電針對小鼠海馬C3/C3aR/STAT3信號通路的影響

陳麗敏 ，郭婉清 ，溫若蘭 ，鄭雪花 ，林嵐 ，王豐 ，董衛(wèi)國

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種以慢性、持續(xù)進(jìn)展性記憶減退及認(rèn)知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD確切發(fā)病機(jī)制迄今尚未闡明。大量研究表明，AD發(fā)病與β淀粉樣蛋白（Aβ）級聯(lián)、Tau蛋白異常磷酸化、神經(jīng)元突觸丟失等因素密切相關(guān)[1]。近年來，補(bǔ)體介導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞突觸吞噬參與AD越來越受到重視[2]。大腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元突觸之間可以通過C3/C3aR/STAT3信號通路進(jìn)行交互，參與AD的發(fā)生發(fā)展，抑制膠質(zhì)細(xì)胞與補(bǔ)體信號間的交互作用可能是治療AD的新策略[3]。本研究觀察電針對快速老化模型小鼠SAMP8海馬突觸功能及C3/C3aR/STAT3信號通路的影響，從補(bǔ)體角度探討電針改善AD突觸功能障礙的可能機(jī)制，為電針治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SAMP8小鼠24只、抗快速老化小鼠SAMR1 12只，6月齡，雄性，體質(zhì)量（35±5）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，12 h明暗交替，自由攝食飲水，動物使用許可證號SYXK（閩）2019-0002。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（2020033），實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格依據(jù)國家動物保護(hù)法和實(shí)驗(yàn)動物倫理要求進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

補(bǔ)體3（C3）抗體（貨號Sc-28294）、補(bǔ)體3a受體（C3aR）抗體（貨號Sc-133172），美國Santa Cruz Biotechnology公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體（貨號3670）、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）抗體（貨號9139）、p-STAT3抗體（貨號9145）、離子鈣結(jié)合銜接分子1（Iba1）抗體（貨號17198），美國CST公司；β-actin抗體（貨號20536-1-AP），美國Proteintech公司；突觸后致密物95（PSD-95）抗體（貨號ab18258）、突觸素（Syn）抗體（貨號ab32127）、C3抗體（貨號ab11862），英國Abcam公司；超敏ECL試劑盒（貨號MAO186-1），上海碧云天生物技術(shù)公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號R123-01）、熒光定量試劑盒（貨號Q311-02），南京Vazyme公司。0.25 mm×15 mm華佗牌無菌針灸針、G6805-Ⅰ電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），CFX 96 Touch實(shí)時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），DM i8倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），Morris水迷宮測試系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），HM 525 NX冰凍切片機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及干預(yù)

將24只SAMP8小鼠隨機(jī)分為模型組12只、電針組12只，另取12只SAMR1小鼠作為對照組。使用自制網(wǎng)兜將電針組小鼠固定，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]取“百會”向前斜刺2 mm、“大椎”向下斜刺2～3 mm、雙側(cè)“腎俞”向脊柱方向斜刺3～4 mm，連接電針儀，正極接“大椎”，負(fù)極接“腎俞”（兩側(cè)隔日交替），連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強(qiáng)度1.5～2 mA，以小鼠后肢及尾部微微顫抖但不嘶叫為度，每日20 min，8 d為1個療程，每個療程間隔2 d，共3個療程。模型組和對照組固定相同時間，不進(jìn)行干預(yù)。

2.2 取材

干預(yù)結(jié)束后，各組隨機(jī)取6只小鼠以0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，脫頸處死，斷頭取腦，分離海馬，置于無RNA酶凍存管中，液氮暫存后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，左側(cè)海馬用于免疫印跡檢測，右側(cè)海馬用于實(shí)時熒光定量PCR。剩余小鼠麻醉后，分別經(jīng)預(yù)冷生理鹽水和4%多聚甲醛灌注，快速斷頭取腦，將全腦置于4%多聚甲醛中固定24 h，依次投入15%、20%、30%蔗糖溶液，梯度脫水至組織沉底，OCT包埋組織，連續(xù)冠狀面切片（15 μm），-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

