黃芪對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠的影響及機(jī)制研究

劉漢瀅 ，季青璇 ，彭美中 ，馬盼 ，牛藝婷 ，徐藝宸 ，韓靜

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿病引起的微血管并發(fā)癥[1]，是成年人失明最常見(jiàn)的原因[2]。在我國(guó)，隨著糖尿病患病人數(shù)增加，DR的致盲率日益升高[3]。目前，DR的治療方法有控制血糖、激光光凝手術(shù)、注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物等。但目前的治療方法存在弊端，如經(jīng)視網(wǎng)膜光凝手術(shù)治療后，患者出現(xiàn)視網(wǎng)膜受損性裂孔、虹膜受損、出血等不良反應(yīng)[4]；使用抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子藥物治療后，部分患者出現(xiàn)牽引性視網(wǎng)膜脫離、眼壓升高、黃斑孔形成及葡萄膜炎等不良反應(yīng)[5]。因此，亟需尋找能夠有效治療DR的新方法。

黃芪味甘，性微溫，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、斂瘡生肌等作用[6]。藥理研究表明，黃芪可降低糖尿病大鼠血糖[7]。臨床研究表明，黃芪注射液能提高DR患者視力，減少眼底出血，改善血液流變學(xué)指標(biāo)[8]。此外，黃芪有效部位黃芪多糖能減少視網(wǎng)膜血管中白細(xì)胞黏附，降低DR大鼠視網(wǎng)膜腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等蛋白表達(dá)[9]。黃芪主要成分黃芪甲苷可顯著抑制db/db小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[10]。雖然提示黃芪具有治療DR的潛力，但藥理機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠糖尿病模型，觀察黃芪對(duì)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜病變的作用，并探討其潛在機(jī)制，為黃芪治療DR的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠18只，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（京）2019-0030。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度22～27 ℃，濕度45%～55%，自然光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（BUCM-4-2020102005-4193）。

1.2 藥物及制備

黃芪，購(gòu)于南京同仁堂有限公司，批號(hào)6971133498764。稱取黃芪飲片50 g，加10倍量去離子水，煎煮2次，每次2 h，合并濾液，減壓濃縮至5 g/mL，于4 ℃保存。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ），德國(guó)Sigma，貨號(hào)S0130；檸檬酸鈉緩沖液，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)KGHC001；封閉用羊血清，北京中杉金橋，貨號(hào)ZLI-9056；小鼠內(nèi)皮糖蛋白（Endoglin/CD105）抗體，英國(guó)Abcam，貨號(hào)ab156756；基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）抗體，英國(guó)Abcam，貨號(hào)ab79781；糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）抗體，美國(guó)CST，貨號(hào)D5C5Z；含DAPI熒光封片劑，北京中杉金橋，貨號(hào)ZF-0311；山羊抗小鼠IgG，英國(guó)Abcam，貨號(hào)ab97018；羊抗兔IgG-Alexa Fluor 647，北京百瑞極生物，貨號(hào)BN20636；Triton X-100，北京百瑞極生物，貨號(hào)9002-93-1。光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica，型號(hào)DM2500），激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica，型號(hào)TCS SP8），視網(wǎng)膜顯微成像系統(tǒng)（美國(guó)Phoenix Research Labs，型號(hào)Micron Ⅲ）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及給藥

小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和黃芪組，每組6只。除正常組外，其余各組參照文獻(xiàn)[11]方法制備DR小鼠模型。小鼠禁食12 h，模型組和黃芪組連續(xù)5 d腹腔注射鏈脲佐菌素溶液60 mg/kg（pH=4.4檸檬酸鈉緩沖液配制），正常組注射等體積檸檬酸鈉緩沖液。4周后小鼠尾靜脈采血測(cè)定空腹6 h血糖，剔除血糖<16.7 mmol/L小鼠。按60 kg成人臨床劑量與小鼠體表面積換算給藥劑量，黃芪組予黃芪水提物80 mg/kg灌胃[12-13]，正常組和模型組予等體積羧甲基纖維素鈉灌胃，連續(xù)6周。

2.2 體質(zhì)量與空腹血糖測(cè)定

每周稱量小鼠體質(zhì)量，每2周檢測(cè)小鼠空腹血糖。

2.3 光學(xué)相干斷層掃描檢測(cè)視網(wǎng)膜厚度

小鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉麻醉，滴加復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，卡波姆眼膏潤(rùn)滑角膜，將小鼠眼球緊貼于實(shí)驗(yàn)儀器鏡面進(jìn)行觀察并拍照。采用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，統(tǒng)一標(biāo)尺長(zhǎng)度以測(cè)量視網(wǎng)膜厚度，以中央凹為起點(diǎn)，在左右各150、300 μm處測(cè)量視網(wǎng)膜全層厚度。

