基于生物信息學(xué)及實驗驗證探討腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡機制及安腦平?jīng)_方干預(yù)作用

張瑛 ，張宇星 ，郭純 ，周德生

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

腦出血是非創(chuàng)傷性腦血管破裂，致腦實質(zhì)內(nèi)血液聚集，出現(xiàn)頭痛、嘔吐、不同程度意識障礙等局灶神經(jīng)功能缺損癥狀的急性腦血管疾病[1]，約占全部腦卒中的18.8%～47.6%，具有高病死率、高致殘率的特點[2]。

鐵死亡是一種在Fe2+參與下，細(xì)胞先后出現(xiàn)鐵沉積、水腫、破裂現(xiàn)象，以細(xì)胞內(nèi)線粒體體積縮小、嵴減少、內(nèi)膜密度增大、外膜破裂為特征的死亡方式[3]。腦出血后神經(jīng)元鐵死亡調(diào)控機制可能與鐵代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸/谷胱甘肽代謝異常有關(guān)[4]。外源性Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）結(jié)合形成Tf-Fe3+復(fù)合物，此復(fù)合物與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）結(jié)合后被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)，在酶的作用下Fe3+被還原為Fe2+，形成不穩(wěn)定鐵池，F(xiàn)e2+作為輔助因子，能增強脂氧合酶活性，激發(fā)芬頓反應(yīng)，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，致細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸破裂，進(jìn)而腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞裂解死亡[5]，代謝相關(guān)性鐵死亡是腦出血發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵機制。

安腦平?jīng)_方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療出血性腦卒中的協(xié)定方，基礎(chǔ)研究及臨床觀察顯示其用于腦出血效果良好[6-10]。前期研究表明，安腦平?jīng)_方能下調(diào)Tf和TfR表達(dá)，減少鐵離子向神經(jīng)元轉(zhuǎn)移，改善腦出血后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11]?；诖耍狙芯繌纳镄畔W(xué)、體內(nèi)實驗驗證角度，探討安腦平?jīng)_方在腦出血后代謝相關(guān)性鐵死亡中的分子機制，為新藥開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)，為中醫(yī)藥防治腦出血提供參考。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.1.1 代謝相關(guān)鐵死亡基因集獲取

通過Reactome（https://reactome.org）數(shù)據(jù)庫[12]，進(jìn)入“Pathway Browser”條目，下載“Metabolism”通路基因集，作為代謝相關(guān)基因集（MRGs）。通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫[13]，以“Ferroptosis”為檢索詞，同時從FerrDb（http://www.zhounan.org/ferrdb）數(shù)據(jù)庫[14]下載鐵死亡相關(guān)基因，整合2個數(shù)據(jù)庫基因，獲得鐵死亡相關(guān)基因（FRGs）。

1.1.2 腦出血差異基因獲取

通過 GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫，以“Intracerebral Hemorrhage”為檢索詞，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，條目類型為“Series”，且每組樣本量≥3例，下載腦出血芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)（GSE24265、GPL570）。GSE24265共有11個樣本，包括出血側(cè)血腫周圍組織及對側(cè)灰質(zhì)白質(zhì)組織，將出血側(cè)血腫周圍組織樣本設(shè)為模型組（GSM596842、GSM596845、GSM596848、GSM596850），對側(cè)灰質(zhì)白質(zhì)組織為對照組（GSM596843、GSM596844、GSM596846、GSM596847、GSM596849、GSM596851、GSM596852），采用R語言limma包對2組進(jìn)行差異分析，以|log2(FC)|>1且Padj<0.05為篩選條件，獲取腦出血差異基因（DEGs）。

利用在線取交集工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），取DEGs、MRGs、FRGs三者的交集，獲取腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因（ICH-MFRGs）。

1.1.3 腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因差異表達(dá)分析

下載GSE24265表達(dá)譜數(shù)據(jù)，提取ICH-MFRGs在模型組與對照組中的相對表達(dá)量，進(jìn)行獨立樣本t檢驗以鑒定各基因表達(dá)差異，采用R語言ggpolt2包進(jìn)行可視化。

