耳念珠菌感染治療的研究進(jìn)展

侯千姍 張大志 閻瀾

(海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院,上海 200433)

耳念珠菌(Candidaauris)是近二十年來發(fā)現(xiàn)的一種新型念珠菌,因其對(duì)四大類抗真菌藥物的多重耐藥性和較高致死率而被稱為“超級(jí)真菌”,并成為第1個(gè)被世界衛(wèi)生組織列為“全球公共健康威脅”的真菌。它曾在國(guó)外引起多次爆發(fā)性流行感染,在我國(guó)于2018年被首次報(bào)道[1]。本文從耳念珠菌的感染流行病學(xué)、生物學(xué)特性等方面入手,著重論述其治療藥物和耐藥機(jī)制,并對(duì)我國(guó)近5年耳念珠菌的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

1 耳念珠菌感染的流行病學(xué)概況

耳念珠菌自1996年在韓國(guó)首次出現(xiàn)[2]、2009年在日本首次被鑒定和報(bào)道[3]以來,截止2021年12月31日,全球除南極洲之外的六大洲,共計(jì)47個(gè)國(guó)家報(bào)道了耳念珠菌感染病例[4],其在美國(guó)、印度等國(guó)較為頻發(fā)。全球部分耳念珠菌感染情況見表1。

經(jīng)跨國(guó)研究分析,多數(shù)感染者進(jìn)行過開放性手術(shù),接觸過留置體內(nèi)的器械,進(jìn)入過特護(hù)病房[7],接受過抗真菌藥物的治療。據(jù)調(diào)查顯示,耳念珠菌感染患者的死亡率為30%～60%[8],但多數(shù)患者均患有各類嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病,不能排除此類因素導(dǎo)致死亡的可能性。

2 耳念珠菌的生物學(xué)特性

2.1 外形特征

耳念珠菌為子囊菌亞門新種酵母,單個(gè)細(xì)胞直徑約5 μm。其形狀可隨溫度的變化而改變,多數(shù)在25 ℃、37 ℃時(shí)呈卵圓形,40 ℃時(shí)呈圓形[1]。耳念珠菌可為多核細(xì)胞,從而具有分化為菌絲的潛力[9]。

2.2 培養(yǎng)特點(diǎn)

耳念珠菌可生長(zhǎng)于沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)[10]和酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)[10],在某些極端條件下也可生長(zhǎng),如50%的葡萄糖溶液或10%氯化鈉和5%葡萄糖的混合溶液[3],其耐鹽性較強(qiáng)。耳念珠菌在pH為2～10的條件下均可生長(zhǎng),所適應(yīng)的酸堿性較為廣泛,最適pH為5～7[10],最適生長(zhǎng)溫度為37～40 ℃[3]。培養(yǎng)過程中,耳念珠菌不產(chǎn)生淀粉,無尿素酶活性[3],即無法利用尿素供能。

念珠菌的重要特征之一是形態(tài)可塑性。耳念珠菌存在3種不同的細(xì)胞形態(tài),為典型酵母態(tài)、成絲能力酵母態(tài)(filamentation-competent yeast, FC)和菌絲態(tài)。在小鼠體內(nèi)培養(yǎng)時(shí),耳念珠菌呈菌絲態(tài),提取至體外后在30 ℃生長(zhǎng)2 d,在25 ℃生長(zhǎng)5 d,可轉(zhuǎn)化為毒性較小的酵母態(tài)[11]。

3 耳念珠菌感染的治療藥物

現(xiàn)今,用于真菌感染的治療藥物主要是唑類、多烯類、棘白菌素類、核苷類似物。下文對(duì)這4種藥物及其他可能的治療方法展開分析。

表1 部分耳念珠菌感染情況[5-7]