電針干預(yù)結(jié)束后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包含適應(yīng)性訓(xùn)練、定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前先對小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練2 d。定位巡航實(shí)驗(yàn)為期5 d，將逃生平臺置于第Ⅲ象限，并低于水面1 cm，依次將小鼠從每個象限中點(diǎn)貼壁放入水中，記錄小鼠90 s內(nèi)找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。若小鼠在90 s內(nèi)未找到平臺，則該小鼠的逃避潛伏期計為90 s，并引導(dǎo)小鼠至平臺上學(xué)習(xí)15 s。第8日進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去逃生平臺，將小鼠從第Ⅰ象限放入水中，記錄小鼠90 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)及在原平臺象限（第Ⅲ象限）停留的時間。

2.3.2 免疫熒光染色

取腦組織切片，室溫復(fù)溫30 min，PBS沖洗5 min×3次，組化筆在組織周圍畫圈，滴加1%Triton X-100 25 μL破膜1 h，PBS沖洗5 min×3次，5%BSA 37 ℃封閉1 h，滴加一抗混合液（GFAP 1∶300、C3 1∶100、Iba1 1∶200、C3aR 1∶200），4 ℃搖床過夜。次日復(fù)溫，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，室溫避光孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次，避光滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑，封片。熒光顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)GFAP與C3共定位、Iba1與C3aR共定位情況，對共定位陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.3.3 免疫印跡法檢測

取海馬組織，稱重，加入裂解液（組織∶裂解液∶PMSF=10 μg∶100 μL∶1 μL），放入勻漿機(jī)中研磨，冰上靜置30 min，4 ℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白上樣，電泳（20 V、10 min，80 V、40 min，120 V、50 min），4 ℃、300 mA轉(zhuǎn)膜，5%封閉液室溫封閉2 h，置一抗（β-actin 1∶1 000、Syn 1∶3 000、PSD-95 1∶3 000、C3 1∶1 000、C3aR 1∶1 000、STAT3 1∶1 000、p-STAT3 1∶1 000）中，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗10 min×3次，加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗10 min×3次。滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，Image Lab軟件分析各條帶灰度值。以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值計算蛋白相對表達(dá)量。

2.3.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測

取海馬組織，加入Trizol 1 mL，勻漿機(jī)研磨1 min，冰上靜置10 min。加入氯仿200 μL，劇烈震蕩15 s，冰上靜置10 min，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，吸取上層水相至新的EP管中，加入等體積異丙醇，上下震蕩混勻，冰上靜置10 min，離心15 min。棄上清液，加入75%乙醇1 mL洗滌RNA，冰上靜置3 min，離心5 min，棄上清液，室溫風(fēng)干，加入DEPC水30 μL，吹打至RNA充分溶解，測定RNA濃度。配制反轉(zhuǎn)錄體系，42 ℃反應(yīng)2 min，加入5× Hiscript Ⅱ qRT Super MixⅡ，50 ℃、15 min，85 ℃、2 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。配制PCR反應(yīng)液，95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)；95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，繪制熔解曲線。2-??Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，水迷宮定位巡航實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用重復(fù)測量方差分析，進(jìn)行球形檢驗(yàn)，P<0.05用Greenhouse-Geisser進(jìn)行校正并分析各效應(yīng)的主效應(yīng)，P>0.05用重復(fù)測量的單變量方差進(jìn)行分析。其他指標(biāo)符合正態(tài)性采用方差分析，方差齊用LSD法進(jìn)行兩兩比較，方差不齊用Games Howell檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 電針對模型小鼠行為學(xué)的影響

與對照組比較，模型組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期明顯延長，穿越原平臺次數(shù)及原平臺象限停留時間明顯減少（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期明顯縮短，穿越原平臺次數(shù)及原平臺象限停留時間明顯增加（P<0.01，P<0.05）。結(jié)果見表2、表3。

