白念珠菌與角質(zhì)形成細(xì)胞相互作用的研究進(jìn)展

房曉雅 楊靜

(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院皮膚性病科,太原 030001)

1 白念珠菌對角質(zhì)形成細(xì)胞的黏附和侵襲

在皮膚念珠菌病中,角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes,KC)往往是白念珠菌侵襲表皮的主要靶細(xì)胞。白念珠菌可以通過形態(tài)轉(zhuǎn)換以及表達(dá)黏附素和侵襲素與KC黏附或相互作用,通過分泌相關(guān)的蛋白酶直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),或通過與宿主細(xì)胞表面相關(guān)配體結(jié)合誘導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞損傷KC。

1.1 磷酸甘油酸突變酶1 (phosphoglycerate mutase 1,Gpm1)

Gpm1作為一種真菌黏附素,介導(dǎo)了真菌的免疫逃逸、黏附、侵襲和定植。Gpm1在于真菌的表面及其胞質(zhì)中,可以與補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)因子H因子/H因子結(jié)合樣蛋白1(FHL1)結(jié)合介導(dǎo)補(bǔ)體C3b的降解。Gpm1還可與纖溶酶原結(jié)合,在尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPa)作用下,激活的纖溶酶降解宿主細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和補(bǔ)體C3b,有助于白念珠菌免疫逃逸[1]。

Crisanto等[2]通過研究發(fā)現(xiàn)Gpm1存在于白念珠菌的表面,且參與白念珠菌與KC和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過程。通過對人體細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分析鑒定找到了其配體——玻連蛋白(vitronectin),二者呈劑量依賴性結(jié)合。玻連蛋白存在于KC的表面,是細(xì)胞外基質(zhì)的一個組成部分,同時也是末端補(bǔ)體通路的調(diào)節(jié)因子。Gpm1與KC的黏附是白念珠菌向深層組織侵襲的前提。gpm1Δ/Δ突變菌株與KC的黏附系數(shù)明顯降低。

1.2 抗原6(antigen 6)

A型白念珠菌(C.albicansA)具有一種特定的抗原,抗原6,它存在于A型白念珠菌細(xì)胞壁的甘露聚糖中[3]。早期研究發(fā)現(xiàn),A型念珠菌細(xì)胞壁甘露聚糖特異性側(cè)鏈即抗原6,可以介導(dǎo)其與人口腔頰黏膜上皮細(xì)胞的黏附。隨后Bramono等[4]用單克隆抗體6篩選抗原6缺陷突變菌株(MY4-24)以及抗原6陽性的親本菌株(MI012R)通過與人KC共孵育,用掃描電鏡觀察A型念珠菌細(xì)胞壁的抗原6對KC的黏附作用。研究表明,抗原6缺陷突變株的黏附率明顯低于抗原6陽性的親本菌株,表明人KC表面存在與A型念珠菌抗原6結(jié)合的相關(guān)受體。

1.3 整合素樣蛋白

白念珠菌的整合素樣蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上都與人的β2整合素的α亞基相似(αM和αX,分別被稱為CD11b和CD11c)[5]。整合素可以識別Arg-Gly-Asp(RGD)序列;白念珠菌的整合素樣蛋白結(jié)構(gòu)與白細(xì)胞黏附糖蛋白(β2整合素)結(jié)構(gòu)不同,除了其α亞基可以識別RGD序列外,其自身也含有RGD序列。白念珠菌表面的整合素樣蛋白通過識別上皮細(xì)胞合成的iC3b分子中的RGD序列介導(dǎo)黏附[6]。 Ollert等[7]通過將白念珠菌分別與多種衍生的含有RGD序列的合成肽以及KC共孵育,合成的多肽RGD和RGDS沒有顯示出任何抑制作用,僅用PepTite-2000觀察到較為顯著的抑制作用。

1.4 分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartic proteinase,Saps)

Saps是白念珠菌分泌的一系列蛋白水解酶,由10個成員組成,Sap1-10[8],在黏附和侵襲宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著重要作用。Sap1-8經(jīng)白念珠菌分泌釋放到周圍的介質(zhì)中,而Sap9和Sap10都有典型的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)蛋白質(zhì)C末端共同序列,可與細(xì)胞表面結(jié)合[9-10]。