3.1 唑類藥物

唑類藥物分為咪唑類和三唑類,可抑制羊毛甾醇14-α-去甲基酶基因(ERG11基因)的表達(dá),從而限制麥角甾醇的生物合成[12-13]。氟康唑是最為廣泛使用的三唑類抗真菌處方藥,約90%[14]耳念珠菌都對(duì)其具有耐藥性,最低抑菌濃度(MIC)超過64 μg/mL[15]。

ERG11基因突變是耳念珠菌的耐藥性產(chǎn)生的重要原因,常見突變位點(diǎn)有Y132F、K143R、F126L。這3種突變的發(fā)生具有一定的地域性,Y132F多發(fā)于委內(nèi)瑞拉,K143R常見于印度和巴基斯坦,F126L則在南非較為普遍[16]。3種突變各有其不同的作用機(jī)制。Y132位于羊毛甾醇14-α-脫甲基酶的催化面,因此Y132F突變導(dǎo)致氟康唑和Erg11p不能正常識(shí)別與結(jié)合。原血紅素(heme)可能參與P450還原酶的作用過程,而K143在DNA上位于原血紅素基因附近,K143R突變可能影響原血紅素的催化效率。F126殘基位于配體通道蛋白附近,修飾該殘基會(huì)干擾甾醇脫甲基酶抑制劑進(jìn)入胞內(nèi)。當(dāng)發(fā)生F126L突變,通道蛋白作用異常,甾醇脫甲基酶受到抑制,于是麥角甾醇的濃度降低[13]。對(duì)于白念珠菌,ERG11的過表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致耐藥[17],在耳念珠菌中是否有此效果,仍有待研究。艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑會(huì)和甾醇脫甲基酶的其他殘基結(jié)合,不受以上3種基因突變的影響,因此可作為治療耳念珠菌的一種選擇[13]。

第二,真菌細(xì)胞膜上外排泵的過表達(dá)也是耳念珠菌對(duì)唑類產(chǎn)生耐藥性的原因之一。主要的外排泵有ATP結(jié)合盒基因超家族(ABC)和易化擴(kuò)散載體超家族(MFS)。CDR1和CDR2的表達(dá)產(chǎn)物同屬于ABC,敲除CDR1基因會(huì)導(dǎo)致耳念珠菌耐藥性減弱4～8倍,敲除CDR2基因則影響較小[18]。轉(zhuǎn)錄因子 Tac1在耳念珠菌中以兩個(gè)串聯(lián)的副本(two tandem copies)形式出現(xiàn),可以抑制CDR1和CDR2基因的高表達(dá)[19],從而增強(qiáng)耐藥性。

第三,Hsp90在細(xì)胞對(duì)藥物的應(yīng)激反應(yīng)中可以穩(wěn)定關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子——鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶[20],從而抑制白念珠菌和耳念珠菌從酵母態(tài)轉(zhuǎn)化為菌絲態(tài),同時(shí)抑制麥角甾醇的合成,使耐藥性加強(qiáng)[21]。

此外,耳念珠菌的生物被膜可使其具有短期的耐藥性。生物被膜是附著在有機(jī)體表面的一層微生物群體,包含多種大分子,具有較強(qiáng)的免疫防御作用。在生物被膜形成后,4 h內(nèi)咪康唑?qū)Χ钪榫腗IC升高16倍(從1 μg/mL至16 μg/mL),12 h內(nèi)升高64倍(從1 μg/mL至64 μg/mL)[22]。

3.2 多烯類藥物

據(jù)統(tǒng)計(jì)[14],有30%的耳念珠菌對(duì)多烯類藥物敏感度較低。多烯類藥物可以在細(xì)胞膜外形成聚合物,與磷脂雙分子層中的麥角甾醇結(jié)合,在細(xì)胞膜上形成親水通道,破壞真菌的細(xì)胞膜,導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)容物外泄[14,23]。兩性霉素B為典型的多烯類藥物。