1.1.4 腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因蛋白相互作用及GO、KEGG富集分析

通過 STRING（http://string-db.org）數(shù)據(jù)庫[15]，導(dǎo)入ICH-MFRGs，導(dǎo)出蛋白相互作用（PPI）信息，采用Cytoscape3.9.0[16]進(jìn)行可視化。根據(jù)節(jié)點蛋白的相互作用對應(yīng)次數(shù)的Degree值設(shè)置顏色和大小，Degree值越大顏色越紅且節(jié)點越大，Degree值越小顏色越藍(lán)且節(jié)點越小。

通過Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）平臺下載org.Hs.eg.db、clusterProfiler包[17]，org.Hs.eg.db包用于ID轉(zhuǎn)換，clusterProfiler包用于富集分析。采用R語言，以Padj<0.05且qvalue<0.2為篩選條件，對ICH-MFRGs進(jìn)行GO功能富集分析，包括生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF），以及KEGG通路富集分析，并采用ggpolt2包進(jìn)行可視化。

1.1.5 安腦平?jīng)_方藥物靶點及其干預(yù)靶點獲取

通過TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[18]、TCMID（https://47.100.169.139/tcmid/）[19]、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）[20]數(shù)據(jù)庫，以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，獲取安腦平?jīng)_方組方藥物龍骨、牡蠣、川牛膝、蒺藜、鉤藤、澤瀉、牡丹皮、梔子、黃芩、白芍、生大黃的有效組分。通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[21]數(shù)據(jù)庫，檢索各有效組分的SMILES編碼，將SMILES編碼導(dǎo)入 SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget prediction.ch/）[22]數(shù)據(jù)庫獲取潛在藥物靶點。

通過在線取交集工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），取安腦平?jīng)_方藥物靶點與ICH-MFRGs交集，獲取安腦平?jīng)_方干預(yù)腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡靶點，即干預(yù)靶點。

1.2 體內(nèi)實驗驗證

1.2.1 動物

SPF級雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量250～280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，相對濕度50%～70%，室溫22～26 ℃，自然晝夜交替，墊料隔日更換1次。動物實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會審查批準(zhǔn)（ZYFY20210427）。

1.2.2 藥物

安腦平?jīng)_方（龍骨30 g，牡蠣30 g，川牛膝15 g，蒺藜12 g，鉤藤12 g，澤瀉12 g，牡丹皮12 g，梔子12 g，黃芩12 g，白芍12 g，生大黃9 g）飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張裕民主任藥師鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。制備方法：龍骨、牡蠣先煎30 min；將除生大黃、鉤藤的其他飲片混合，浸泡2 h；共煎煮2次，第1次加水煮沸10 min后，加生大黃、鉤藤再煎10 min，倒出藥液，第2次加水煮沸30 min，倒出藥液，2次藥液混合，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，冷卻后即得安腦平?jīng)_方浸膏。以生理鹽水配制成原藥材濃度為3.0 g/mL的安腦平?jīng)_方藥液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 主要儀器與試劑

1900標(biāo)準(zhǔn)型單臂腦立體定位儀（美國KOPF公司），HM325石蠟切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司），NanoDrop One超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），DS-U3顯微成像系統(tǒng)（日本尼康公司），1658000小型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司），1703930轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司），PowerPac蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司），Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），iQ5熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司），D3024R臺式高速冷凍型微量離心機（中國DragonLab公司），EnSpire多功能酶標(biāo)儀（美國Perkinelmer公司）。

BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號70-PQ0012），SLC2A3抗體、LDHA抗體、β-actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號分別為20403-1-AP、21799-1-AP、02536-1-AP、SA00001-2），AKR1C1抗體、SLC2A1抗體（英國Abcam公司，批號分別為ab131375、ab115730），總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，批號DP419），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒（上海近岸科技有限公司，批號分別為E047、E096），SLC2A3、LDHA、AKR1C1、SLC2A1、GAPDH引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.4 造模