表2 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（±s，s）

表2 各組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（±s，s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別對照組模型組電針組只數(shù)6 6 6 1 d 33.63±29.03 82.01± 5.27**58.61±11.76#2 d 20.23± 7.98 69.51±20.01**49.49± 7.66#3 d 15.87±15.01 62.97±10.04**38.79±13.47##4 d 11.81± 3.43 56.34±17.41**34.96±10.35##5 d 6.98± 4.78 48.83±19.08**23.16± 6.60##

表3 各組小鼠穿越原平臺次數(shù)及原平臺象限停留時間比較（±s）

表3 各組小鼠穿越原平臺次數(shù)及原平臺象限停留時間比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別對照組模型組電針組只數(shù)6 6 6穿越原平臺次數(shù)8.17±2.86 1.67±0.82**4.00±1.26#停留時間/s 46.44± 8.60 16.80± 7.81**30.12±14.21#

4.2 電針對模型小鼠海馬CA1區(qū)GFAP與C3、Iba1與C3aR共定位的影響

與對照組比較，模型組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP與C3、Iba1與C3aR共定位陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP與C3、Iba1與C3aR共定位陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.01）。見圖1、圖2、表4。

圖1 各組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP與C3共定位情況（免疫熒光染色，標(biāo)尺=50 μm）

圖2 各組小鼠海馬CA1區(qū)Iba1與C3aR共定位情況（免疫熒光染色，標(biāo)尺=50 μm）

表4 各組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP-C3、Iba1-C3aR共定位陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s，個）

表4 各組小鼠海馬CA1區(qū)GFAP-C3、Iba1-C3aR共定位陽性細(xì)胞數(shù)比較（±s，個）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別對照組模型組電針組只數(shù)6 6 6 GFAP-C3 2.50±2.43 27.50±3.08**15.17±2.40##Iba1-C3aR 1.83±1.72 55.00±4.47**33.17±5.00##

4.3 電針對模型小鼠海馬組織蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組小鼠海馬組織Syn、PSD-95蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01），C3、C3aR、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠海馬組織Syn、PSD-95蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01），C3、C3aR、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。見圖3、表5。

表5 各組小鼠海馬組織Syn、PSD-95、C3、C3aR、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組小鼠海馬組織Syn、PSD-95、C3、C3aR、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別對照組模型組電針組只數(shù)6 6 6 Syn 1.00±0.04 0.69±0.07**0.85±0.05##PSD-95 1.00±0.08 0.67±0.09**0.83±0.07##C3 1.00±0.42 2.33±0.33**1.80±0.16#C3aR 1.00±0.21 1.59±0.05**1.34±0.10##STAT3 1.00±0.11 1.76±0.18**1.33±0.10##p-STAT3 1.00±0.16 2.17±0.12**1.80±0.24##

圖3 各組小鼠海馬組織Syn、PSD-95、C3、C3aR、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印跡

4.4 電針對模型小鼠海馬組織mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組小鼠海馬組織C3、C3aR、STAT3 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，電針組小鼠海馬組織C3、C3aR、STAT3 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01，P<0.05）。見表6。

表6 各組小鼠海馬組織C3、C3aR、STAT3 mRNA表達(dá)比較（±s）

表6 各組小鼠海馬組織C3、C3aR、STAT3 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別對照組模型組電針組只數(shù)6 6 6 C3 1.00±0.00 3.28±0.58**1.49±0.23##C3aR 1.00±0.00 2.78±0.58**1.41±0.27##STAT3 1.00±0.00 2.06±0.35**1.46±0.25#