早期研究中發(fā)現(xiàn)白念珠菌分泌的Sap1-3在皮膚黏膜的感染過程中有顯著作用,盡管白念珠菌感染皮膚和口腔黏膜的過程中都表達(dá)了相同的SAP,但表達(dá)的順序在黏附和侵襲過程中有所不同。Schaller等[11]通過重組人上皮的口腔念珠菌病體外模型和應(yīng)用RT-PCR,展示出白念珠菌感染口腔黏膜過程中SAP基因表達(dá)的先后順序(SAP1和SAP3>SAP6>SAP2和SAP8)。隨后通過菌株SC5314感染重組人表皮的皮膚念珠菌病體外模型中觀察到SAP1和SAP2、SAP8、SAP6、SAP3[12]在皮膚念珠菌感染過程中的進(jìn)行性表達(dá)。起初觀察到淺表KC的病理變化的同時,檢測到SAP1和SAP2的表達(dá)。當(dāng)白念珠菌向角質(zhì)層深部侵襲伴隨SAP8的表達(dá)。隨后當(dāng)白念珠菌進(jìn)入棘層和顆粒層并伴隨芽管的生成時,可檢測到SAP6的表達(dá)。Δsap1和Δsap2突變菌株與親本菌株SC5314的感染相比,兩種突變體對組織的損傷顯著降低。同樣,在該模型中使用特異性天冬氨酸蛋白酶抑制劑胃抑素A(pepstatin A)后,白念珠菌對KC的黏附和損傷程度大大降低[7],證實(shí)了Saps對皮膚損傷的重要作用。

1.5 溶細(xì)胞肽毒素(candidalysin)

近年來對于白念珠菌的毒力因子的廣泛研究證實(shí)了白念珠菌可以分泌一種溶細(xì)胞肽毒素,這是一種菌絲衍生的肽毒素,可以直接損傷宿主細(xì)胞,并通過雙相MAPK調(diào)節(jié)激活宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)[13]。溶細(xì)胞肽毒素由菌絲形成相關(guān)基因ECEP1編碼, Ece1p被Kex2p[14]和Kex1p(二者均為存在于高爾基體中的蛋白酶)加工為成熟的溶細(xì)胞肽毒素。隨后驗(yàn)證Ece1-III62-93K是Ece1p的活性區(qū)域,Ece1-III濃度累積到一定程度,可與細(xì)胞膜相互作用,形成孔狀結(jié)構(gòu),引發(fā)細(xì)胞膜損傷以及鈣離子內(nèi)流,直接損傷宿主細(xì)胞。在小鼠口咽念珠菌病模型中,感染白念珠菌野生型或ECE1再整合(ece1Δ/Δ+ECE1)菌株的小鼠與ece1Δ/Δ小鼠相比,病理切片所顯示的白念珠菌的菌絲的侵襲以及組織損傷和中性粒細(xì)胞的浸潤更加顯著[15]。溶細(xì)胞肽毒素可誘導(dǎo)p-MKP1、c-Fos、細(xì)胞因子IL-1α和IL-6的產(chǎn)生以及上皮細(xì)胞損傷。Rebecca等[16]發(fā)現(xiàn)在皮膚真菌感染期間,皮膚KC中誘導(dǎo)了類似的效應(yīng)反應(yīng),包括MAPK、MKP1、c-Fos、促炎基因和細(xì)胞因子的表達(dá)。但溶細(xì)胞肽毒素與皮膚KC的相互作用尚未具體闡明,仍需進(jìn)一步的研究和探討。

1.6 糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAGs)

糖胺聚糖是由重復(fù)二糖單元構(gòu)成的大線性多糖,含有氨基糖和糖醛酸。近來研究發(fā)現(xiàn)糖胺聚糖可與多種細(xì)胞因子及相關(guān)酶相互作用,參與致病菌與細(xì)胞的黏附、炎癥反應(yīng)等[17]。Ordiales等[18]通過研究證實(shí)了GAGs參與了白念珠菌與KC黏附。羅丹明B可以抑制GAGs的合成,酵母相和菌絲相的白念珠菌與使用羅丹明B處理后的KC的黏附系數(shù)均顯著降低。硫酸肝素(HS)和硫酸軟骨素(CS) 作為結(jié)構(gòu)不同的兩種GAGs對于白念珠菌的黏附作用也不同。用肝素酶I和III處理KC后,白念珠菌對KC的黏附反而增加。用硫酸軟骨素裂解酶(ABC)酶解CS的效果則相反：酵母相和菌絲相的白念珠菌對KC的黏附均顯著降低。對此猜測KC表面不同種類的GAGs可能以合作的方式參與白念珠菌與細(xì)胞的黏附,另外,GAGs的降解可能有利于白念珠菌與另一類細(xì)胞表面受體結(jié)合。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn),白念珠菌和表皮及真皮的細(xì)胞相互作用可調(diào)節(jié)參與HS和CS生物合成的基因的變化：在KC中CHPF出現(xiàn)下調(diào),而在成纖維細(xì)胞中EXT1、EXT2、CHSY3和CHPF下調(diào)[19]。相關(guān)研究為抗白念珠菌黏附的發(fā)展開辟了新的途徑。