耳念珠菌對(duì)多烯類的耐藥主要存在以下幾種相關(guān)因素：

第一,在麥角甾醇生物合成通路上,多數(shù)具有耐藥性的耳念珠菌存在5個(gè)基因的過表達(dá),分別是MVD、ERG1、ERG2、ERG6、ERG13。它們的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)改變細(xì)胞膜中甾醇的組分,從而影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[19]。

第二,單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性,是可遺傳變異中最常見的一種。耳念珠菌中部分SNP與兩性霉素B耐藥性有極大關(guān)聯(lián),存在于下列5個(gè)基因座(genome loci)：utg4_968953(T/C)、utg5_821828(C/T)、utg4_160118(G/A)、utg4_352365(G/A)、utg3_385439(G/A)。其中,utg5_821828(C/T)突變使轉(zhuǎn)運(yùn)因子上的絲氨酸變?yōu)樘於０?utg4_968953 (T/C)突變使膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上的異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸[24],另外3種突變機(jī)制未明。

耳念珠菌的生物被膜也有抵抗兩性霉素B的作用,可使得兩性霉素B對(duì)耳念珠菌的MIC在生物被膜成熟后12 h增大1倍(從2 μg/mL至4 μg/mL),24 h后不再增加[22]。

3.3 棘白菌素類藥物

棘白菌素類是(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶抑制劑類的抗真菌藥,包括卡泊芬凈、米卡芬凈、阿尼芬凈等。全球范圍內(nèi),對(duì)棘白菌素類具有耐藥性的耳念珠菌約占3.8%[25],在美國(guó)發(fā)現(xiàn)的所有耳念珠菌均對(duì)米卡芬凈敏感[26]。因此,棘白菌素類已成為現(xiàn)階段針對(duì)此類疾病的一線藥物。

由于研究樣本偏少,關(guān)于耳念珠菌對(duì)棘白菌素類的耐藥機(jī)制,各方研究者說法較為統(tǒng)一。FKS屬于(1,3)-β-葡聚糖合成酶基因家族,對(duì)維持真菌細(xì)胞壁有重要作用。多數(shù)念珠菌對(duì)棘白菌素類的耐藥性來源于FKS的突變,其破壞酶和藥物的正常結(jié)合。據(jù)報(bào)道,有5種FKS的突變通過基因檢測(cè)被識(shí)別鑒定,分別是F635Y[27]、R1354S[27]、F635L[27]、S639F[27-28]、S639P[25],前兩者在小鼠體內(nèi)引起較為顯著的耐藥性,F635L、S639F的效果中等[29]。與耐藥性相關(guān)的突變存在2段高發(fā)區(qū)域(HS1、HS2),在HS1內(nèi)的S636(相當(dāng)于白念珠菌的S645)處發(fā)生的突變產(chǎn)生的耐藥性最強(qiáng)[25]。

此外,研究表明卡泊芬凈也可導(dǎo)致外泌體(extracellular vesicle,EV)的增多。EV介導(dǎo)RNA在真菌細(xì)胞間的交流,比如不同株隱球菌間可發(fā)生毒性的傳遞轉(zhuǎn)移[28]。這是否會(huì)成為新型藥物研究的突破點(diǎn),仍待更多探索。

3.4 核苷類似物

目前有關(guān)核苷類藥物的抗真菌作用研究較少,主要是5-氟胞嘧啶(5-flucytosine, 5-FC)應(yīng)用于念珠菌和隱球菌的臨床治療。已知基因FCY2、FCY1、FUR1與5-FC的吸收和轉(zhuǎn)化過程相關(guān),其突變可引起耳念珠菌耐藥[30]。另有研究也證實(shí)FUR1基因的突變可引發(fā)耳念珠菌對(duì)5-FC產(chǎn)生耐藥性,發(fā)生F211I氨基酸替換[14,31],引起苯丙氨酸變?yōu)楫惲涟彼醄31]。此外,敲除CgFPS1基因和CgFPS2基因會(huì)引起光滑念珠菌對(duì)5-FC的敏感度上升[30]。真菌對(duì)5-FC的耐藥性可以在用藥后迅速形成,這使得5-FC多數(shù)時(shí)候參與兩性霉素B、三唑類的聯(lián)合用藥,很少單獨(dú)施加[30]。