參照課題組前期造模方法[7]，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，用10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉滿意后經(jīng)心臟采血0.1 mL。將大鼠固定于單臂腦立體定位儀上，保持前后囟在同一水平，備皮消毒后用手術(shù)刀于前正中線上切開1 cm，暴露顱骨后于冠狀縫前1 mm，中線左側(cè)旁開3 mm處，垂直進(jìn)針6 mm，采用二次注血推針法，先勻速注血50 μL，保持進(jìn)針深度并停針5 min，再次緩慢勻速注血50 μL，停針10 min后開始推針2.0 mm，再次停針4 min，最后推針，骨蠟封閉骨窗。

1.2.5 分組及給藥

將45只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和安腦平?jīng)_方組。假手術(shù)組心臟采血時僅進(jìn)針不抽血，自體注血時僅進(jìn)針不注血。模型組和安腦平?jīng)_方組大鼠造模完成清醒后，采用Longa評分法[23]進(jìn)行評分并剔除0分和4分大鼠，實驗過程中死亡或取腦組織時未發(fā)現(xiàn)出血病理改變的大鼠予以剔除，選備用大鼠重新造模，補齊每組15只。安腦平?jīng)_方組參照前期研究最佳給藥劑量[7]，予安腦平?jīng)_方藥液15 g/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組和模型組予等體積蒸餾水灌胃，每日2次，連續(xù)7 d。

1.2.6 改良神經(jīng)功能缺損評分

分別于造模后1、3、7 d采用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）[24]評價各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況。mNSS總分為18分，綜合評價大鼠的運動試驗（提尾試驗、將大鼠放置于地板上）、感覺試驗（放置感覺、本體感覺）、平衡木試驗、反射消失和不正常運動（耳廓、角膜、驚恐、病理反射），評分越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.7 腦組織含水量測定

大鼠麻醉取血后，迅速斷頭取腦組織。將腦組織表面血液及軟腦膜清理干凈，切取左側(cè)大腦半球，取出血側(cè)腦組織放入錫箔紙上，稱量濕重。然后以錫箔紙包裹放入恒溫烘干箱中，100 ℃烘干24 h達(dá)到恒重，稱量出血側(cè)腦組織干重。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）÷濕重×100%。

1.2.8 HE染色與Nissl染色觀察腦組織皮質(zhì)區(qū)形態(tài)

大鼠麻醉取血后，迅速取腦組織。皮質(zhì)區(qū)腦組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（3 μm）、脫蠟、復(fù)水、染色（HE、Nissl染色）后，于顯微成像系統(tǒng)獲取腦組織神經(jīng)元圖像，觀察5個不同視野，采用Image J軟件計算皮質(zhì)區(qū)尼氏小體數(shù)目。

1.2.9 RT-qPCR 檢 測 腦 組 織 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達(dá)

大鼠麻醉取血后，迅速取左側(cè)出血灶腦組織皮質(zhì)。稱取腦組織50 mg，用Trizol法提取腦組織總RNA，檢測RNA濃度和純度后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板，采用SYBR Green進(jìn)行兩步法實時熒光定量PCR擴增。反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物1 μL，正、反向引物各0.5 μL，2×SYBR Green染料10 μL，無RNA酶水3.2 μL，總體積20 μL。各基因引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃反應(yīng)30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，每組使用5個生物樣本，每個樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達(dá)量。

表1 各基因PCR引物序列

1.2.10 Western blot檢測腦組織 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達(dá)

大鼠麻醉取血后，迅速取左側(cè)出血灶腦組織皮質(zhì)，沖洗后加入裂解液（裂解液∶PMSF=100∶1）低溫勻漿，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉 1.5 h，加入 SLC2A3一抗（1∶1 000）、AKR1C1一抗（1∶2 000）、LDHA一抗（1∶1 000）、SLC2A1一抗（1∶100 000）、β-actin一抗（1∶6 000），4 ℃孵育過夜；洗膜3次，10 min/次，加入山羊抗兔抗體（1∶10 000），37 ℃孵育2 h，洗膜后凝膠成像分析儀成像，采用Image J分析圖像灰度值。