5 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆病”等范疇。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用“益腎調(diào)督”針灸法，選取大椎、百會、腎俞可治療AD[5]。大椎為“三陽督脈之會”，具有溫陽通督、調(diào)神醒腦功效。百會為“三陽五會”，可平補(bǔ)一身之陽氣，又內(nèi)應(yīng)于腦，為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾患要穴。腎俞為腎的背俞穴，《經(jīng)穴命名淺解》記載“穴近腎臟，為腎藏經(jīng)氣轉(zhuǎn)輸之處，主治腎臟疾患”，腎精輸注于此，又可通過足太陽膀胱經(jīng)上輸于腦，充養(yǎng)腦髓。諸穴合用，可振奮陽氣，疏通督脈經(jīng)氣，益腎填精，聰腦益智。作為針灸療法的重要組成部分，電針在AD的治療中已取得一定療效，可能與電針改善AD大腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡等有關(guān)[6]。電針頻率是影響電針療效的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，低頻電針刺激所產(chǎn)生的效應(yīng)更接近人體生物電刺激，能更好地調(diào)節(jié)并促進(jìn)腦神經(jīng)功能恢復(fù)[7]。多項(xiàng)研究表明，2 Hz電針可有效改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，治療AD[8-10]?；谝陨衔墨I(xiàn)和本課題組前期研究[11-13]，并考慮到實(shí)驗(yàn)動物的耐受性，本實(shí)驗(yàn)選擇電針頻率2 Hz。

SAMP8小鼠可模擬遲發(fā)性AD的疾病過程[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，6月齡起，SAMP8小鼠腦內(nèi)便可見明顯Aβ肽沉積、高度磷酸化Tau蛋白[16-19]，其增長數(shù)量與年齡成正比。此外，SAMP8小鼠還存在神經(jīng)元丟失[20]、膠質(zhì)細(xì)胞增生[21]等病理變化，是目前較常用的AD動物模型。SAMR1與SAMP8有相似的遺傳背景，被廣泛用于實(shí)驗(yàn)的空白對照。本實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時間推移，模型組小鼠逃避潛伏期仍長于對照組，原平臺象限停留時間及穿越原平臺次數(shù)明顯少于對照組，說明SAMP8小鼠已表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力障礙。經(jīng)電針治療后，電針組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯改善。

課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，電針可抑制補(bǔ)體1q（C1q）及小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba1表達(dá)[11]，改善突觸功能[12-13]。因此，本研究進(jìn)一步觀察電針對補(bǔ)體介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞突觸吞噬的影響。研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌C1q下游成分C3，C3經(jīng)C3裂解酶裂解成C3a和C3b[3，22]，C3a可與小膠質(zhì)細(xì)胞上的C3aR特異性結(jié)合，吞噬突觸，還可激活小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的STAT3[23]。C3/C3aR/STAT3信號通路參與調(diào)控AD中Tau蛋白磷酸化，抑制該信號通路能減輕AD中Tau蛋白磷酸化，減少突觸丟失[3，24]。以上說明星形膠質(zhì)細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元突觸之間可發(fā)生交互作用。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞特有的中間絲蛋白，參與維持細(xì)胞骨架，可由激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌并作為反映星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要標(biāo)記物[25]。Iba1是小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，電針可減少SAMP8小鼠海馬CA1區(qū)GFAP與C3共定位、Iba1與C3aR共定位陽性細(xì)胞數(shù)，降低C3、C3aR、STAT3蛋白表達(dá)及mRNA水平，提示電針能夠抑制SAMP8小鼠海馬CA1區(qū)C3/C3aR/STAT3信號通路。

AD是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能障礙是由突觸功能受損或丟失造成[26]，在與認(rèn)知功能相關(guān)的海馬區(qū)尤為明顯。突觸是神經(jīng)元傳遞信息的特定結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶、進(jìn)行其他神經(jīng)活動的關(guān)鍵部位。突觸上存在多種突觸蛋白，如Syn、PSD-95等，這些蛋白共同參與維持突觸功能。Syn是突觸前成分中具有調(diào)節(jié)突觸小泡功能的蛋白，可參與囊泡運(yùn)輸及分泌等，是反映突觸功能的指標(biāo)之一[27]。PSD-95位于突觸后膜，主要起結(jié)構(gòu)支架作用，可與相關(guān)受體蛋白及信號結(jié)合，調(diào)控突觸連接的產(chǎn)生并對突觸的維護(hù)有重要作用[28]。本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，電針組小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白Syn、PSD-95表達(dá)明顯升高，提示電針可改善突觸功能，與既往研究結(jié)果[12-13，29]一致。

綜上，電針“大椎”“百會”“腎俞”可改善突觸功能，提高AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與抑制海馬C3/C3aR/STAT3信號通路有關(guān)。