3.5 其他藥物

對(duì)于耳念珠菌感染的治療,許多新型藥物正處于研發(fā)當(dāng)中。比如葡聚酶合成酶抑制劑Ibrexafungerp(SCY-078)[29]、糖基磷脂酰肌醇的合成抑制劑Fosmanogepix(APX001)[32]等。

4 我國(guó)近五年耳念珠菌相關(guān)的研究(2018—2022)

4.1 流行病學(xué)

2018年,北京大學(xué)人民醫(yī)院對(duì)1名患有高血壓和腎病綜合征的76歲女性進(jìn)行肺泡灌洗術(shù),在其肺泡灌洗液中檢測(cè)到耳念珠菌的存在。這是耳念珠菌首次在中國(guó)境內(nèi)出現(xiàn)。此菌株被命名為BJCA001,它具有多種表現(xiàn)型,對(duì)氟康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈、CuSO4均敏感,其毒性在蠟螟和小鼠的體內(nèi)弱于白念珠菌[1]。同年,沈陽(yáng)報(bào)道15名耳念珠菌感染病例[33]。2018年6月,北京再次報(bào)道2名耳念珠菌感染病例,發(fā)現(xiàn)它們與來自沈陽(yáng)的耳念珠菌高度相似[34]。此后,我國(guó)又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多起耳念珠菌的感染病例。2021年,北京將最新發(fā)現(xiàn)的耳念珠菌命名為BJCA002,與BJCA001進(jìn)行生物學(xué)和基因組的對(duì)比研究[35]。2021年,香港報(bào)道19名耳念珠菌感染病例,并對(duì)檢測(cè)到的耳念珠菌進(jìn)行基因測(cè)序,發(fā)現(xiàn)多處基因突變,部分突變與之前的報(bào)道吻合[33]。2022年,廈門也檢測(cè)出1名耳念珠菌感染者[36]。除2018年發(fā)現(xiàn)的BJCA001屬于南亞支之外,我國(guó)所有耳念珠菌均屬于南非支[36-37],他們?cè)诙玖σ蜃?、藥敏分析等方面具有顯著差異[36]。在中國(guó),耳念珠菌多見于北方,正逐漸向南方擴(kuò)散,并且約有86.11%[38]的菌株具有多種感染類型。

4.2 耳念珠菌鑒定

近5年,我國(guó)嘗試多種方式,提升鑒定耳念珠菌及其他念珠菌的準(zhǔn)確性。在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室中,耳念珠菌、希木龍念珠菌(Candidahaemulonii)、擬黑馬朗念珠菌(Candidaduobushaemulonii)難以區(qū)分。Autof MS 1000和Vitek MS是兩種飛行質(zhì)譜儀系統(tǒng)(MALDI-TOF system),它們對(duì)耳念珠菌的識(shí)別準(zhǔn)確率高達(dá)100%。但總體而言,Autof MS 1000比Vitek MS準(zhǔn)確率更高,尤其是在罕見微生物的識(shí)別方面[39]。MALDI-TOF MS可以鑒別耳念珠菌和克柔念珠菌,其中識(shí)別耳念珠菌的正確率達(dá)89.28%[40]。API ID 32 C系統(tǒng)[41]、CHROMagarCandidaPlus顯色培養(yǎng)基[42]、新型多重終點(diǎn)PCR[43]、新型多路實(shí)時(shí)定量PCR[44]均可用于鑒別耳念珠菌,且保持極高準(zhǔn)確率。通過等位基因特異性分子信標(biāo)和按照不對(duì)稱PCR的DNA曲線分析,可以完成一個(gè)雙聯(lián)ERG11實(shí)驗(yàn)和一個(gè)單一FKS1HS1實(shí)驗(yàn),從而在2 h內(nèi),識(shí)別出最顯著的耐藥相關(guān)突變基因,正確率達(dá)100%[45]。

