4 活血通絡(luò)湯對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附能力的影響

與正常組比較，模型組EPCs黏附能力顯著降低（P<0.01）；與模型組及空白血清組比較，活血通絡(luò)湯各劑量組EPCs黏附能力顯著升高（P<0.05，P<0.01）。活血通絡(luò)湯促進(jìn)EPCs黏附能力隨劑量增加而升高（P<0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組EPCs黏附能力比較（±s，個(gè)/200倍視野）

表3 各組EPCs黏附能力比較（±s，個(gè)/200倍視野）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與空白血清組比較，▽▽P<0.01；與活血通絡(luò)湯低劑量組比較，▲▲P<0.01；與活血通絡(luò)湯中劑量組比較，▼▼P<0.01

組別正常組模型組空白血清組活血通絡(luò)湯低劑量組活血通絡(luò)湯中劑量組活血通絡(luò)湯高劑量組n3 3 3 3 3 3黏附細(xì)胞數(shù)308.67±32.06 176.23±33.76**181.06±19.01**215.80±25.46**△▽▽265.77±18.52**△△▽▽▲▲326.07±27.71*△△▽▽▲▲▼▼

4.5 活血通絡(luò)湯對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管性假性血友病因子、可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組EPCs vWF、sTM蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組及空白血清組比較，活血通絡(luò)湯各劑量組EPCs vWF、sTM蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01）；與活血通絡(luò)湯低劑量組比較，活血通絡(luò)湯中、高劑量組EPCs vWF、sTM蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.01，P<0.05）；與活血通絡(luò)湯中劑量組比較，活血通絡(luò)湯高劑量組EPCs vWF、sTM蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見圖3、表4。

圖3 各組EPCs vWF和sTM蛋白免疫印跡

表4 各組EPCs vWF和sTM蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組EPCs vWF和sTM蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與空白血清組比較，▽P<0.05，▽▽P<0.01；與活血通絡(luò)湯低劑量組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與活血通絡(luò)湯中劑量組比較，▼P<0.05，▼▼P<0.01

組別n vWF sTM正常組模型組空白血清組活血通絡(luò)湯低劑量組活血通絡(luò)湯中劑量組活血通絡(luò)湯高劑量組3 3 3 3 3 3 0.46±0.03 0.74±0.02**0.71±0.16**0.65±0.01**△△▽▽0.57±0.04**△△▽▽▲▲0.51±0.21*△△▽▽▲▲▼▼0.36±0.14 0.68±0.04**0.66±0.06**0.58±0.07**△▽0.48±0.03**△△▽▽▲0.41±0.26*△△▽▽▲▲▼

5 討論

EPCs是一種骨髓源性細(xì)胞，又稱血管母細(xì)胞，在一定條件下可遷移到外周循環(huán)，能夠分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且分泌多種細(xì)胞因子和血管生長(zhǎng)因子，參與血管穩(wěn)定、新血管形成及內(nèi)膜損傷修復(fù)[6]。研究表明，很多慢性炎癥和自身免疫性疾病中EPCs數(shù)量和功能發(fā)生改變[7-8]。血管內(nèi)皮損傷是AAV的主要特征，血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管炎的靶器官，參與血管炎的病情進(jìn)展[9]。即使在AAV緩解狀態(tài)，凝血和免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活及低度炎癥狀態(tài)也會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的血管內(nèi)皮損傷，這可能是導(dǎo)致AAV復(fù)發(fā)的根本原因[10]。循環(huán)EPCs可以提供內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制降低AAV的內(nèi)皮損傷，與健康人相比，AAV患者循環(huán)EPC數(shù)量減少、活性降低[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，AAV患者EPCs增殖、遷移、黏附能力明顯低于健康志愿者。

sTM是公認(rèn)的內(nèi)皮損傷標(biāo)志物，在維持血液流動(dòng)和防止血管內(nèi)凝血方面發(fā)揮重要作用。在AAV患者中，sTM水平與血管炎過程中血管內(nèi)皮損傷程度相關(guān)，能反映血管、尤其是小血管和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損程度[12]。vWF是反映細(xì)胞損傷敏感的分子標(biāo)記物，參與血小板黏附、聚集。在AAV患者中，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致vWF大量產(chǎn)生與釋放，加速血小板黏附和聚集，進(jìn)一步促進(jìn)血管炎形成與發(fā)展，導(dǎo)致內(nèi)皮損傷加重[13]。故vWF和sTM可能是AAV進(jìn)展及復(fù)發(fā)的潛在標(biāo)志物。本研究納入緩解期AAV患者（BVAS<15分），與正常組比較，模型組EPCs vWF和sTM蛋白表達(dá)顯著升高，提示即使在AAV緩解期也存在持續(xù)的血管內(nèi)皮損傷或內(nèi)皮損傷修復(fù)機(jī)制受損，并可能導(dǎo)致患者病情反復(fù)。

糖皮質(zhì)激素、免疫抑制及生物制劑等治療可緩解AAV，顯著降低病死率。在緩解后需長(zhǎng)期免疫抑制劑維持治療，但即使維持性免疫抑制，仍有超過50%患者在5年內(nèi)病情復(fù)發(fā)[14]。目前在緩解維持期缺乏更安全有效的治療方案。

AAV病理基礎(chǔ)為自身免疫異常導(dǎo)致的小血管炎，且反復(fù)發(fā)作，久治不愈，與中醫(yī)學(xué)“久病入絡(luò)”“久病在絡(luò)，氣血皆窒”等絡(luò)病學(xué)說認(rèn)識(shí)一致[15]。奚九一教授總結(jié)免疫性血管炎的基本病理過程為因邪（內(nèi)因與外因致病因子、血管炎變）→致瘀（血管狹窄、纖維組織增生與血液改變、血栓形成、新與舊）→損傷（缺血與瘀血的組織反應(yīng)）[16]。故“瘀阻絡(luò)損”貫穿AAV發(fā)展及演變整個(gè)過程，是其核心病機(jī)，活血通絡(luò)是AAV的基本治法。中藥可調(diào)控EPCs相關(guān)因子及通路，改善心肌缺血損傷[17]，其中活血化瘀中藥可增強(qiáng)EPCs動(dòng)員、增殖、遷移、分化和黏附功能，還能促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)和血管新生[18]。活血通絡(luò)湯由當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、香附、青皮、王不留行、牡丹皮、牛膝組成。方中當(dāng)歸尾甘、辛，性溫，活血祛瘀，為君藥；川芎辛溫香竄，行氣活血，為血中氣藥，赤芍活血化瘀止痛，二藥相伍，既增活血化瘀之功，又借氣行血行之力，使行血破滯之功倍增，共為臣藥；紅花活血祛瘀，香附疏肝理氣止痛，青皮疏肝破氣、消積化滯，王不留行活血通絡(luò)，牡丹皮清熱涼血、活血化瘀，共為佐藥；牛膝逐瘀通絡(luò)、引血下行為使藥。全方共奏活血祛瘀、行氣通絡(luò)之功。本研究結(jié)果顯示，活血通絡(luò)湯可能通過提高EPCs增殖、遷移與黏附能力參與AAV緩解期血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)，其作用機(jī)制與降低血管內(nèi)皮損傷因子vWF、sTM蛋白表達(dá)有關(guān)。中藥復(fù)方存在多靶點(diǎn)、多途徑的調(diào)節(jié)作用，參與的調(diào)控因子繁多，機(jī)制復(fù)雜，本課題組將進(jìn)一步研究活血通絡(luò)湯治療AAV的其他作用途徑和調(diào)控因子。