1.2.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)性與方差齊性采用方差分析LSD法進(jìn)行兩兩比較，不符合正態(tài)性采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 代謝相關(guān)鐵死亡基因

通過Reactome數(shù)據(jù)庫，獲取MRGs共2 143個；整合GeneCards、FerrDb數(shù)據(jù)庫，獲取FRGs共659個。

2.2 腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因

以|log2(FC)|>1且Padj<0.05為篩選條件，獲取DEGs共776個（見圖1A），其中434個DEGs在腦出血模型中高表達(dá)，342個DEGs在腦出血模型中低表達(dá)。取DEGs、MRGs、FRGs三者的交集，獲得ICHMFRGs共15個，分別為ACADSB、AKR1C1、CAV1、 G0S2、 GCH1、 HMOX1、 LDHA、 PLIN2、PRKAA2、PSMD8、RPL8、RPLP0、SAT1、SLC2A1、SLC2A3（見圖1B）。

圖1 腦出血差異基因及腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因

2.3 腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因表達(dá)差異

為進(jìn)一步鑒定ICH-MFRGs在模型組與對照組中的表達(dá)差異，提取GSE24265芯片中基因相對表達(dá)量，進(jìn)行獨立樣本t檢驗，ACADSB、PRKAA2在腦出血后差異 低 表 達(dá) （P<0.01，P<0.05）， AKR1C1、 CAV1、G0S2、GCH1、HMOX1、LDHA、PLIN2、PSMD8、RPL8、RPLP0、SAT1、SLC2A1、SLC2A3在腦出血后差異高表達(dá)（P<0.05，P<0.01，P<0.001），見圖2。

圖2 腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因表達(dá)差異散點圖

2.4 腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因蛋白相互作用及GO、KEGG富集分析結(jié)果

腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因PPI網(wǎng)絡(luò)共有15個節(jié)點和35條邊，即15個蛋白質(zhì)之間有35組相互作用關(guān)系，相互作用關(guān)系強度由強到弱依次為LDHA、PLIN2、 SLC2A1、 HMOX1、 CAV1、 RPLP0、ACADSB、 PRKAA2、 SLC2A3、 PSMD8、 GCH1、RPL8、AKR1C1、G0S2、SAT1，見圖3。

圖3 腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因PPI網(wǎng)絡(luò)

在Padj<0.05且qvalue<0.2條件下，GO分析得到BP共66條、CC共14條、MF共10條，KEGG分析得到4條通路。對前10條GO條目、前4條KEGG通路進(jìn)行可視化，見圖4。腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因主要富集到缺氧應(yīng)激、輔酶代謝過程、細(xì)胞酮代謝過程等生物過程，在脂質(zhì)體、細(xì)胞膜、胞質(zhì)核糖體等細(xì)胞組分，發(fā)揮葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、己糖跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、輔酶結(jié)合等分子功能；介導(dǎo)HIF-1信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、鐵死亡等信號通路。

圖4 腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡基因GO、KEGG富集分析

2.5 安腦平?jīng)_方藥物靶點及其干預(yù)靶點

通 過 TCMSP、 TCMID、 ETCM、 PubChem、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索，得到安腦平?jīng)_方組方藥物有效成分分別為龍骨1個、牡蠣3個、川牛膝4個、蒺藜12個、鉤藤33個、澤瀉10個、牡丹皮11個、梔子15個，黃芩36個、白芍13個、生大黃16個，整合重復(fù)靶點后獲得安腦平?jīng)_方潛在藥物靶點共901個。將安腦平?jīng)_方潛在藥物靶點與腦出血后代謝相關(guān)鐵死亡靶點取交集，共獲得4個干預(yù)靶點，分別為SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1。