2 KC抗白念珠菌的免疫調(diào)節(jié)

在皮膚念珠菌病中,KC是組成表皮主要的細(xì)胞,構(gòu)成了抗念珠菌感染的一道重要防線。近年來多項(xiàng)研究表明,KC具有免疫細(xì)胞的功能。KC可表達(dá)模式識別受體(PRPs)與念珠菌表達(dá)的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs),如白念珠菌細(xì)胞壁中的β-葡聚糖,甘露聚糖等成分,二者相互作用進(jìn)而激活宿主固有免疫反應(yīng)。此外,KC也可產(chǎn)生趨化因子誘導(dǎo)特異性免疫。

2.1 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase,iNOS)

NO是一種氧自由基,在人體各組織中均可生成并發(fā)揮作用,同樣在皮膚的先天免疫也起重要作用,NO不僅可以殺死病原體(如細(xì)菌、真菌等),還可以調(diào)節(jié)KC的遷移并促進(jìn)皮膚傷口愈合[20]。iNOS產(chǎn)生的NO 主要有殺死病原體的非特異性免疫作用,細(xì)菌感染可增加iNOS表達(dá)和NO生成[21]。研究表明生理狀態(tài)下的KC即可表達(dá)較低水平的iNOS并產(chǎn)生NO[22-23],體外將白念珠菌與KC共孵育可上調(diào)iNOS mRNA和NO的生成,使用 L-NAME抑制iNOS,則KC對白念珠菌的殺傷作用大大降低,提示NO介導(dǎo)了KC殺死白念珠菌[24]。除此之外,NO通過cGMP/PKG-Rho GTP酶途徑介導(dǎo)HaCaT細(xì)胞遷移[20],促進(jìn)受損皮膚的修復(fù),iNOS基因缺失的小鼠皮膚傷口的修復(fù)和愈合延遲[25]。綜上,iNOS釋放NO不僅可以直接殺死白念珠菌,還可以通過促進(jìn)KC的遷移加快皮膚念珠菌病皮損處的愈合。

2.2 抗菌肽(anti-microbial peptides,AMPs)

宿主在抵抗病原微生物入侵的過程中可產(chǎn)生抗菌肽, 由KC分泌的相關(guān)抗菌肽不僅可以直接殺死入侵的白念珠菌發(fā)揮天然免疫效應(yīng),還可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子,趨化因子以及促炎因子發(fā)揮特異性免疫作用。其中β-防御素是在皮膚免疫中最主要的抗菌肽[26-27]。人類β-防御素(human beta-defensin,HBD)是一種富含半胱氨酸,低分子量的陽離子多肽。Rozina[28]等驗(yàn)證了正常人類皮膚KC可以表達(dá)HBD-2,白念珠菌感染KC后可檢測到hBD-2 mRNA的表達(dá)增加,且白念珠菌菌絲相誘導(dǎo)hBD mRNA上調(diào)的作用強(qiáng)于酵母相[29-30]。先前研究表明HBD通過影響白念珠菌細(xì)胞膜的通透性及其穩(wěn)態(tài)進(jìn)而起到直接殺傷作用,且該殺菌作用具有鹽敏感性,殺傷作用隨細(xì)胞外鹽濃度的升高而降低[31]。其中HBD-2和HBD-3對于白念珠菌有較強(qiáng)的殺傷作用,HBD-3殺傷作用更強(qiáng)約為HBD-2的10倍[32]。但隨后Slavena等[31]通過測定熒光染料鈣黃綠素的釋放量,檢測hBD-2和hBD-3誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞膜損傷的能力發(fā)現(xiàn)HBD不會引起明顯的膜破壞和膜失穩(wěn)。因此推測先前報道的細(xì)胞膜損傷可能是與防御素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡相關(guān)的次要效應(yīng)。近期研究證實(shí)白念珠菌細(xì)胞壁成分磷酸甘露聚糖可以通過TLR2-NF-κB,p38MAPK 信號通路產(chǎn)生HBD-2,HBD-3參與皮膚抗白念珠菌免疫反應(yīng)[33]。除了直接殺傷作用外,HBD-2通過與細(xì)胞表面趨化因子受體6(CCR6)相互作用,趨化樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞至感染部位,發(fā)揮特異性免疫作用[34]。

2.3 模式識別受體(PRPs)