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.4.1 黃芪有效成分及靶點(diǎn)篩選

在 TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)以“黃芪”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取黃芪有效成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選。通過(guò)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息，將篩選的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/up-loadlists/），限定物種為“人類”，將靶點(diǎn)蛋白、基因信息標(biāo)準(zhǔn)化。

2.4.2 糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“diabetic retinopathy”為關(guān)鍵詞在OMIM（https://www.omim.org/）、GAD（https://www.g6gsoftwaredirectory.com/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，獲得DR相關(guān)靶點(diǎn)。

2.4.3 黃芪治療糖尿病視網(wǎng)膜病變靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將黃芪有效成分靶點(diǎn)與DR相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）得到交集靶點(diǎn)，即黃芪治療DR的潛在靶點(diǎn)。

2.4.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://cn.stringdb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“人類”，剔除孤立靶點(diǎn)，以TSV格式將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，得到蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行蛋白間相互作用分析。

2.4.5 黃芪治療糖尿病視網(wǎng)膜病變靶點(diǎn)生物功能注釋

將黃芪治療DR靶點(diǎn)上傳至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/list.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，將閾值P<0.01設(shè)定為篩選條件。

2.5 免疫熒光染色

干預(yù)結(jié)束后，取視網(wǎng)膜，制作視網(wǎng)膜組織切片，依次加入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ浸泡20 min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%）脫水5 min，流水沖洗10 min，甘氨酸溶液孵育10 min，PBS沖洗3次，羊血清封閉30 min，分別滴加CD105一抗（1∶50）、MMP2一抗（1∶200）、GSK-3β一抗（1∶250），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗（1∶400），37 ℃避光孵育60 min，加入適量含DAPI熒光封片劑，避光復(fù)染5 min，蓋玻片封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J軟件分析蛋白平均光密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，符合正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析，方差齊組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊用T2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 黃芪對(duì)模型小鼠體質(zhì)量及空腹血糖的影響

與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯減少（P<0.05），空腹血糖明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪組小鼠體質(zhì)量明顯增加（P<0.05），空腹血糖水平無(wú)明顯變化（P>0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和空腹血糖比較（±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量和空腹血糖比較（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常組模型組黃芪組只數(shù)6 6 6體質(zhì)量/g 32.25±1.47 20.34±1.15*22.34±1.51#空腹血糖/（mmol/L）8.57±0.73 25.83±2.86*23.17±9.95

4.2 黃芪對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜厚度的影響

光學(xué)相干斷層掃描前麻醉過(guò)程中，黃芪組小鼠死亡2只。對(duì)視網(wǎng)膜厚度測(cè)量后發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠距中央凹150、300 μm處視網(wǎng)膜厚度明顯減少（P<0.05）；與模型組比較，黃芪組小鼠距中央凹150、300 μm處視網(wǎng)膜厚度明顯增加（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1、表2。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜光學(xué)相干斷層掃描圖像

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜厚度比較（±s，μm）

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜厚度比較（±s，μm）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

距中央凹300 μm厚度組別 只數(shù) 距中央凹150 μm厚度163.00±4.46 153.52±7.63*158.12±7.53#正常組模型組黃芪組6 6 4 160.67±3.89 151.79±6.81*156.12±7.05#

4.3 黃芪對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜組織CD105蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織CD105蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪組小鼠視網(wǎng)膜組織CD105蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜組織CD105蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜組織CD105蛋白表達(dá)比較（±s，%）

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜組織CD105蛋白表達(dá)比較（±s，%）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常組模型組黃芪組只數(shù)6 6 4平均光密度0.033±0.001 0.039±0.002*0.035±0.001#

4.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

4.4.1 黃芪有效成分及靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18篩選，得到黃芪有效成分6個(gè)，見(jiàn)表4。通過(guò)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)檢索6個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后，得到127個(gè)靶點(diǎn)。

表4 黃芪有效成分信息（OB≥30%、DL≥0.18）

4.4.2 糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)

在OMIM、GAD、TTD 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索DR相關(guān)靶點(diǎn)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后，共獲得650個(gè)靶點(diǎn)。采用Venny 2.1將有效成分靶點(diǎn)與DR相關(guān)靶點(diǎn)取交集，共獲得58個(gè)交集靶點(diǎn)，韋恩圖見(jiàn)圖3。

圖3 黃芪治療DR相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

4.4.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)

將58個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖4）。該網(wǎng)絡(luò)由58個(gè)節(jié)點(diǎn)、30條邊構(gòu)成，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)10.6。節(jié)點(diǎn)數(shù)靠前的靶點(diǎn)包括MMP2、GSK3B、EGFR、IL2、PPARG等。