2.6 安腦平?jīng)_方對模型大鼠神經(jīng)功能缺損的影響

模型組與安腦平?jīng)_方組大鼠在造模2 h后逐漸蘇醒，均出現(xiàn)不同程度右側(cè)肢體偏癱、“追尾征”、右側(cè)傾倒等神經(jīng)功能缺損癥狀，造模成功。與假手術(shù)組比較，模型組、安腦平?jīng)_方組大鼠mNSS于造模后1、3、7 d均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，安腦平?jīng)_方組造模后1 d mNSS無明顯差異（P>0.05），神經(jīng)功能缺損癥狀未見明顯改善，造模后3、7 d mNSS均顯著降低（P<0.01），神經(jīng)功能缺損癥狀明顯改善。見表2。

表2 各組大鼠造模后不同時點mNSS比較（±s，分）

表2 各組大鼠造模后不同時點mNSS比較（±s，分）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別假手術(shù)組模型組安腦平?jīng)_方組只數(shù)15 15 15 1 d 0.00±0.00 13.07±1.10**12.87±1.41**3 d 0.00±0.00 11.87±0.99**10.13±1.19**##7 d 0.00±0.00 11.13±0.74**8.93±1.28**##

2.7 安腦平?jīng)_方對模型大鼠腦組織含水量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組、安腦平?jīng)_方組大鼠腦組織含水量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，安腦平?jīng)_方組大鼠腦組織含水量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量比較（±s，%）

表3 各組大鼠腦組織含水量比較（±s，%）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別假手術(shù)組模型組安腦平?jīng)_方組只數(shù)5 5 5腦組織含水量77.01±0.73 85.45±0.63**81.21±0.74**##

2.8 安腦平?jīng)_方對模型大鼠腦組織病理改變的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，排列致密，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核淡染，核仁清晰，無炎癥細(xì)胞浸潤、壞死、凋亡等病理反應(yīng)；模型組大鼠可見神經(jīng)細(xì)胞大片缺失、變性、腫脹，細(xì)胞間隙增大，部分可見紅細(xì)胞浸潤，散在出血，膠質(zhì)細(xì)胞及星形細(xì)胞增生、腫脹，核仁固縮且溶解；安腦平?jīng)_方組細(xì)胞水腫減輕，神經(jīng)細(xì)胞丟失較模型組大鼠減少，神經(jīng)元變性恢復(fù)，胞體形態(tài)較飽滿，仍有核固縮及空泡現(xiàn)象。見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織形態(tài)（HE染色，×400）

Nissl染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，排列緊密；模型組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常，核固縮，尼氏小體數(shù)量減少（P<0.01），多呈空泡樣變性或壞死；安腦平?jīng)_方組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較模型組好轉(zhuǎn)，尼式小體數(shù)目增多（P<0.05），核間隙變小，染色均勻。見圖6、表4。

圖6 各組大鼠腦組織形態(tài)（Nissl染色，×400）

表4 各組大鼠尼式小體數(shù)目比較（±s，個）

表4 各組大鼠尼式小體數(shù)目比較（±s，個）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別假手術(shù)組模型組安腦平?jīng)_方組只數(shù)5 5 5尼氏小體數(shù)目91.20±7.03 65.60±5.82**75.40±5.85**#

2.9 安 腦 平 沖 方 對 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組、安腦平?jīng)_方組SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達(dá)均顯著升高（P<0.01），與生物信息學(xué)結(jié)果一致；與模型組比較，安腦平?jīng)_方組SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達(dá)均顯著降低（P<0.01）。見表5。

表5 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

組別假手術(shù)組模型組安腦平?jīng)_方組只數(shù)5 5 5 SLC2A3 1.08±0.13 5.28±0.84**3.41±0.68**##AKR1C1 0.96±0.08 4.85±0.74**3.72±0.37**##LDHA 1.01±0.12 5.72±0.60**4.56±0.61**##SLC2A1 1.07±0.08 3.63±0.32**2.45±0.71**##