4.3 耐藥機(jī)制探究

在基因方面的研究中,我國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種因素可導(dǎo)致耳念珠菌的耐藥性。轉(zhuǎn)錄分析表明,相比敏感型耳念珠菌,耐藥型有453個(gè)基因活性下降,541個(gè)基因表達(dá)上調(diào),包括麥角甾醇外排泵合成基因、Hsp相關(guān)基因等[46]?；驕y(cè)序發(fā)現(xiàn)多處新型突變,比如在ERG11基因上發(fā)生Y501H、I466M突變,在ERG10基因上發(fā)生R278H突變,這些突變與耳念珠菌對(duì)氟康唑、米卡芬凈、兩性霉素B的耐藥性相關(guān)[47]。在耳念珠菌的菌絲態(tài)中存在一種突變,可以導(dǎo)致較長(zhǎng)的非編碼RNA的斷裂,它輔助耳念珠菌完成和抗真菌藥、H2O2等的反應(yīng),對(duì)維持耳念珠菌的毒性至關(guān)重要[48]。在部分對(duì)氟康唑具有耐藥性的耳念珠菌內(nèi),還可以檢測(cè)出一條額外的染色體V,它可導(dǎo)致大量耐藥相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)[49]。

4.4 治療方法

我國(guó)學(xué)者研究多種藥物使用方法治療耳念珠菌,發(fā)現(xiàn)唑類與某些藥物的結(jié)合可以使其效力增強(qiáng),如同時(shí)施加氯已定和氟康唑[50]、唑類和AZD8055[51]或磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole)、伏立康唑和伊曲康唑[52]等。蒿甲醚可以擾亂外排泵Pdr5p的作用,使氟康唑在胞內(nèi)累積,因此蒿甲醚與氟康唑聯(lián)合用藥對(duì)耳念珠菌具有較強(qiáng)的抑制作用[53]。在體外,米諾環(huán)素單獨(dú)用藥可以殺死80%的耳念珠菌,結(jié)合唑類藥物后也有良好的抑菌效果。相同試劑在體內(nèi)施加,效果卻大幅度下降[54]。2020年,我國(guó)成為世界首個(gè)檢測(cè)米替福斯對(duì)耳念珠菌的作用的國(guó)家,發(fā)現(xiàn)米替福斯和兩性霉素B聯(lián)合用藥可以使得耳念珠菌對(duì)兩性霉素B的MIC顯著減小[55]。

此外,我國(guó)報(bào)道自組裝的蛋白磷脂體系統(tǒng)可以純化并表達(dá)來自耳念珠菌的重組交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)。AOX促進(jìn)真菌耐藥性的產(chǎn)生,但在人體中并不存在,因而成為一個(gè)理想的治療靶點(diǎn)[56]。光動(dòng)力可以使耳念珠菌的生物膜失活,因此抗微生物光動(dòng)力療法(antimicrobial photodynamic therapy)也成為可能的治療手段之一。

5 小 結(jié)

耳念珠菌是一種是多重耐藥菌株,基因突變頻發(fā),致死率高,帶給世界全新挑戰(zhàn)。然而,現(xiàn)在用于治療耳念珠菌的藥物仍然比較局限和傳統(tǒng),免疫抑制藥物、廣譜類抗真菌藥的使用可能導(dǎo)致耳念珠菌感染的加重,更多新型治療手段亟須研發(fā)。目前,耳念珠菌在中國(guó)的感染病例正在逐年增多,但無聚發(fā)性感染,雖不必受美國(guó)、印度等主要流行地區(qū)的恐慌所影響,但是仍需警惕,防患于未然。