圖4 黃芪治療DR靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

4.4.4 GO功能和KEGG通路富集分析

將58個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析，以P<0.01為篩選條件，選取前20條基因信息繪制條圖（見(jiàn)圖5）。對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得81條通路富集結(jié)果。根據(jù)P值由小到大選取前20條通路繪制氣泡圖（見(jiàn)圖6）。

圖5 黃芪治療DR靶點(diǎn)GO富集分析

圖6 黃芪治療DR靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

4.5 黃芪對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜組織基質(zhì)金屬蛋白酶2、糖原合成酶激酶-3β蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織MMP2、GSK-3β蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪組小鼠視網(wǎng)膜組織MMP2、GSK-3β蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8、表5。

圖7 各組小鼠視網(wǎng)膜組織MMP2蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

圖8 各組小鼠視網(wǎng)膜組織GSK-3β蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

表5 各組小鼠視網(wǎng)膜組織MMP2、GSK-3β蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組小鼠視網(wǎng)膜組織MMP2、GSK-3β蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別正常組模型組黃芪組只數(shù)6 6 4 MMP2 0.037 5±0.004 0.049 5±0.003*0.038 0±0.001#GSK-3β 0.037 5±0.004 0.045 1±0.002*0.037 7±0.001#

5 討論

DR屬中醫(yī)學(xué)“消渴目病”范疇[14]。劉完素指出，消渴可“變?yōu)槿改炕騼?nèi)障”（《宣明論方·消渴總論》），《證治要訣》有“三清久之，精血既虧，或目無(wú)視”。其基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，以氣陰兩虛為本，瘀血阻絡(luò)為標(biāo)，臨床上多用益氣養(yǎng)陰、活血化瘀法治療，效果顯著[15-16]。黃芪是臨床常用補(bǔ)氣藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、生津養(yǎng)血等功效，對(duì)糖尿病及DR有一定作用。

CD105是細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，在增殖的內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)[17]。有研究表明，CD105可參與血管發(fā)育，是新生血管形成的主要標(biāo)志物[18]。新血管生成是DR的臨床特征之一，在DR的各階段，患者血漿CD105水平均明顯升高[19]。通過(guò)玻璃體注射DL-α-氨基己二酸建立視網(wǎng)膜新生血管疾病模型發(fā)現(xiàn)，模型組視網(wǎng)膜CD105表達(dá)較正常組明顯升高[20]。本研究采用免疫熒光染色檢測(cè)DR小鼠視網(wǎng)膜組織CD105表達(dá)，結(jié)果表明，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織CD105蛋白表達(dá)較正常組明顯升高，黃芪組小鼠視網(wǎng)膜組織CD105蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，說(shuō)明黃芪能抑制新血管生成。

DR早期特征為血-視網(wǎng)膜屏障破壞，這與內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)破壞密切相關(guān)。MMP2是MMPs家族的一員[21]，由內(nèi)皮細(xì)胞分泌[22]，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原以平衡基質(zhì)合成與降解，進(jìn)而在維持細(xì)胞完整性和細(xì)胞存活之間發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。研究表明，抑制MMP2過(guò)表達(dá)可抑制視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[24]。在DR晚期階段，MMP2能促進(jìn)新生血管生成[25]，與非糖尿病組比較，患病12周的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜MMP2 mRNA水平顯著升高[26]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，黃芪多個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)MMP2，采用免疫熒光染色進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果表明，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織MMP2表達(dá)較正常組明顯升高，黃芪組小鼠視網(wǎng)膜組織MMP2表達(dá)較模型組明顯降低，說(shuō)明黃芪可能通過(guò)抑制MMP2表達(dá)抑制新血管生成。

DR發(fā)病機(jī)制與炎癥密切相關(guān)，GSK-3β被認(rèn)為是治療炎癥相關(guān)疾病的潛在靶點(diǎn)[27]。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[28]，其能夠調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和細(xì)胞周期，進(jìn)一步導(dǎo)致DR內(nèi)皮功能障礙及血-視網(wǎng)膜屏障破壞[29]。在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，模型組視網(wǎng)膜組織GSK-3β表達(dá)顯著升高[30]。本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，黃芪可調(diào)控GSK-3β，并且免疫熒光結(jié)果表明，黃芪能下調(diào)DR模型小鼠視網(wǎng)膜組織GSK-3β表達(dá)，提示黃芪可能通過(guò)GSK-3β改善小鼠DR。

綜上所述，黃芪對(duì)DR有明顯改善作用，其機(jī)制可能與下調(diào)CD105、MMP2、GSK-3β表達(dá)，進(jìn)而抑制新血管生成有關(guān)。本研究初步探討了黃芪防治DR的作用機(jī)制，可為臨床應(yīng)用黃芪治療DR提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但未考察不同劑量黃芪的作用效果，今后研究將進(jìn)一步明確其量效關(guān)系。