2.10 安 腦 平 沖 方 對 SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.01），安腦平?jīng)_方組AKR1C1蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），SLC2A3、SLC2A1升高（P<0.05），LDHA升高不明顯（P>0.05）；與模型組比較，安腦平?jīng)_方組SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.05）。見圖7、表6。

圖7 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白免疫印跡

表6 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組大鼠腦組織SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

組別假手術(shù)組模型組安腦平?jīng)_方組只數(shù)5 5 5 SLC2A3 0.78±0.10 1.29±0.13**1.04±0.16*#AKR1C1 0.62±0.11 1.04±0.11**0.84±0.10**#LDHA 0.71±0.10 1.14±0.19**0.88±0.12#SLC2A1 0.70±0.12 1.40±0.23**1.02±0.20*#

3 討論

《中國腦出血診治指南（2019）》指出，腦出血當(dāng)內(nèi)外科協(xié)同治療，內(nèi)科治療常予降壓、控制血糖、止血、神經(jīng)保護(hù)等藥物，中醫(yī)藥制劑也廣泛用于腦出血治療[25]。腦出血發(fā)生后，局部腦組織血液聚集，導(dǎo)致機體出現(xiàn)一系列復(fù)雜的病理過程，涉及血腫周圍炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡、小膠質(zhì)細(xì)胞極化等[26]，各機制交互影響，相互轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致大量神經(jīng)細(xì)胞損傷。腦出血后，血液中的血紅蛋白破裂，釋放大量鐵離子，激活活性氧（ROS）系統(tǒng)，增加神經(jīng)元攝入外源性H2O2入胞，胞質(zhì)內(nèi)H2O2與N-乙酰半胱氨酸介導(dǎo)的谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）相互拮抗，大量ROS破壞了抗氧化系統(tǒng)與ROS之間的動態(tài)平衡，增強脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[27]。Peng等[28]研究表明，中藥有效成分球豆堿能上調(diào)GPX4和谷胱甘肽還原酶的共表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡，減輕腦出血后腦損傷。

腦出血屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇[29]，正氣虧虛，陰陽失調(diào)，沖氣上逆，氣血直沖犯腦，腦脈破裂出血，沖氣上逆者，發(fā)為沖陰，尤甚者稱沖風(fēng)[30-31]。沖脈動而諸脈動，腦竅氣化不利，形神俱病，治當(dāng)平?jīng)_降逆、通調(diào)氣血。本團隊在中醫(yī)腦藏象理論指導(dǎo)下，創(chuàng)立“沖脈理論”，沖為血海，調(diào)腦之血液灌注，太沖元氣者，調(diào)之以氣機升降、髓海神明，故沖氣是腦之升降出入，循環(huán)代謝的基礎(chǔ)。出血性中風(fēng)者，肝氣上逆為重，兼合肺胃腎之氣而上逆，或肝木生火，風(fēng)火內(nèi)動，兼夾痰、瘀、毒邪上攻于腦，氣機閉阻，上擾清竅，神昏而肢癱。

基于“沖脈理論”并結(jié)合潛降鎮(zhèn)攝法，創(chuàng)制安腦平?jīng)_方，鎮(zhèn)沖、平?jīng)_、降沖協(xié)同呼應(yīng)，即對病勢，直指內(nèi)風(fēng)。方中鉤藤、蒺藜為君，蒺藜祛風(fēng)平肝疏肝，鉤藤可“開氣閉”（《本草匯言》），二藥均輕揚走竄，易達(dá)腦竅，開玄府之郁閉。臣以川牛膝補益肝腎、活血逐瘀通經(jīng)且能利尿通淋，生大黃逐瘀通經(jīng)，通宣氣機以調(diào)血脈。龍骨、牡蠣重用，平肝潛陽、重鎮(zhèn)安神，方能鎮(zhèn)沖、平?jīng)_、降沖，澤瀉利水滲濕、泄熱化濁，使內(nèi)生兼夾之邪從大小便排出；梔子、黃芩二藥合用，涼血瀉火，清肺瀉肝，牡丹皮破血行血，除血分之熱，為佐。白芍“通順血脈，緩中”（《名醫(yī)別錄》），為使藥。諸藥合用，可清利三焦、五臟同治，諸邪并治，達(dá)到潛降沖氣，通調(diào)氣血，最終使腦之氣化功能得以恢復(fù)，消除腦腑血證。