甘露糖結(jié)合受體(mannose receptor,MR) 甘露聚糖是白念珠菌細(xì)胞壁的成分之一,也是皮膚免疫系統(tǒng)可識別的一種重要的病原體相關(guān)分子模式。甘露糖受體是一種C 型凝集素受體( C-type lectins receptor,CLRs),具有3個胞外結(jié)構(gòu)域可以識別多種內(nèi)源性和外源性配體,其中8個串聯(lián)的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CLTD)可以識別病原體的相關(guān)分子模式,如白念珠菌細(xì)胞壁的甘露聚糖、細(xì)菌的脂多糖等[35-36]。MR主要是在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DC 表達(dá)等免疫細(xì)胞中表達(dá),且早期研究驗(yàn)證了巨噬細(xì)胞甘露糖受體(MMR)對白念珠菌具有吞噬和殺傷作用,該作用可在IFN-γ的刺激下增強(qiáng)[37]。隨后Szolnoky等[38]利用甘露糖親和層析法從KC中分離出一種甘露糖結(jié)合受體,驗(yàn)證了KC表面存在甘露糖結(jié)合受體(KcMR)并可介導(dǎo)KC殺傷白念珠菌。KcMR對白念珠菌的殺傷作用可被甘露聚糖和甘露糖基化的牛血清白蛋白(Man-BSA)抑制。KcMR除了介導(dǎo)對白念珠菌直接的殺傷作用,還可以通過誘導(dǎo)HBD-2產(chǎn)生介導(dǎo)對白念珠菌的間接殺傷作用[39]。

Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs) TLRs作為一種重要的模式識別受體,在人體的固有免疫和特異性免疫中發(fā)揮著重要作用。目前已知的人類的TLRs家族共有11個成員,Lebre等人發(fā)現(xiàn)KC構(gòu)成性地表達(dá)TLR1、2、3、4、5、6、9和10mRNA,而不表達(dá)TLR7和8[40-44]。TLRs通過與相應(yīng)的配體結(jié)合激活信號通路MyD88(髓樣分化因子受體88)-I-RAKs(IL-1受體相關(guān)激酶家族)-TRAF6(TNF受體相關(guān)因子6)- NF-κB(或AP-1),使NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子和趨化因子。其中TLR4除了使用MyD88外,還使用一種稱為β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFN-β, TRIF)的適配器分子來啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[45]。

早期研究發(fā)現(xiàn)TLR2可以識別白念珠菌的磷脂甘露聚糖[46],TLR4可以識別O-連接甘露聚糖[47]。Pivarcsi等[48]證實(shí)白念珠菌可通過與TLR2或TLR4結(jié)合,激活KC的NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移。NF-κB是IL-8的重要調(diào)控因子,白念珠菌通過激活NF-κB誘導(dǎo)IL-8表達(dá)上調(diào),不僅可以將血液中的白細(xì)胞募集至皮膚參與免疫反應(yīng),IL-8還增加了KC對念珠菌的殺傷活性。但該作用似乎并不依賴于KC中的TLR,而是依賴于NF-κB?？筎LR的抗體與KC預(yù)孵育并不能有效降低IL-8的表達(dá),但使用柳氮磺胺吡啶抑制NF-κB,KC對白念珠菌殺傷作用大大降低。雖然抗TLR并不能抑制白念珠菌誘導(dǎo)的IL-8的上調(diào),但TLR2抗體和TLR4抗體可抑制KC的念珠菌殺傷能力,因此推測百念珠菌誘導(dǎo)的KC中IL-8表達(dá)上調(diào)和KC殺死白念珠菌是通過不同的途徑介導(dǎo)的。

2.4 其他

除了上述所提及的各類抗菌肽以及模式識別受體外,KC還具有直接的殺念珠菌活性,可以通過紫外線[49-50]、IL-1[51]、IL-8和α-黑色素細(xì)胞刺激素[52]增加其活性。IL-1、前列腺素E2和血小板活化因子也已被證明參與了人表皮細(xì)胞對念珠菌的殺傷[53],但其殺傷機(jī)制尚不清楚。

3 小 結(jié)

白念珠菌作為條件致病真菌廣泛存在于正常人的皮膚、口腔、胃腸道、生殖道黏膜。由于長期濫用廣譜抗生素以及免疫抑制劑等,各種原因引起的皮膚黏膜屏障的損傷,或免疫功能下降而引發(fā)念珠菌病。盡管當(dāng)前對于白念珠菌的致病因子及其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)研究已經(jīng)取得一定成果,但白念珠菌感染KC的相關(guān)靶點(diǎn)以及毒力因子研究仍有待進(jìn)一步的發(fā)掘,KC所介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。