生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腦出血后15個代謝相關(guān)鐵死亡基因差異表達(dá)，其中ACADSB、PRKAA2低表達(dá)，AKR1C1、CAV1、G0S2、GCH1、HMOX1、LDHA、PLIN2、PSMD8、RPL8、RPLP0、SAT1、SLC2A1、SLC2A3高表達(dá)。腦出血代謝相關(guān)鐵死亡基因之間存在35組相互作用關(guān)系，主要富集到缺氧應(yīng)激、輔酶代謝過程、細(xì)胞酮代謝過程等生物進(jìn)程，在脂質(zhì)體、細(xì)胞膜、胞質(zhì)核糖體等細(xì)胞組分，發(fā)揮葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、己糖跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、輔酶結(jié)合等分子功能；介導(dǎo)HIF-1信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、鐵死亡等信號通路，在腦出血的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，安腦平?jīng)_方能增加超氧化物歧化酶活性，抑制丙二醛生成，上調(diào)血腫周圍腦組織GPX4、轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)Xc-、Tf、TfR蛋白表達(dá)，減輕腦出血大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，發(fā)揮腦保護(hù)作用[7，9]。為進(jìn)一步深入研究安腦平?jīng)_方抑制代謝相關(guān)鐵死亡的作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)安腦平?jīng)_方可能作用于ICH-MFRGs中的SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1靶點。Liu等[32]研究發(fā)現(xiàn)腦出血大鼠SLC2A1 mRNA過表達(dá)，早期干預(yù)可有效降低其水平，然而SLC2A3、AKR1C1、LDHA在腦出血中的相關(guān)作用尚無報道。

本研究體內(nèi)實驗證實，安腦平?jīng)_方能顯著降低大鼠腦出血后3、7 d mNSS，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，可能與其消除腦水腫，改善腦組織病理情況，增加尼氏小體數(shù)目，下調(diào) SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1 mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)。SLC2A3與SLC2A1為葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族基因，Schmidt等[33]研究發(fā)現(xiàn)，SLC2A3與SLC2A1均能維持神經(jīng)元能量供應(yīng)，且SLC2A3是神經(jīng)元能量供應(yīng)的主要調(diào)控基因，同時是機體運動、學(xué)習(xí)、記憶及進(jìn)食的主要參與者。LDHA是乳酸代謝中的關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶的2種亞型之一，主要負(fù)責(zé)將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乳酸和NAH+，研究發(fā)現(xiàn)，LDHA上調(diào)能顯著增加海馬組織中Warburg效應(yīng)，促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡[34]。AKR1C1屬于醛酮還原酶超家族基因，是人類類固醇代謝的關(guān)鍵基因，研究發(fā)現(xiàn)，AKR1C1在A549、H1975非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，沉默AKR1C1能顯著降低GPX4的表達(dá)，升高Tf、環(huán)加氧酶2的表達(dá)，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[35]。

綜上所述，安腦平?jīng)_方通過多組分下調(diào)SLC2A3、AKR1C1、LDHA、SLC2A1表達(dá)，調(diào)控代謝相關(guān)鐵死亡通路，增加腦出血大鼠腦組織尼氏小體數(shù)目，修復(fù)病理情況，消除腦水腫，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果可為安腦平?jīng)_方治療腦出血提供參考，并為中醫(yī)藥治療腦出血提供靶點依據(jù)。